专利名称：一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法
技术领域：
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种水产品中孔雀石绿的检测方法。
背景技术：
孔雀石绿(Malachite green,简称MG),属三苯曱烷类染料，其代谢 物为无色孔雀石绿(Leucomalachite green, LMG),长期以来，由于孔雀 石绿在水产养殖中具有良好的抗真菌病，水产品保鲜以及价格低廉等优 点，因此，成为许多养殖户青睐的"渔药"来使用，但这两种物质所均具 有高毒素、高残留和高致畸、致突变等副作用，不仅给我国水产品的出口 带来了巨大障碍，而更为重要的是，给人们的健康构成了潜在威胁。
鉴于孔雀石绿及其代谢物的危害性，许多国家都将其列为水产养殖禁 用药物，我国也于2002年5月将其列为《食品动物禁用的兽药及其化合 物清单》中，然而，由于水产养殖户健康养殖的意识淡薄，以及水产品安 全管理机制的不完善等原因，仅2005年，就在国内许多地方(尤其是福 建、江西和浙江)的多种水产品(如鳗鱼、甲鱼等)中检测出孔雀石绿 的高残留。
目前，关于孔雀石绿及其代谢物的检测方法主要有三种，但这些方法 均存在着一定局限性(l)高效液相色谱法，当含量较低时，利用保留时 间很难定性；(2)气质联用法，只能用来对无色孔雀石绿的进行定性；(3) 液质联用法(LC/MS ),效果较好，但价格昂贵；因此，孔雀石绿及其代 谢物在水产动物中快速、稳定可靠残留检测方法的建立成为国内外亟待解 决的技术难题。
但孔雀石绿具有很强的免疫毒性，制备孔雀石绿特异性抗体是一个非常困 难的工作，而且制备一种抗体周期也比较长， 一般需要6个月以上。因此
瓶颈问题。
寡核苷酸适配子技术是近年来发展的一种新型的分子印迹技术，是釆
用SELEX技术体外筛选获得的。SELEX技术由Tuerk和Gold等在90年 代初建立的，通过多轮的选择和扩增过程(PCR或RT-PCR)从随机寡核 苷酸文库中筛选特异识别靶物质的寡核苷酸适配子的组合化学技术，是一 种研究核酸结构与功能的有效方法。SELEX技术自创立以来得到迅猛发 展，目前因其具有库容量大、筛选的适配子的靶分子范围广、亲和力高与 特异性强等优点已在生命科学基础研究、疾病治疗、药物筛选和临床诊断 等领域得到了广泛的探索和运用。
中国发明专利申请200510060995.1中公开了 一种水产品中无色孔雀 石绿间接竟争ELISA检测试剂盒。试剂盒的检测板为包被无色孔雀石绿 与白蛋白偶联物的可拆96孔酶标板，抗无色孔雀石绿抗体为利用无色孔 雀石绿与白蛋白的偶联物免疫小鼠而制备的单克隆抗体，检测样品先经过 匀质后用乙酸乙酯和环己烷进行提取，调节pH值后稀释用于检测。样本 检测的判定标准为以标样浓度的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标的回 归曲线。才艮据每个样品的抑制率就可从曲线上读出相对应样品的浓度。该 方法检测的灵敏度为0.0023吗/ml,检测范围是0.0016-1 (ig/ml。但该技术中高效的单克隆抗体的获得十分困难，也增加了成本。
发明内容
本发明提供一种操作方便，准确度高的水产品中孔雀石绿的快速检测 方法。
一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，将待测样品与孔 雀石绿适配子和带有检测标记物的报告序列混合，报告序列与待测样品中 的孔雀石绿可竟争性地与孔雀石绿适配子结合后，检测(用酶相对的显色 底物检测)4艮告序列上的标记物，计算待测样品中孔雀石绿含量。
所述的检测标记物为辣根过氧化物酶、化学发光基团、化学荧光基团 或胶体金等。
所述的报告序列的制备根据获得的孔雀石绿适配子序列，设计合成 与适配子序列部分(5 ，端回文互补序列)互补的报告序列，将检测标记物 标记在净艮告序列上。
所述的孔雀石绿适配子通过如下步骤制得
(1)构建一个序列长度约为80个碱基的随机ssDNA文库，ssDNA 序列两端带有限制性内切酶位点的固定序列、中间为35个序列随机的碱 基，根据ssDNA序列两端的固定序列设计PCR引物；
(2 )采用不对称PCR法或生物素-链亲和素磁珠法对步骤(1 )得到 的ssDNA文库进行扩增；
(3 )利用孔雀石绿-OVA偶联物包被微孔板介质法或高效毛细管电泳 方法从扩增后的ssDNA文库中进行SELEX筛选，得到与孔雀石绿特异结 合的ssDNA即孔雀石绿适配子。
步骤(2)中所述的不对称PCR法即在PCR扩增循环中引入不同浓 度的引物(一般釆用50: 1-100: l比例的引物浓度)，在最初10-15个循 环中主要产物为双链DNA (dsDNA),但低浓度引物被耗尽后，高浓度引 物介导的PCR反应可产生大量的ssDNA。
步骤(2)中所述的生物素-链亲和素磁珠法即在PCR体系中，设计并 合成下游引物的5，端标记有生物素，以ssDNA文库为模板，进行PCR 扩增可得到3，端带有生物素的dsDNA产物，经分离纯化后与链亲和素 磁珠结合(dsDNA通过3，端的生物素与磁珠上的链亲和素结合)，然后 用 一定浓度(O.15mol/L )的NaOH使dsDNA变性解链，带有生物素的一条 链与链亲和素结合留在磁珠上，而不带生物素的一条链被解离出来，经分 离纯化后用于下一轮筛选，重复上述操作循环富集(一般10次左右)直 至孔雀石绿和适配子的结合率达到90%。
偶联物(MG-OVA ) 96孔酶标板，同时设白蛋白(OVA)包被孔和空白对 照孔，均用3。/。的BSA封闭，PCR扩增与纯化的ssDNA文库先与空白对 照孔反筛去除与BSA结合的ssDNA，再与OVA包被孔初筛去除与OVA 结合的ssDNA,然后转移至孔雀石绿-OVA偶联物包被孔结合，经洗脱、 分离与纯化得到与孔雀石绿特异结合的ssDNA。
步骤(3)中所述的高效毛细管电泳方法即将一定量的PCR扩增、纯 化的ssDNA文库与孔雀石绿孵育后，通过高效毛细管电泳将未结合序列 与孔雀石绿结合复合物分离，收集结合序列，重复上述操作循环富集-分 离最后得到与孔雀石绿特异结合的ssDNA (即孔雀石绿适配子)。
根据本发明所述的快速检测方法，可以将相关试剂封装或固定后制成 试剂盒或快速纟全测试纸。
本发明还提供了用于检测水产品中孔雀石绿的试剂盒，至少包括包被
有孔雀石绿适配子的测试片基(如96孔酶标板或硝酸纤维膜等)，还包括 结合緩冲液，包被緩冲液。
将孔雀石绿适配子包被于测试片基上时，可将连接序列(如3， -ACTCATCTGTGA-5' ) 5，端与孔雀石绿适配子序列3，端连接合成孔雀 石绿适配子-连接序列；设计合成与连接序列互补的固定序列(如 3'-ATGAGTAGACACT-5，)，将固定化基团(如将亲和素固定在NC膜的 表面，再通过亲和素将带有生物素的单连Biotin—ssDNA固定)标记在固 定序列的3，端，通过固定化基团与连接序列将孔雀石绿适配子包被于测试 片基上。
本发明采用 一种不依赖实验动物的适配子(aptamer)技术，通过指数 级冨集酉己体的系统进4匕4支术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX )体外筛选到高亲和性特异识别孔雀石绿的适配子， 替代传统免疫学方法中的抗体来建立一种快速^^测孔雀石绿方法。
本发明4企测方法优点为
1. 筛选周期短3周；
2. 与孔雀石绿结合的特异性强，灵敏度高；
3. 适配子的合成周期短，利于大规模生产；
4. 检测试剂稳定性强，变性后容易复性，利于运输、储存。 根据本发明方法研制的试剂盒与快速检测试纸，能较好满足目前对水
产品孔雀石绿残留检测的迫切需要，用于海关检测，食品卫生部门检测， 易于大范围推广应用。
图1为孔雀石绿适配子制备及孔雀石绿检测方法流程示意图； 图2为孔雀石绿适配子固定示意图； 图3为孔雀石绿适配子竟争检测适宜具体实施方式
孔雀石绿适配子的制备
(1 )构建一个序列长度约为80 (范围75 ~90)个碱基的随机ssDNA 文库，ssDNA序列两端带有限制性内切酶位点的固定序列，所述的ssDNA 序歹'J为(5，ATAGAGCTCATGGAGTCTCCCTCGG-(N35)-TTTGGAT CCGGCAGTGGTGGGCGGGC3，)、中间为35个序列随机的碱基(N35)， 根据ssDNA序列两端的固定序列设计PCR引物； 上游引物5，-ATAGAGCTCATGGAGTCTCC陽3,, 下游引物5 ， -GCCCGCCCACCACTGCCGG-3' (2 )釆用不对称PCR法对步骤(1 )得到的ssDNA文库进行扩增。 不对称PCR法#:作过程为
在PCR扩增循环中引入不同浓度的引物(一般采用50: 1-100: l比 例的引物浓度)，在最初10-15个循环中主要产物为双链DNA (dsDNA), 但低浓度引物被耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应可产生大量的 ssDNA。 PCR反应体系dsDNA模板2W, IOXPCR緩冲液l(M， MgCl26W, dNTPslOOPmol/L, Tag酶2W，上游引物60pmo1,下游引物lpmol，加去 离子水至100W 。 PCR反应条件94 °C变性5min ，然后40循环94 °C变性 30 s， 65。C退火lmin， 72 。C延伸2min,最后72°C 10 min。
也可以采用生物素-链亲和素磁珠法对步骤(1)得到的ssDNA文库 进行扩增。
生物素-链亲和素;兹珠法操作过程为
在PCR体系中，设计并合成下游引物的5，端标记有生物素，以ssDNA 文库为模板，进行PCR扩增可得到3，端带有生物素的dsDNA产物，经 分离纯化后与链亲和素磁珠结合(dsDNA通过3，端的生物素与磁珠上的 链亲和素结合)，然后用一定浓度(0.15mol/L)的NaOH使dsDNA变性 解链,带有生物素的一条链与链亲和素结合留在磁珠上，而不带生物素的一 条链被解离出来，将ssDNA溶解于20ulTE緩沖液中，测定吸光度(A)值， 经分离纯化可用于下一轮筛选，重复上述操作循环富集( 一般10次左右) 直至孔雀石绿和适配子的结合率达到90% 。
(3 )利用孔雀石绿-OVA偶联物包被微孔板介质法从扩增后的ssDNA 文库中进行SELEX篩选，得到与孔雀石绿特异结合的ssDNA即孔雀石绿
适配子。
孔雀石绿-OVA偶联物包被微孔板介质法操作过程为 将MG-OVA蛋白包被于酶联板上，4T过夜，包被液为0.05mol/L NaHC03， pH9.6的緩冲液，同时设空白对照。C蛋白包被孔和空白对照孔 均以3。/。BSA37。C封闭2h。随机ssDNA文库和一定量的tRNA先在结合緩 冲液SHCMK液(20mmol/L Hepes pH 7.3 5 ， 120mmol/L NaCl ， 5mmol/L KC1 ， 1 mmol/L CaCl2, 1 mmol/L MgCl2)中与经3%BSA封闭的空白对 照孔37°C结合40min。用緩沖洗液洗(SHAMK液+0.05Q/。吐温20 ) 6次)， 洗去未结合的ssDNA，再加洗脱緩冲液(20mmol/L Tris-HCl, 4mol/L异 硫氰酸胍，lmmol/LDDT, pH8.3)于8(TC作用10min,洗脱下与C蛋白 结合的ssDNA,经酚-氯仿抽提、乙醇沉淀，将ssDNA溶解于20^1 TE 緩冲液中。将ssDNA用标记生物素的引物经PCR扩增成一端带生物素 的dsDNA，经生物素-链亲和素磁珠分离ssDNA,用作下一轮筛选的ssDNA 文库。重复上述操作循环富集-分离最后得到与孔雀石绿特异结合的 ssDNA。
也可以利用高效毛细管电泳方法乂人扩增后的ssDNA文库中进行 SELEX筛选，得到与孔雀石绿特异结合的ssDNA即孔雀石绿适配子。 高效毛细管电泳方法才喿作过程为
将一定量的PCR扩增、纯化的ssDNA文库与孔雀石绿孵育后，通过 高效毛细管电泳将未结合序列与孔雀石绿结合复合物分离，收集结合序列 可用于下一轮筛选。
进行SELEX篩选得到时孔雀石绿适配子使用的相关试剂在詹林盛的 文章"随机单链DNA文库SELEX筛选寡核苷酸适配子方法的建立"(《生 物化学与生物物理进展》2003 30巻(1 ) 151 ~ 155 )中均有公开。
经过以上步骤的筛选和测序，得到了以下几个高特异结合序列(即孔 雀石绿适配子)
5 ，-GTACAAAAAAGTTGGCCTTTAAGACAATCGTTGTGAA匿3' 5 ，-CTGAAAGAAACTAAAATCTCATGGCGACGACGTCGAC-3' 5 ，-ATTAGAAAATGGCAGAACAGAAACAAATGGAAGTGGT-3'
检测水产品中孔雀石绿的试剂盒
将孔雀石绿适配子包被于测试片基上时，可将连接序列5，端(3， -ACTCATCTGTGA-5')与孔雀石绿适配子序列3，端连接合成孔雀石绿 适配子-连接序列；设计合成与连接序列互补的固定序列 (3，-ATGAGTAGACACT-5，)，将固定化基团(如生物素)标记在固定序
被于测试片基上。
水产品中孔雀石绿的检测
50pmol 5'端标记[Y-32P]ATP的孔雀石绿适配子与l|imol/L孔雀石绿 (标样)在结合緩沖液中37。C作用40min后，抽滤于硝酸纤维膜上，用 5ml结合緩冲液沖洗后，将膜烤干，取下至于闪烁杯中，加PPO-POPOP-二甲苯液3ml，用BeckmanLS液体闪烁仪测定其放射性，经计算孔雀石 绿适配子与孔雀石绿结合百分率为90% 。解离常数在50pmol/L。
将水产品(检测样品)先经过勻质后用乙酸乙酯和环己烷进行提取， 调节pH值后稀释后与50pmo1 5，端标记[Y-32P]ATP的孔雀石绿适配子在结 合缓冲液中37。C作用40min后，抽滤于硝酸纤维膜上，用5ml结合緩沖 液冲洗后，将膜烤干，取下至于闪烁杯中，力。PPO-POPOP-二曱苯液3ml， 用BeckmanLS液体闪烁仪测定其放射性，乘以系数卯％ (通过上步孔雀 石绿适配子与孔雀石绿标样的结合测得)即得到该样品种的孔雀石绿含 量。图2，和图3示意了孔雀石绿适配子竟争检测的原理。图2中总共有
特异性结合能力的适配子序列，其两端据有回文互补结构；上部5，端是设 计合成的连接序列；下部3，端是跟连接序列互补的固定化序列，这部分序 列的碱基已经被生物素化，可固定在96孔板或硝酸纤维膜上；下部5，端 的序列是报告序列，该序列是酶联修饰的，负责l艮告显色。在没有孔雀石 绿的状态下，这部分序列的5'端是跟适配子的5'端回文互补序列互补结合 的。在图3所示的状态下，环境中有了孔雀石绿，适配子因结合了孔雀石 绿，构象为之改变，3，与5'端回文互补序列自结合，同报告序列形成竟争， 报告序列随之脱落。经过洗脱，显色的步骤，通过与对照的对比就可以看 出，待测物中孔雀石绿的含量。
权利要求
1、一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，将待测样品与孔雀石绿适配子和带有检测标记物的报告序列混合，报告序列与待测样品中的孔雀石绿可竞争性地与孔雀石绿适配子结合后，检测报告序列上的标记物，计算待测样品中孔雀石绿含量；所述的检测标记物为辣根过氧化物酶、化学发光基团、化学荧光基团或胶体金等；所述的报告序列与孔雀石绿适配子序列部分互补。
2、 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的孔雀石绿适配子 通过如下步骤制得(1)构建一个序列长度约为80个碱基的随机ssDNA文库，ssDNA 序列两端带有限制性内切酶位点的固定序列、中间为35个序列随机的碱 基，根据ssDNA序列两端的固定序列设计PCR引物；(2 )采用不对称PCR法或生物素-链亲和素磁珠法对步骤(1 )得到 的ssDNA文库进4亍扩增；(3 )利用孔雀石绿-OVA偶联物包被微孔板介质法或高效毛细管电泳 方法从扩增后的ssDNA文库中进行SELEX筛选，得到与孔雀石绿特异结 合的ssDNA即孔雀石绿适配子。
3、 一种^^测水产品中孔雀石绿的试剂盒，包括测试片基，其特征在 于所述的测试片基上包被有孔雀石绿适配子。
4、 如权利要求3所述的试剂盒其特征在于将孔雀石绿适配子包被 于测试片基上时，将连接序列5，端与孔雀石绿适配子序列3，端连接合 成孔雀石绿适配子-连接序列；设计合成与连接序列互补的固定序列，将 固定化基团标记在固定序列的3，端，通过固定序列与连接序列的结合将孔 雀石绿适配子包被于测试片基上。
全文摘要
本发明公开了一种利用适配子快速检测水产品中孔雀石绿的方法，将待测样品与孔雀石绿适配子和带有检测标记物的报告序列混合，报告序列与待测样品中的孔雀石绿可竞争性地与孔雀石绿适配子结合后，检测报告序列上的标记物，计算待测样品中孔雀石绿含量。根据本发明方法研制的试剂盒与快速检测试纸，能较好满足目前对水产品孔雀石绿残留检测的迫切需要，用于海关检测，食品卫生部门检测，易于大范围推广应用。
文档编号G01N33/52GK101358963SQ20071007038
公开日2009年2月4日 申请日期2007年8月1日 优先权日2007年8月1日
发明者军 刘, 张明洲, 灵 方, 王墨染, 胡华军, 军 黄 申请人:中国计量学院;杭州宝派生物科技有限公司