专利名称：：一种用于诊断肝癌的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物技术和免疫学领域，具体涉及检测肝癌标记物硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)的抗体、试剂盒以及它们的用途。
背景技术：
：原发性肝癌是全球第6位、中国第3位最常见的癌症。据国际癌症研究中心(IARC)估计，2000年全球肝癌发病数为56.4万人，其中约55%发生在中国，即中国肝癌发病30.6万人，肝癌死亡30.0万，占我国居民肿瘤死亡的第二位。肝癌出现症状时多属中晚期，切除后复发、转移率高。因此，肝癌的早期诊断对延长患者的生存时间和降低肝癌死亡率具有重要意义。目前，影像学诊断、细胞与组织学诊断及化学诊断是肿瘤诊断的三大主要方法。影像学诊断在肝癌诊断中起重要的作用，但是在诊断小肝癌及区分良恶性结节中均具有一定的局限。超声检查或CT阳性结果，结合血清甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)水平高于400ng/ml的检测结果，可对肝癌做出确诊。但是，通常当这些条件都符合时，已经错过了治疗的最佳时机。无论是超声波检查、CT扫描还是核磁共振，对小病灶的鉴定都有一定的局限性，尤其是肝硬化结节在影象学上与小肝癌结节有许多的相似之处。因此，虽然影像学技术在今年来取得了巨大的进步，但临床上仍需结合肝癌的分子标志物，在较为复杂的病例中将良恶性肝病进行区分。此外，肿瘤的临床分期及肿瘤大小是肝癌治疗效果的决定因素，因此，肿瘤标志物还可用于肝癌危险人群(如HBV慢性携带者和肝硬化患者)的普査。目前肝癌诊断最常用的标志物是甲胎蛋白(AFP)，在症状和影像学改变发生前数月即可出现异常。正常人血清中AFP含量一般小于10ng/ml。当AFP的诊断值定为20ng/ml时，其敏感性为5060%，但在肿瘤较小的病例中，敏感性显著降低，有报道仅为40%。单独使用AFP作为肝癌诊断标志物的另一个问题是缺乏特异性，在相当多的慢性肝炎患者尤其是肝硬化患者中，AFP含量也达20-200ng/ral。目前认为可与AFP互补诊断的标志物有AFP异质体、y-谷氨酰转移酶同工酶II和异常凝血酶原等，但由于它们在敏感性和特异性上的不足，以及检测方法的繁琐复杂，使其始终停留在实验室研究水平，未能转化成临床常规检查项目。因此，探索新的肿瘤分子标志物，以及建立相应的易于推广的检测方法，仍是当今肝癌研究领域的重要课题之一。硫酸肝素蛋白多糖3(Glypican-3，GPC3)是近年来发现的一种与肝癌相关的分子。应用差异显示技术，Hsu等首次发现了cDNA100。/。同源于GPC3的MXR7基因在肝癌组织中有异常表达。在191例肝细胞癌(HCC)组织中，143例(74.8%)能检测到了MXR7的mRNA，而在156例癌旁"非瘤"肝组织中仅有5例(3.2%)为阳性，该5例均为有门脉或远处转移的病例。随后，多家实验室相继证实了这一结果。在HCC组织中，GPC3mRNA和蛋白阳性检出率均在73%以上，tnRNA平均水平可较正常肝组织中高出21.7倍，而在正常肝脏、肝脏良性肿瘤、慢性肝炎和肝硬化等中则均呈阴性，表明该蛋白表达具有较高的肿瘤细胞特异性，是一种新型的肝癌标志物。然而，由于正常人外周血中GPC3含量微弱，肿瘤患者血清中GPC3含量尽管明显增加但仍然处于较低水平，建立灵敏度高的检测系统非常不易，导致这样肿瘤标志物迄今未能进入临床使用。因此，本领域迫切需要开发可灵敏检测GPC3水平的检测系统以及检测方法，为临床肿瘤的诊断提供良好的途径。
发明内容本发明的目的在于提供可灵敏、准确地检测样品中硫酸肝素蛋白多糖3含量的检测试剂。本发明的目的还在于提供检测样品中硫酸肝素蛋白多糖3含量的检测试剂品-。在本发明的第一方面，提供一种用于检测硫酸肝素蛋白多糖3的测试片，所述的测试片包括.-固相载体；和包被于所述固相载体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位。在另一优选例中，所述固相载体是酶标反应板。在本发明的第二方面，提供一种检测试剂盒，所述的试剂盒含有所述的测试片，或者所述的试剂盒含有(a)固相载体；(b)容器a以及位于所述容器a中的作为第一抗体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位；和(c)用于将所述的第一抗体包被于所述固相载体的试剂。在另一优选例中，所述的试剂盒中还装载有容器b，所述的容器b中装有第二抗体，所述第二抗体是多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位。在另一优选例中，所述的试剂盒中还装载有容器b'，所述的容器b'中装有第二抗体，所述第二抗体是单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位。在另一优选例中，所述单克隆抗体结合于硫酸肝素蛋白多糖3的以下表位硫酸肝素蛋白多糖3第25-358位中的表位；硫酸肝素蛋白多糖3第350-364位中的表位；或硫酸肝素蛋白多糖3第444-516位中的表位。更优选的，所述单克隆抗体结合于硫酸肝素蛋白多糖3第25-358位中的表位。在另一优选例中，所述的第二抗体带有可检测的标记物。在另一优选例中，所述的可检测的标记物选自辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶。更优选的，所述的标记物是辣根过氧化物酶。在另一优选例中，所述的试剂盒中还装载有容器C，所述的容器C中装有与标记物相对应的底物；容器d，所述的容器d中装有显色剂；容器e，所述的容器e中装有洗涤液；和/或容器f，所述的容器f中装有终止液。在本发明的第三方面，提供一种体外检测硫酸肝素蛋白多糖3的方法，包括以下步骤(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的硫酸肝素蛋白多糖3与固相载体上的第一抗体结合，形成带有"硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的l-378位或394-580位中的表位的多克隆抗体；(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有"第二抗体-硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位以外的表位的单克隆抗体或多克隆抗体，且所述的第二抗体携带一可检测标记物；和(c)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待检测样品中硫酸肝素蛋白多糖3的存在与否以及存在的量。在本发明的第四方面，提供一种多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位，并且所述多克隆抗体通过将硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位蛋白片段免疫动物而获得。在另一优选例中，所述的动物是兔。在另一方面，本发明还提供了上述的多克隆抗体的用途，它被用于制备检测硫酸肝素蛋白多糖3的试剂盒。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图l显示了GPC3蛋白25-358aa氨基酸片段的编码基因。图2显示了GPC3蛋白25-358氨基酸序列。图3显示了pProEXHta-GPC3(73-1074)质粒的小规模表达鉴定。图4显示了Ni柱纯化后的GPC3(25-358aa)蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。图5显示了WesternBlot检测纯化后的GPC3(25-358aa)蛋白。其中，M表示分子量marker;W-18表示采用多抗W-18(针对蛋白N端蛋白表位)检测的结果；anti-His表示釆用anti-His抗体检测的结果。图6显示了采用鼠抗GPC3(25-358aa)单抗gp2弁检测胎盘及肿瘤细胞的细胞裂解液的WesternBlot结果。其中，1.胎盘组织，2.L02细胞，3.MCF-7细胞，4.Hela细胞。图7显示了采用兔抗GPC3-Ag3多抗检测肿瘤细胞的细胞裂解液的WesternBlot结果。其中，l.Huh-7细胞；2.H印G2细胞；3.MCF-7细胞；4.Hela细胞。图8显示了GPC3定量标准曲线。图9显示了正常人、肝炎肝硬化及肝癌患者血清GPC3含量。图IO显示了GPC3受试者工作特征曲线(R0C曲线)。具体实施方式本发明人经过广泛的研究和试验，意外地发现，对应于硫酸肝素蛋白多糖3(GPC3)氨基酸序列第379-393位抗原表位的多克隆抗体可极好地识别GPC3抗原；当采用该多克隆抗体作为第一抗体捕获GPC3后，再用对应于GPC3氨基酸第379-393位以外其他区段的表位的第二抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体)，可以极其有效地结合于GPC3，从而通过双抗夹心法高灵敏地检测GPC3抗原。与之相反，当使用结合于GPC3其他区段(如第444-516位)的多克隆抗体作为第一抗体时，则检测灵敏度较低。此外，本发明人还意外地发现，当使用特异性结合GPC3第379-393位抗原表位的多克隆抗体作为第一抗体时，GPC3肝癌标志物与AFP肝癌标志物的结合检测具有更高的互补性诊断价值。与单单检测AFP标志物相比，在检测AFP标志物的同时采用本发明的试剂盒检测GPC3标记物可显著提高肝癌的诊断敏感性。此基础上完成了本发明。本领域技术人员均了解，一种抗原可能含有多个抗原表位(抗原决定簇)，因此，针对同一个抗原可以获得不止一个抗体(包括单克隆抗体或多克隆抗体)，这些抗体对抗原的结合特性(如特异性等)均可能是不同的。因此，针对同一个抗原，本领域人员需要进行反复比较、筛选和鉴定，才能找到适合于特异性和敏感性结合的抗体。由于GPC3蛋白是一条较长的多肽，其大部分抗原决定簇被包含在空间结构的内部，因此找到适合于与之结合的抗体难度较高。针对上述技术难题，本发明人制备了多种对应于GPC3的单克隆抗体和多克隆抗体，通过大量的试验，检测不同种单克隆抗体或多克隆抗体对于GPC3的结合特异性以及敏感性。结果发现，对应于GPC3氨基酸序列第379-393位抗原表位的多克隆抗体可特别良好地识别GPC3抗原。并且，本发明人将不同种单克隆抗体和/或不同种多克隆抗体进行两两配伍(基于双抗夹心法原理)来检测这些单克隆抗体和多克隆抗体的组合对于GPC3的结合特异性以及敏感性。最终发现采用结合于GPC3氨基酸序列第379-393位中抗原表位的多克隆抗体(作为第一抗体)，以及结合于GPC3氨基酸第379-393位以外抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体(作为第二抗体)作为基于双抗夹心法的检测试剂，可特别灵敏地检测GPC3抗原。而当采用结合于第379-393位以外的抗原表位的多克隆克隆抗体与其它单克隆抗体或多克隆抗体配伍时，敏感性和特异性均不高；当采用单克隆抗体与单克隆抗体配伍时，敏感性高，但是特异性很差。如本文所用，所述的"样品"是指分离自人体的物质，包括但不限于血清、血浆、尿液、或其它组织提取液。优选的，所述的样品是血清或血浆。如本文所用，所述的"捕获抗体"、"包被抗体"、"第一抗体"与"一抗"可互换使用，都是指所述的结合于GPC3氨基酸序列第379-393位中的抗原表位的多克隆抗体。所述的第一抗体可被包被在固相载体上。本发明对所采用的固相载体没有特别的限制，只要其能够与第一单克隆抗体相偶联(连接)即可。例如，所述的固相载体为酶标反应板。如本文所用，所述的"检测抗体"、"第二抗体"与"二抗"可互换使用，都是指特异性结合于GPC3第379-393位以外的抗原表位的抗体，其可以是单克隆抗体或者是多克隆抗体。硫酸肝素蛋白多糖3硫酸肝素蛋白多糖3(Glypican-3，GPC3)位于细胞膜表面，由核心蛋白和糖胺聚糖(肝素及硫酸乙酰肝素)侧链构成，是细胞表面多功能的共同受体，通过与细胞外基质、生长因子和蛋白酶等的相互作用传递信号，在细胞的生长、发育、分化和迁移等中有重要功能。GPC3在体内的存在有明显的组织特异性和时相特异性在人胚胎期，胃肠道和中胚层来源的组织中有大量GPC3表达；但在成人，除胎盘组织外，仅肺、肾、心和卵巢等少数组织中有GPC3的低度表达，肝脏中为阴性。本发明人在研究中发现，肝细胞癌(HCC)患者血清中，GPC3平均浓度显著高于正常对照和肝硬化患者。在分化较好的HCC病例中，GPC3较AFP检测更为敏感，两者联合检测可大大提高肝癌的诊断阳性率。GPC3蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列是本领域已知的，其氨基酸序列如SEQIDNO:7所示，其核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。或者，本领域人员也可参见GenBank登录号NP—004475和NM_004484.2所提供氨基酸序列和核苷酸序列。抗体本发明人提供了一种可极好地识别GPC3抗原的多克隆抗体，所述抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的抗原表位。所述多克隆抗体通过采用GPC3第379-393位蛋白片段免疫动物而获得。多克隆抗体的制备是本领域技术人员所熟知的。佐剂可用于增强免疫反应，如弗氏佐剂。例如，所述多克隆抗体的制备方法如下将GPC3第379-393位蛋白片段与弗氏佐剂按照适当比例(如1:1)混合，充分乳化后免疫动物。免疫方法可使用皮下注射。动物免疫1-4个月后，可从动物静脉血中收获抗血清并纯化，获得抗GPC3第379-393位蛋白片段的多克隆抗体。作为本发明的优选方式，所述的动物是兔。在本发明的实施例中，本发明人制备了多种多克隆抗体(包括兔抗人GPC3-Ag3多克隆抗体(结合于GPC3第379-393位中的抗原表位)、兔抗人GPC3-Agl(结合于GPC3第73-86位中的抗原表位)、兔抗人GPC3-Ag4多克隆抗体(结合于GPC3第444-516位中的抗原表位))，在后续的ELISA检测中发现，兔抗人GPC3-Ag3多克隆抗体与其它各种非结合于GPC3第379-393位中的表位的单克隆抗体或多克隆抗体配伍，可特别灵敏地检测GPC3抗原含量。制备特异性抗GPC3蛋白的单克隆抗体的技术是本领域中众所周知的。这里，"特异性"是指抗体能结合于GPC3蛋白或其片段；更特别地，指那些能与GPC3蛋白或其片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。所述的单克隆抗体是特异性结合于GPC3第379-393位以外的抗原表位的抗体。应理解，当用于作为第二抗体与所述的结合于GPC3第379-393位中的抗原表位的多克隆抗体(作为第一抗体)联合用于检测GPC3抗原时(基于双抗夹心法原理)，所述的单克隆抗体可以是多种多样的，只要其能够特异性结合于GPC3第379-393位以外的抗原表位。优选的，所述的GPC3第379-393位以外的抗原表位选自GPC3第25-358位对应的抗原表位；GPC3第350-364位对应的抗原表位；或GPC3第444-516位对应的抗原表位。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。利用杂交瘤技术制备单克隆抗体是本领域技术人员所熟知的，例如可参见Kohler等人，Nature256;495,1975;Kohler等人，Eur丄Immunol.6:511,1976;Kohler等人，Eur丄Immunol.6:292,1976;Hammerling等人，InMonoclonalAntibodiesandTCellHybridomas,Elsevier,N.Y.，1981中所描述的。在得知了所述单克隆抗体所对应的GPC3抗原的表位位置，本领域人员可方便地通过已知的方法获得所述的单克隆抗体。例如，当需要制备抗GPC3第25-358位对应的抗原表位的单克隆抗体时，采用GPC3第25-358位蛋白片段免疫小鼠，制备杂交瘤，从而获得所需的抗体。检测试剂盒本发明人根据双抗夹心法的原理，制备了一种可用于检测样品中GPC3蛋白水平的试剂盒。双抗夹心法常规的做法是将一抗固定于载体，然后一抗与抗原反应，洗涤后再与二抗反应(所述的二抗携带可检测标记物，或可与携带可检测标记物的物质结合)，最后进行化学发光或酶联显色反应检测信号。双抗夹心法特别适用于具有两个或两个以上表位的抗原的检测。本发明人发现，采用结合于GPC3第379-393位中的抗原表位的多克隆抗体与特异性地结合于GPC3第379-393位以外的抗原表位的抗体来将目标抗原GPC3吸附及定位，其定位和放大效果特别好，从而具有很高的特异性和精密度。并且，相对于单抗体的竞争法来说，双抗体夹心法的测定效果更为优良，因而测定时只需很少的样品量。所以采用双抗体夹心法无论在灵敏度、精确度、准确度、特异性及稳定性上更具有优势。本发明的检测试剂盒含有测试片，所述的测试片包括固相载体；和包被于所述固相载体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394--580位中的表位。或者，本发明的检测试剂盒含有(a)固相载体；(b)容器a以及位于所述容器a中的作为第一抗体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位；和(c)用于将所述的第一抗体包被于所述固相载体的试剂。作为本发明的优选方式，所述的试剂盒中还装载有容器'b，所述的容器b中装有第二抗体，所述第二抗体是多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位；或者，容器b'，所述的容器b'中装有第二抗体，所述第二抗体是单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位。作为本发明的优选方式，所述的第二抗体带有可检测的标记物。如本文所用，所述的"可检测的标记物"是指用于确定待检测样品中GPC3的存在与否以及存在的量的标志物。在确定了本发明的试剂盒所采用的包被抗体和/或检测抗体后，可以采用本领域常规用于与检测抗体结合来进行检测的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待检测样品中GPC3蛋白的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。所述的标记物可直接被设置于第二抗体上；或者，所述的标记物也可被设置于特异性抗第二抗体的抗抗体上，本领域人员可根据所采用的抗体的种类和特性，选择适宜的标记物。例如，所述的标记物可以选自辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、)3-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。如本文所用，所述的"与标记物相对应的底物"是指可被标记物所催化显色，用于显示第二抗体与GPC3发生结合的识别信号。所述的底物例如用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP);等等。本领域人员可根据所采用的标记物的种类和特性，选择适宜的底物。作为本发明的优选方式，所述的第二抗体与标记物直接相连接。更优选的，所述的标记物是HRP。与以生物素标记检测抗体、反应后再与链亲和素-HRP反应相比较，直接在检测抗体上标记冊P、反应结束后直接加底物显色更为简单便捷。为了获得定量结果，还可以在检测过程中设置含已知浓度的多个GPC3蛋白的标准品。对于标准品的设置方法可采用常规的方法。为了消除假阳性和假阴性，也可在检测过程中设置质控(对照)。此外，为了使本发明的试剂盒在检测时更方便，所述的试剂盒中优选的还包含其它一些辅助试剂，所述的辅助试剂是ELISA试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的。所述的试剂例如(但不限于)显色剂、洗涤液、终止液、增敏液、稀释液。此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。本发明的试剂盒可应用于(A)作为独立的检测系统，进行肝癌的诊断；(B)与影像学检査和/或AFP标志物检测等结合，进行肝癌的诊断；(C)进行AFP增高肝病的良恶性鉴别诊断；(D)进行治疗前GPC3阳性肝癌的预后监测；(E)进行肝癌高危人群的筛查；和/或(F)进行肝癌相关的基础研究。检测方法
技术领域：
：本发明提供了一种利用本发明的试剂盒体外检测GPC3蛋白的方法，包括以下步骤(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的硫酸肝素蛋白多糖3与固相载体上的第一抗体结合，形成带有"硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位的多克隆抗体；(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有"第二抗体-硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位以外的抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体，且所述的第二抗体携带一可检测标记物；和(c)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待检测样品中硫酸肝素蛋白多糖3的存在与否以及存在的量。作为本发明的一种优选方式，定量检测GPC3蛋白的方法具体如下(i)抗原抗体反应将本发明的第一抗体包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔内分别加入不同浓度的标准品、质控品(可选)，或待测血清样品；(ii)酶联反应将第二抗体(其上设置有标记物)溶液加入各孔，振荡、孵育；洗涤；(iii)显色反应每孔加入对应于标记物的底物、显色剂，孵育，每孔加入反应终止液，结束反应；(iv)酶标仪测定OD值；(V〉结果计算A)制作标准曲线以GPC3蛋白标准品浓度为横坐标，标准品测定OD值为纵坐标，作出标准曲线；B)评判质控品浓度(可选)根据质控品的OD值，从标准曲线上读出相应的浓度值；质控品测定浓度值处于给定范围时，该次测定有效；C)计算待测血清样品浓度当标准曲线和质控品均被判定有效时，根据待测样本的OD值从标准曲线计算出待测血清样品的GPC3蛋白浓度。由于本发明的检测试剂或试剂盒敏感性高，大大縮短了样品孵育时间(约2±0.5小时)，因此利用所述试剂盒只需很短的时间即可获得GPC3的定量数据，该时间一般在2-4小时。而采用常规的试剂或试剂盒检测时，样品通常需要孵育过夜以增加敏感性。本发明的主要优点在于(1)首次发现采用对应于GPC3氨基酸序列第379-393位抗原表位的多克隆抗体可良好地识别GPC3抗原，将其与对应于GPC3氨基酸第379-393位以外抗原表位的抗体联合应用作为基于双抗夹心法的检测试剂，可特别灵敏地检测GPC3抗原。(2)提供了一种使用方便且灵敏度高的肝癌检测试剂盒，在样品中GPC3含量较低(lng水平)时即可灵敏地检测，并且完成检测所需的时间很短(约2-4小时)。所述试剂盒有助于尽早地诊断肝癌患者，及时治疗，提高生存率，具有积极的社会效益。在肝癌疗效随访、亚临床转移复发监控以及预后判断等方面也有广泛的应用价值。(3)本发明人还发现，GPC3肝癌标志物与AFP肝癌标志物的结合检测具有互补性诊断价值。GPC3与AFP联合应用，不仅可提高肝癌早期诊断的阳性率，而且可对临床上为数众多的AFP低度或中度增高患者的良恶性病变进行鉴别诊断。与单单检测AFP标志物相比，在检测AFP标志物的同时采用本发明的试剂盒检测GPC3标记物可显著提高肝癌的诊断敏感性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例l.多肽抗原GPC3(25-358)、GPC3(444-516)的原核制备采用如下方法制备具有GPC3全长氨基酸序列第25-358位序列的多肽抗原GPC3(25-358):(1)人胎盘总RNA的提取取人胎盘组织约lg，至1.5ml的离心管中，加lmlTRAZ0L试剂，用玻璃匀浆器打碎组织，抽取RNA。(2)反转录取5yg总RNA，用ThermoScriptRT-PCRSystem(GIBC0BRL公司)试剂盒，参照反转录试剂盒说明以oligo(dT)20为引物，AMV反转录酶反转录合成cDNA。(3)表达载体的构建设计如下引物-GPC3-73(SEQIDNO:3):5'cgcgaattcCAGCCCCCGCCGCCGCCGCC3'禾卩GPC3-1074(SEQIDNO:4):5，gcgctcgagTTATCTATATTGGCGTTGTTGAGAATGGGCACATAAC3，以新合成的人胎盘cDNA为模板，以前述设计的引物为引物，对GPC-3蛋白N端编码序列(去除24aa信号肽部分)nt.73-1074进行扩增。扩增体系为10"L;扩增条件为94。C预变性3min;94。C变性30s，58。C退火30s，72。C延伸30s，共30个循环；72t:再延伸10min。PCR产物用10g/L的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，并用PCR片段回收试剂盒回收PCR产物。PCR产物以I和i7oI位点克隆至pProEXHTa载体(购自美国Invitrogen公司)，获得表达GPC-3蛋白25-358aa的质粒pProEXHta-GPC3(73-1074)，测序鉴定基因序列中无影响氨基酸改变的点突变(图1，SEQIDNO:1)，推导的氨基酸序列见图2(SEQIDNO:2)。(4)pProEXHta-GPC3(73-1074)的表达与纯化将重组质粒pProEXHta-GPC3(73-1074)转化感受态大肠杆菌菌株BL21-codo叩lus(DE3)-RP(购自Stratagene)，涂氨节青霉素抗性琼脂平板，37°C倒置生长过夜，在含氨苄青霉素琼脂平板上用牙签挑取3个克隆于3ml含氨苄的LB中，37r摇床过夜。过夜培养的菌按1:100比例转接种至3ml含氨苄的LB中，37。C振荡培养3h，至对数中期"55。=0.5)。加入异丙基硫代-e-d-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol/L，继续振荡培养3h，诱导GPC3蛋白表达。取各个诱导菌及未诱导的对照菌，量为相当于A55。=l时100Pl菌液，沉淀后悬于10W1XSDS上样缓冲液，沸水浴中煮5min。-20匸保存或立即用于SDS-PAGE凝胶电泳。SDS-PAGE电泳鉴定蛋白的表达。结果诱导菌在40KD处有特异性蛋白表达条带(GPC3)，见图3。按照小样诱导条件，诱导200mlpProEXHta-GPC3(73-1074)-codo叩lus表达蛋白，并用Ni柱纯化，然后进行SDS-PAGE凝胶电泳鉴定。结果发现，40KD左右蛋白主带占总蛋白90%以上，见图4。pProEXHta-GPC3(73-1074)表达蛋白定位于包涵体中，按不可溶蛋白的纯化步骤纯化(a)层析柱用10倍TNA体积的GuNTA-0Buffer(20mmol/LTris-HC1pH7.9，0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea)洗。将样品加到TNA层析柱中，流速控制在15ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白质的结合情况。层析用5倍TNA体积的GuNTA-0Buffer洗，流速控制在30ml/h左右。(b)分别用5倍TNA体积的GuTNA-209(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea，20mmol/U，GuTNA-40(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea，40minol/LImidazole)，GuTNA-60(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea，60mmol/LImidazole)，GuTNA-100(20mmol/LTris-HClpH7.9，0.5mol/LNaCl,8mol/LUrea，100mmol/LImidazole),GuTNA-500(20画1/LTris-HC1pH7.9，0.5mol/LNaCl，8mol/LUrea，500mmol/LImidazole)洗脱，流速控制在15ml/h，收集洗脱液，每管收集一个TNA体积。以anti-His抗体以及SantaCruz公司抗-GPC3多抗W-18(针对蛋白N端蛋白表位)对纯化产物进行常规的WesternBlot检测，结果证实表达产物为GPC3蛋白，见图5。采用与前述制备多肽抗原GPC3(25-358)相似的原核表达方法，本发明人还制备了选自GPC3全长氨基酸序列的第444-516位的多肽抗原GPC3(444-516)，命名为GPC3-Ag4。实施例2多肽抗原GPC3(379-393)、GPC3(73-86)、GPC3(350-364)的合成及偶联利用软件DNAStar对全长GPC3蛋白抗原性进行分析，主要根据蛋白的抗原性、可及性两个参数选择位于GPC3全长氨基酸序列的第379-393位的多肽抗原GPC3(379-393)位氨基酸ETLSSRRRELIQKLK(SEQIDN0:5)，命名为GPC3-Ag3。该多肽采用人工合成方法制备，GPC3-Ag3合成后采用戊二醛法与KLH(钥孔血蓝蛋白)进行偶联，得到GPC3-Ag3-KLH。此外，本发明人还合成了选自GPC3全长氨基酸序列的第73-86位的多肽抗原GPC3(73-86)，命名为GPC3-Agl;选自GPC3全长氨基酸序列的第350-364位的多肽抗原GPC3(350-364)，命名为GPC3-Ag2。并且，将GPC3(73-86)与KLH相偶联，得到GPC3-Agl-KLH。实施例3多克隆抗体的制备a.兔抗人GPC3-Ag3多克隆抗体的制备抗原GPC3-Ag3-KLH。动物新西兰大白兔，一只雄性，一只雌性，4-6周，2.5-3.0kg，均购自中国科学院上海实验动物中心。(1)取一只雄性和雌性健康新西兰大白兔同时免疫。免疫前经兔耳缘静脉取血1-2ml，分离血清，分装，-8(TC保存待用。初次免疫时，每只兔注射lmg抗原。将弗氏完全佐剂与lml抗原(lmg)等体积混合，充分乳化后经背部皮内组织进行多点注射。(2)以后每隔2周加强免疫一次，总共两次，抗原量不变，改用弗氏不完全佐剂，注射方法不变。第二次加强后第7天，用ELISA方法测定兔血清中抗体的效价。血清效价达到要求后，乙醚麻醉兔，进行颈动脉插管，取尽新西兰大白兔血液，室温放置30min，再置于4"C冰箱过夜，吸取析出的兔血清，余血于4。C，4000rpm离心10min，吸取上层血清，即得到兔抗人GPC3-Ag3多克隆抗体。GPC3-Ag3-KLH免疫5周后的兔血清效价见表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>以纯化后的兔血清对细胞裂解液进行WesternBlot检测。结果发现，采用肝癌细胞Huh-7(ATCC)及H印G2(ATCC)的细胞裂解液作为抗原，以所述兔血清为抗体，在分子量60KD(全长GPC3)处有特异性条带；而以MCF-7(人乳腺癌细胞，ATCC)及Hela(人宫颈癌细胞，ATCC)的裂解液作为抗原，以所述兔血清为抗体，结果为阴性，见图7。可见所述的兔抗人GPC3-Ag3多克隆抗体具有较高的特异性。并且，进一步的试验还显示，所述的多克隆抗体不结合于位于GPC3的1-378位或394-580位中的表位。b.兔抗人GPC3-Agl、兔抗人GPC3-Ag4多克隆抗体的制备采用的抗原为GPC3-Agl-KLH以及GPC3-Ag4，采用的动物同前述a。根据前述a同样的方法，制备获得兔抗人GPC3-Agl多克隆抗体、兔抗人GPC3-Ag4多克隆抗体。GPC3-Agl-KLH免疫7周后的兔血清效价见表2;GPC3-Ag4免疫5周后的兔血清效价见表3。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>实施例4抗GPC3单克隆抗体的制备及纯化a.鼠抗GPC3(25-358)单克隆抗体的制备及纯化取6-8周龄BALB/c小鼠，初次免疫用纯化的GPC3(25-358)蛋白与等体积的福氏完全佐剂混合后，于背部及腹股沟多点皮下免疫，以后每隔2周免疫一次，用同剂量的抗原与福氏不完全佐剂混匀后于背部多点皮下免疫。第3次免疫7天后，鼠尾静脉采血，用间接ELISA法测定特异性抗体的产生。融合前3天，再用同样剂量的不加佐剂的抗原腹腔加强免疫1次。加强免疫三天后，断颈处死小鼠，在无菌条件下取出脾脏，用注射器注入约0.2-0.5ml无血清培养液使其胀大，再用弯曲的注射针头多点刺破脾膜，用挤压的方法使淋巴细胞从中逸出，制备免疫脾细胞悬液后计数，用不完全培养液洗涤2次。取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm/min离心5min，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm/min离心8min。弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。在室温下融合①30s内加入预热的1ml45%PEG1000含5。/。画S0，边加边搅拌；②作用90s;③加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。离心，800rpm/min，6min。弃上清，先用6ml左右20%小牛血清RPMI1640轻轻混悬，不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml—块96孔板。将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100ul/孔，37°C、5%0)2温箱培养。一般一块96孔板含有1X1()7脾细胞。在融合24h后加HAT选择培养液。HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。当杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体。用包被液将通过基因工程获得的GPC3蛋白稀释为5Pg/ral，以每孔IOOyl包被酶标板，置于4'C过夜后弃上清，用洗涤液将包被好的酶标板洗涤3次，每次5min，然后每孔加入200u1封闭液(3Q/。BSAPBST)，37。C放置2h，倾去封闭液，同上洗涤，每孔加入100y1培液上清，37t:孵育1.5h，弃上清，同上洗涤后每孔加入l:1000稀释的羊抗鼠IgG-HRP100ul，37。C孵育1h，将孔内上清弃去，同上洗涤，每孔加入100iU的显色液(0PD-H202),室温避光显色10-20min后，每孔加入50yl的终止液终止反应，酶标仪读出/Unra值。阳性克隆按有限稀释法进行克隆化，经三次克隆化后筛选出所需要的杂交瘤细胞系。结果获得11株阳性克隆，分别命名为gpl弁-gpll井。腹腔注射液体石蜡于F'代小鼠，2周后腹腔注射1X105个杂交瘤细胞，接种细胞7-10天后产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠濒于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中。取腹水或免疫后兔血清与等体积的PBS(0.01raol/L，pH7.4，含0.15mol/L的NaCl)稀释后，再加与上面等体积的饱和硫酸铵(90g硫酸铵加到100ml蒸馏水中，8(TC溶解，趁热过滤，降至室温后即有结晶析出，用硫酸调至pH7.0)，置4'C，4h，然后10000rpm/min离心15min，弃上清，沉淀用卜5mlPBS溶解，移入透析袋，在PBS(O,01mol/L，pH7.4，含0.15mol/L的NaCl)中4°C透析过夜，将透析袋中的蛋白液移入ProteinAS印haroseCL-4B柱循环数次，用Tris-HC1(0.05mol/L，pH8.0，含0.15mol/L的NaCl)清洗已经上样的ProteinA柱，至在紫外色谱仪记录纸上显示没有蛋白再洗脱下来，然后用解离液(O.01mol/L，甘氨酸-HC1，pH3.0，含0.15mol/L的NaCl)洗脱抗体，洗脱液立即用1mol/LTris-HCl(pH8.0)调pH至7.2，在PBS(O.01mol/L，pH7.4，含0.15mol/L的NaCl)中4。C透析过夜后进行蛋白定量和特异性验证，获得纯化的抗GPC3(25-358)单克隆抗体。所获得的单克隆抗体效价及分型见表4。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>选择gp2弁单克隆抗体用于后续试验，腹水纯化后的其能识别富含GPC3的胎盘裂解物中40KD左右的可溶性GPC3，但在L02(胚肝细胞，ATCC)、MCF-7(人乳腺癌细胞，ATCC)及Hela(人宫颈癌细胞，ATCC)中未见该条带(图6)，可见该抗体特异性强。b.鼠抗GPC3(350-364〉、GPC3(444-516)单克隆抗体的制备以多肽抗原GPC3(350-364)为抗原，采用与前述.a相同的方法，制备获得IO株杂交瘤细胞株，分别命名为2G7，3D4，3F5，3G1，3G6，4B9，5H10,6訓，7C8和9D9。这些杂交瘤制备的单克隆抗体阳性腹水1:10000稀释后直接ELISA结果见表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>以多肽抗原GPC3(444-516)为抗原，采用与前述a相同的方法，制备获得7株杂交瘤细胞株，分别命名为1C6，1F4,2D2,2F2,2G9,3C6和4F3。这些杂交瘤制备的单克隆抗体阳性腹水1:10000稀释后直接ELISA结果见表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>实施例5抗体的辣根过氧化物酶(HRP)标记称取HRP0.6mg溶于120|li1水中；加入NaI04(12.8mg/ml)，4。C30min;加入乙二醇(9Win1ml)120)^l室温30min;lmg/ml的抗体240^1混匀后装入透析袋对碳酸盐缓冲液(0.05MpH9.6)缓慢搅拌透析过夜，使之结合；第二天加NaBH4(5mg/ml)24W，4°C2h;装透析袋，4°C对0.05M/LPBS(pH7.2)透析过夜4t:离心，取上清检测效价。实施例6ELISA检测1.以GPC3-Ag3多克隆抗体为第一抗体，以HRP标记的鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2弁)为第二抗体的ELISA将纯化的兔抗GPC3多抗GPC3-Ag3多克隆抗体用包被缓冲液((0.01mol/L磷酸酸盐缓冲液pH7.6))稀释至5PgAil，包被酶标反应板，每孔IOOW，4'C孵育过夜后洗涤1次(洗涤缓冲液PBST:100ralPBS(pH7.2)中加入0.05mlTween-20);加入200W封闭液(封闭液100mlPBST中加入3g的BSA)封闭酶标反应板，37。C孵育2h后洗涤1次；加入待测样本，每孔IOOW(血清PBS=1:3)(0.02mol/LPBS缓冲液pH7.2)，22T孵育2h后洗涤5次;加入l:150稀释的辣根过氧化物酶标记的鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2tt-HRP)，每孔100W，22。C孵育30min，后洗涤6次；加入底物液每孔100W(A液、B液各5(M)(A液0.2mol/L(19.2g)柠檬酸24.3ml;0.2mol/LNa2HP0(28.4gh25.7ml;HA0.1%;加ddH20至1200ral;B液:TMB3.9g;拧檬酸10.52g;EDTA1.86g;甘油300ml;加热溶解后加蒸馏水至10000ml)。37。C避光显色15min，每孔加入终止液终止反应，用Bio-Tek公司的酵标仪ELX800酶标仪读取各孔0D值(波长450nm)。结果，以上述鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2弁)及GPC3-Ag3多克隆抗体建立夹心ELISA法，对稀释于25。/。正常人血清中的GPC3重组蛋白进行检测，结果最低检测浓度为2ng/ml，在5ng-125ng的范围内GPC3含量和0.D,度数呈良好的线性关系，见图8。进一步地，本发明人利用上述ELISA方法，对106例正常人、96份肝炎肝硬化及364例肝癌病人的血清进行了GPC3检测，结果正常人平均值为6.04±9.21ng/ml，肝炎肝硬化为11.7±12.23ng/ml。肝癌患者血清GPC3浓度呈偏态分布，平均均值为87.22ng/ml,其中有大于2000ng/ml的有3人，最高者为5432ng/ml。正常人、肝炎肝硬化于肝癌间GPC3差异具有极显著性(P〈0.000)，正常人和肝炎肝硬化之间的差异无显著性(图9)。根据对肝癌和肝炎肝硬化两组病人所作的受试者工作曲线(图10)，当阳性值取36.8ng/ml时，诊断的敏感性和特异性分别为32%和2%;当阳性值取27.lng/ml时，诊断的敏感性和特异性分别为45.1%和8.4%(表7)。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.单抗与单抗，单抗与多抗，多抗与多抗之间配伍试验本发明人利用前述制备的各种单克隆抗体和多克隆抗体，建立了以不同单抗或多抗作为第一抗体或第二抗体进行配伍的夹心ELISA检测方法，用于检测抗原GPC3。采用的ELISA检测步骤与1所述方法类似。结果发现，用于建立夹心ELISA方法时，各种配伍间的检测敏感性相差很远。当以兔抗人GPC3-Ag3多抗以外的其它两种多抗分别作为第一抗体和第二抗体配伍时，敏感性和特异性均差。如以兔抗人GPC3-Ag4包板，以抗人GPC3-Agl检测，浓度为100ng/ml的标本OD450读数为0.234，而阴性标本0D450读数也有0.204，达不到诊断试剂盒的要求。当单抗与单抗(如1F4+gp2共)配伍时，敏感性高，最低检测浓度达0.5ng/ml。但是，特异性很差，正常人血清易出现假阳性结果，假阳性率甚至高达18%。当单抗与多抗配伍时，以兔抗人GPC3-Ag3多抗(第一抗体)+鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2弁)(第二抗体)配伍检测结果准确，采用多抗兔抗人GPC3-Ag3多抗(第一抗体)+3C6单抗(第二抗体)检测同一样本时的OD读数与前组接近。当采用多抗兔抗人GPC3-Ag4(第一抗体)+单抗7C8(第二抗体)检测时，检测同一样本时OD读数较兔抗人GPC3-Ag3多抗和鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2弁)配伍低1015%，准确性差。而采用多抗兔抗人GPC3-Agl与多种前述制备的单抗或多抗检测时，准确性更差。实施例7GPC3与AFP的互补性诊断采用本发明人获得的最佳配伍兔抗人GPC3-Ag3多抗和鼠抗GPC3单克隆抗体(gp2弁)，建立ELISA双夹心试剂盒；并且采用检测AFP指标的AFP检测放免试剂盒试剂盒(购自上海生物制品所)，对151份病理诊断明确的肝细胞肝癌同时进行了AFP与GPC3的检测。结果，当AFP和GPC3的阳性判定值分别定为20ng/ml和30ng/ml时，前者阳性诊断率为49%(74/151)，后者为40%(61/151)(表8)。具有意义的是，在77例AFP阴性的肝癌中，有34(44%)例GPC3为阳性，表明GPC3是一和AFP互补的肝癌标志物。联合AFP和GPC3的检测，可将前者的诊断敏感性由49%提高至72%。表8AFP+AFP-合计GPC3+273461GPC3-474390合计7477151在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110>上海市肿瘤研究所<120〉一种用于诊断肝癌的ELISA试剂盒<130>072225<歸5<170>Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉1002<212>DNA<213>智人(HomoSapiens)<400〉1cagcccccgccgccgccgccggacgccacctgtcaccaagtccgctccttcttccagaga60ctgcagcccggactcaagtgggtgccag犯actcccgtgccaggatcagatttgcaagta120tgtctccctaagggcccaacatgctgctcaag肌卿tgga3g犯aaatacc犯ctaaca180gctcgattgaacatgga^cagctgcttcagtctgcaagtatggagctcaagttcttaatt240attcagaatgctgcggttttcc犯gaggcctttgaaattgttgttcgccatgccaagaac300tacaccaatgccatgttcaagaacaactacccaagcctgactccacaagcttttgagttt360gtgggtgaatttttcacagatgtgtctctctacatcttgggttctgacatcaatgtagat420gacatggtcaatgaattgtttgacagcctgtttccagtcatctatacccagctaatgaac480ccaggcctgcctgattcagccttggacatcaatgagtgcctccgaggagcaagacgtgac540ctgaaagtatttgggaatttccccaagcttattatgacccaggtttccaagtcactgcaa600gtcactaggatcttccttcaggctctg犯tcttgg犯ttgaagtgatcaacacaactgat660cacctgaagttcagtaaggactgtggccgaatgctcaccagaatgtggtactgctcttac720tgccagggactgatgatggttaaaccctgtggcggttactgcaatgtggtcatgcaaggc780tgtatggcaggtgtggtggagattgacaagtactgg卿gaatacattctgtcccttgaa840gaacttgtgaatggC3tgt3acgtactgcttggtctcttt900tcaacaatccatgattctatccagtatgtccagaagaatgcaggaaagctgaccaccact960attggcaagttatgtgcccattctcaacaacgccaatata1002<210〉2〈211〉334<212>PRT<213>智人(HomoSapiens)<400〉2GinProProProProProProAspAlaThrCys1510PhePheGinArgLeuGinProGlyLeuLysTrp2025ValProGlySerAspLeuGinValCysLeuPro3540CysSerArgLysMetGluGluLysTyrGinLeuHisGinValArgSer15ValProGluThrPro30LysGlyProThrCys45ThrAlaArgLeuAsn<formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage27</formula><210>4<211〉46<212〉隨〈213〉人工序列<220〉<221〉misc_feature<223〉引物<400〉4gcgctcgagttatctatattggcgttgttgagaatgggcacataac46<210>5<211〉15<212〉PRT<213〉人工序列<220〉<221〉MISC_FEATURE<223〉GPC3蛋白第379-393位氨基酸序列<400〉5GluThrLeuSerSerArgArgArgGluLeulieGinl>ysLeuLys151015<210〉6〈211〉1743<212>醒<213〉智人(HomoSapiens)<400〉63tggCCggg3ccgggacaggttcttccagagatttgceiagtaCC3L￡LCt￡L￡Laagttcttaacatgccaagagcttttgagtatcaatgtagca_gct;aa_tg3gca卿cgtgaagtcactgc犯cacaactgtactgctcttgtcatgcaagccgtgcgcaccgcagcccccgactgcagcctatgtctccccagctcgattttattcagaaact3cacc犯ttgtgggtgaatgacatggtacccaggcct3cctgaaagt犯gtcactagatcacctgaaactgccaggggctgtatggccgcgtgcttggccgccgccgcggactcaaggaacatggaatgctgcggtttgccatgttcatttttcacacaatgaattggcctgattcaatttgggaatgatcttccttgttcagtaagactgatgatg鄉tgtggtggtggtggcgaccggacgccatgggtgccagacatgctgctcagctgcttcttcc幼g3ggaaga3C犯ctgatgtgtctctttgacagccgCCttgg3C3ttcccc肌gccaggctctgagactgtggccgttaaaccctgagattgacatgctgctcagCCtgtCELCCa犯act.cccgtagtctgcaagcctttgaaatacccaagccttctacatctttgtttccagttcaatgagtgttattatgacatcttggaatg犯tgctcacgtggcggttaagtactggagcttggacttcagtccgctccgccaggatcagg犯g幼肪atatggagctctgttgttcgcgactccacaagggttctgaccatctatacccctccgaggaccaggtttcctg犯gtgatcc卿atgtggctgcaatgtgag犯tacatt60120訓240300360420480540600660720780840900ctgtcccttgaagaacttgtgaatggcatgcttggtctcttttcaacaatccatgattctctgaccaccactattggcaagttatgtgcctattatcctgaagatctctttattgacaaggaagaaaccttatcxagccgaagaagggaattctatagtgctttgcctggctacatctgcctttgctggaatggacaagaactcgtggagatgaaaaaccagttcaatctccatgagctgcaaattattgacaaactgaagcacattaacggtagagttctggataaaaacctggatgaggatg犯gatgagtgcattggagggtctggtcgcttccttgcagaactggcctatgatctgcaggcaactccgaaggacaacgagataagcccgctgaagcttctcaccagcatggccatctacagaatctatgacatggagaacgtactg960atccagtatgtccagaagaatgcagg犯ag1020cattctcaacaacgccaatatagatctgct1080aaagtattaaaagttgctcatgtagaacat1140ctaattcagaagttgaagtctttcatcagc1200agccatagccctgtggcggaaaacgacacc1260agatacagccaaaaggcagcaaggaatgga1320aaaatgaagggccctgagccagtggtcagt1380cagctcctgagaaccatgtctatgcccaaa1440gaagggtUgaaagtgg卿ctgcggtgat1500gatggaatgataaaagtgaagaatcagctc1560gatgtggatgatgcgcctggaaacagtcag1620acctttcacaacctcgggaacgttcattcc1680tcggtggtgtgcttcttcttcctggtgcac17401743<210〉7<211〉580<212〉PRT<213〉智人(HomoSapiens)〈柳〉7MetAlaGlyThrValArg15SerLeuAspPheProGly20AlaThrCysHisGinVal35LeuLysTrpValProGlu50CysLeuProLysGlyPro6570TyrGinLeuThrAlaArg85SerMetGluLeuLysPhe100GluAlaPheGlulieVal115MetPheLysAsnAsnTyr130ValGlyGluPhePheThr145150lieAsnValAspAspMet165VallieTyrThrGinLeu180AspI]eAsnGluCysLeu195GlyAsnPheProLysLeuThrAlaCysLeuValValAlaMetLeuLeu1015GinAlaGinProProProProProProAsp2530ArgSerPhePheGinArgLeuGinProGly4045ThrProValProGlySerAspGinVal5560ThrCysCysSerArgLysMetGluGluLys7580LeuAsnMetGluGinLeuLeuGinSerAla9095LeulielieGinAsnAlaAlaValPheGin105110ValArgHisAlaLysAsnTyrThrAsnAla120125ProSerLeuThrProGinAlaPheGluPhe135140AspValSerLeuTyrlieLeuGlySerAsp155160ValAsnGluLeuPheAspSerLeuPhePro170175MetAsnProGlyLeuProAspSerAlaLeu185190ArgGlyAlaArgArgAspLeuLysValPhe200205lieMetThrGinValSerLysSerLeuGin<formula>formulaseeoriginaldocumentpage30</formula>权利要求1.一种用于检测硫酸肝素蛋白多糖3的测试片，其特征在于，所述的测试片包括固相载体；和包被于所述固相载体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位。2.如权利要求l所述的测试片，其特征在于，所述固相载体是酶标反应板。3.—种检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有权利要求1所述的测试片，或者所述的试剂盒含有(a)固相载体；(b)容器a以及位于所述容器a中的作为第一抗体的抗硫酸肝素蛋白多糖3的多克隆抗体，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位；和(c)用于将所述的第一抗体包被于所述固相载体的试剂。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还装载有容器b，所述的容器b中装有第二抗体，所述第二抗体是多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位。5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还装载有容器b'，所述的容器b'中装有第二抗体，所述第二抗体是单克隆抗体，所述单克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3中除第379-393位以外的表位。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体结合于硫酸肝素蛋白多糖3的以下表位硫酸肝素蛋白多糖3第25-358位中的表位；硫酸肝素蛋白多糖3第350-364位中的表位；或硫酸肝素蛋白多糖3第444-516位中的表位。7.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述的第二抗体带有可检测的标记物。8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的可检测的标记物选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶。9.一种体外检测硫酸肝素蛋白多糖3的方法，包括以下步骤(a)将待测样品加样于包被有第一抗体的固相载体，从而使待测样品中的硫酸肝素蛋白多糖3与固相载体上的第一抗体结合，形成带有"硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"二元复合物的固相载体；所述的第一抗体是特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位的多克隆抗体；(b)将第二抗体加样于(a)获得的固相载体，从而形成带有"第二抗体-硫酸肝素蛋白多糖3-第一抗体"三元复合物的固相载体；所述的第二抗体是特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位以外的表位的单克隆抗体或多克隆抗体，且所述的第二抗体携带一可检测标记物；和(c)检测三元复合物中的可检测标记物，从而确定待检测样品中硫酸肝素蛋白多糖3的存在与否以及存在的量。10.—种多克隆抗体，其特征在于，所述的多克隆抗体特异性结合于硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的表位，而不结合于硫酸肝素蛋白多糖3的1-378位或394-580位中的表位，并且所述多克隆抗体通过将硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位蛋白片段免疫动物而获得。全文摘要本发明公开了一种肝癌的检测试剂盒，所述检测试剂盒中含有结合硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位中的抗原表位的多克隆抗体，以及结合硫酸肝素蛋白多糖3第379-393位以外抗原表位的单克隆抗体或多克隆抗体。本发明的试剂盒检测灵敏度高，检测耗时短，有助于尽早地诊断肝癌患者，及时治疗，提高生存率。并且，与仅检测AFP标志物相比，在检测AFP标志物的同时采用本发明的试剂盒检测GPC3标记物可显著提高肝癌的诊断敏感性。文档编号G01N33/53GK101290318SQ20071003956公开日2008年10月22日申请日期2007年4月17日优先权日2007年4月17日发明者伟周,红屠,赵新泰申请人:上海市肿瘤研究所