专利名称：：一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置的制作方法
技术领域：
：本实用新型涉及一种能快速检测到口腔液体中乙肝病毒标志物，并可同时检测多项指标的乙肝抗原和抗体的装置。
背景技术：
：目前检测口腔液体中乙型肝炎病毒(以下简称乙肝)标志物-抗原和抗体，多为实验研究人员所用，医学临床上尚未见有应用的报道。采用的方法为酶联免疫吸附法(Elisa)，修改Elisa和放射免疫法(RIA)。这些方法需要复杂的仪器设备，操作步骤繁锁，需要专业人员操作，花费贵，时间长，结果通常需等数小时到数天，而且R1A法中放射性物质对环境有污染。口腔液体不像血液标本，是低容量分泌，其中有高浓度的粘蛋白和其它粘性成分，故现有的检测血液标本中的乙肝病毒标志物的快速免疫层析试纸法(如金标法)，不适合应用于口腔液体标本的检测。亦未见有类似的报道和应用。因此，开发一种口腔液体中乙肝标志物的快速检测装置具有重要意义，这不仅是快速诊断的需要，而且对于指导和帮助乙肝病人的诊治，愈后以及预防该传染病方面将大有益处。
发明内容本实用新型的目的是针对上述现状，旨在提供一种能快速检测到口腔液体中乙肝病毒标志物，并可同时检测多项指标的乙肝抗原和抗体的一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置。本实用新型目的的实现方式为，一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，由口腔液体收集部分外盖1和叠合在一起的试纸条外壳上层4、试纸条6及试纸条外壳下屋5组成，试纸条外壳上层4由试纸条外壳上层支架9支撑，其上有口腔液体样本槽3、反应和结果观察窗7、手持部位8;试纸条6上有口腔液体收集垫2、抗原金标垫IO、抗体金标垫ll，抗原指示线12、抗体指示线13、抗原检测1区16、抗原检测2区17、抗体检测1区18、抗体检测2区19、抗体检测3区20、抗原对照线14、抗体对照线15、抗原吸收垫21、抗体吸收垫22和试纸条抗原抗体中央隔23;试纸条外壳下层5上有试纸条外壳下层中央隔24。使用本实用新型时，抗原金标垫10设定为金标抗S和金标抗e混合物(夹心法)，或金标记HBsAg和金标HBeAg混合物(竟争法)，抗体金标垫ll为金标SPA或抗人IgG抗体，还可以是金标HBsAg，HBeAg和HBcAg(双抗原夹心法或竟争法)，或应用己知浓度的金标抗体一抗S,抗e和抗c(竟争法)。抗原检测1区16、抗原检测2区17分别为另一抗S，抗e固定于膜上，当样本中有相应抗原存在时，抗原，金标抗体，膜上抗体形成复合物，出现红色线条为阳性(双抗体夹心法)。也可以用己知浓度的抗原与待检样本中的抗原竞争结合膜上的固相抗体(竟争法)，则红色线条消失为阳性。抗体检测1区18、抗体检测2区19、抗体检测3区20检测抗体时，分别用抗原(HBsAg,HBeAg，HBcAg)点膜形成固相抗原，当金标垫是SPA，抗人IgG抗体或者是金标相应抗原时，若被测抗体存在时则形成复合物，出现红色线条表示阳性。如果为竟争法，18、19、20分别为抗s，抗e，抗c固定于膜上为捕获抗体，金标垫则是金标抗原(HBsAg，HBeAg，HBcAg)，当待测抗体存在时，与膜上捕获抗体竞争结合相应金标抗原，结果红色线条消失为阳性，表明存在有待检抗体。竞争法中也可以采用金标乙肝抗体。试纸条6中引用生物素以及亲和素，如生物素一链霉亲和素或生物素一亲和素，金标垫是金标抗S和金标抗e混合物时(夹心法)，预先用链霉亲和素点膜抗原检测区16、17，膜干后直接用生物素化抗S，抗e划线于链霉亲和素上，以检测相应抗原；同样的原理来检测抗体(如竞争法)，预先用链霉亲和素点膜抗体检测区18、19、20，等膜干后可以用生物素化抗S，抗e，抗c直接放于链霉亲和素上，其余同前，结果观察红色线条消失为阳性。另可采用链霉亲和素为膜上捕获线16、17、18、19、20，将待测样本先与生物素化抗S、抗e和抗c反应，再通过金标垫等后续反应，结果观察同上。生物素以及亲和素信号放大系统也适合于标记的配体与固相膜上的抗原，抗体的不同组合。本实用新型包括口腔液体样本收集部分和反应，结果观察部分，前者既可以直接放入口腔中，将口腔液体收集垫2置于牙龈组织处收集口腔液体(收集0MT);也可以通过配备单独的口腔液体收集器来釆集，所收集的口腔液体作为待检样品加入样本槽3检测。上述口腔液体多为口腔粘膜漏出液(OralMucosalTransudate,OMT)，它有着来自血浆中丰富的免疫球蛋白和细胞成份；后者为抗原，抗^l^反应和结果观察部分。本实用新型利用免疫学抗原抗体原理，以免疫层析试纸法(金标法)和科学采集口腔液体样本为基础，能快速检测到口腔液体中乙肝病毒标志物，并可同时检测多项指标的乙肝抗原和抗体。具有高度灵敏性、特异性、快速和简便等优点。图1是本实用新型结构示意图图2是试纸条外壳上层结构示意图图3是试纸条结构示意图图4是试纸条外壳下层结构示意图具体实施方式参照图l，本实用新型由口腔液体收集部分外盖l和叠合在一起的试纸条外壳上层4、试纸条6及试纸条外壳下层5组成。参照图2，试纸条外壳上层4由试纸条外壳上层支架9支撑，其上有口腔液体样本槽3、反应和结果观察窗7、手持部位8。样本槽3在金标垫抗原金标垫10、抗体金标垫ll上方。此样本槽内的样本垫由纤维素滤纸和玻璃纤维盐垫组成。参照图3，试纸条6上有口腔液体收集垫2、抗原金标垫IO、抗体金标垫ll、抗原指示线12、抗体指示线13、抗原检测1区16、抗原检测2区17、抗体检测1区18、抗体检测2区19、抗体检测3区20、抗原对照线14、抗体对照线15、抗原吸收垫21、抗体吸收垫22和试纸条抗原抗体中央隔23。口腔液体收集垫2为纤维素滤纸盐垫。参照图4，试纸条外壳下层5上有试纸条外壳下层中央隔24。使用本实用新型时，抗原金标垫10设定为金标抗S和金标抗e混合物(夹心法)，或金标记HBsAg和金标HBeAg混合物(竟争法)，抗体金标垫ll为金标SPA或抗人IgG抗体，还可以是金标HBsAg，HBeAg和HBcAg(双抗原夹心法或竟争法)，或应用己知浓度的金标抗体一抗S，抗e和抗c(竟争法〉。抗原检测1区16、抗原检测2区17分别,为另一抗S，抗e固定于膜上，当样本中有相应抗原存在时，抗原、金标抗体、膜上抗体形成复合物，出现红色线条为阳性(双抗体夹心法)。也可以用己知浓度的抗原与待检样本中的抗原竞争结合膜上的固相抗体(竟争法)，则红色线条消失为阳性。抗体检测1区1,8、抗体检测2区19、抗体检测3区20检测抗体时，分别用抗原(HBsAg，HBeAg，HBcAg)点膜形成固相抗原，当金标垫是SPA，抗人IgG抗体或者是金标相应坑原时，若被测抗体存在时则形成复合物，出现红色线条表示阳性。如果为竟争法,抗体检测l、2、3区18、19、20分别为抗s，抗e，抗c固定于膜上为捕获抗体，金标垫则是金标抗原(HBsAg,HBeAg，HBcAg)，当待测抗体存在时，与膜上捕获抗体竞争结合相应金标抗原，结果红色线条消失为阳性，表明存在有待检抗体。竞争法中也可以采用金标乙肝抗体。试纸条6中引用生物素以及亲和素，如生物素一链霉亲和素或生物素--亲和素，金标垫是金标抗S和金标抗e混合物时(夹心法)，预先用链霉亲和素点膜抗原检测l、2区16、17。膜干后直接用生物素化抗S,抗e划线于链霉亲和素上，以检测相应抗原。同样的原理来检测抗体(如竞争法)，预先用链霉亲和素点膜抗体检测l、2、3区18、19、20，等膜干后可以用生物素化抗S，抗e，抗c直接放于链霉亲和素上，其余同前，结果观察红色线条消失为阳性。另可采用链霉亲和素为膜上捕获线16、17、18、19、20，将待测样本先与生物素化抗S、抗e和抗c反应，再通过金标垫等后续反应，结果观察同上。生物素以及亲和素信号放大系统也适合于标记的配体与固相膜上的抗原，抗体的不同组合。本实用新型中样本移动方向从左至右，当口腔液体达到抗原指示线12、抗体指示线13时，指示线颜色由蓝色变为粉红色，表明成功地收集到口腔液体。抗原对照线14、抗体对照线15分别为抗鼠IgG抗体(夹心法)和抗人lgG抗体。或者通过口腔液体收集器收集口腔液体后，作为待检样品加入样本槽3检测，此样本槽内的样本垫由纤维素滤纸和玻璃纤维盐垫组成，其它检测和结果观察同前。将本实用新型的试纸条6对折，其它部份作相应改动,试纸条变为正反两面，口腔液体收集垫2变成两个，共同放入口腔中收集口腔液体，正面査抗原，反面查抗体。本实用新型可直接査口腔液体中单项乙肝标志物，分别为HbsAg、HbeAg、HbeAb、KbsAb、HbcAb，也可以同时查HBcAblgG和IgM。既可以是并列形式，也可以是正反两面双层形式，正面査IgG、反面査IgM,还可以延伸査presl抗原、抗体和査pres2抗原、抗体。本实用新型包括口腔液体样本收集部分和反应，结果观察部分，前者既可以直接放入口腔中，将口腔液体收集垫2置于牙龈组织处收集口腔液体(收集0MT);也可以通过配备单独的口腔液体收集器来采集，所收集的口腔液体多为口腔粘膜漏出液(OralMucosalTransudate,OMT)，它有着来自血浆中丰富的免疫球蛋白和细胞成份；后者为抗原，抗体反应和结果观察部分。下面举例详述本实用新型参照Millipore's开发免疫层析试纸指导手册(第二版)，固相膜采用该公司产品，40nm胶体金购自BBI公司，乙肝抗原(HbsAg、HbeAg、能cAg),鼠单克隆抗s、抗e、抗c购自Fitzgerald公司，另一鼠单克隆抗s、抗e(固相膜上抗s、抗e)购自北京四环生物公司，牛血清白蛋白(BSA)、葡萄球菌A蛋白、biotin-N-hydroxy-Succinimideester、羊抗鼠IgG抗体、羊抗人IgG抗体(Sigma公司产品)、待测乙肝标志物(HbsAg、HbeAg、抗s、抗e、抗c)购自卫生部临床检验中心。例l:采用RothJ方法制备鼠单克隆抗s、抗e的胶体金标记，玻璃纤维膜垫预先用牛血清白蛋白(BSA)处理，再制备金标抗s、抗e混合金标垫，放置入抗原金标垫10处。另一鼠单克隆抗s，抗e点膜于抗原检测l区16、抗原检测2区17处，抗原对照线14、抗体对照线15为羊抗鼠IgG抗体和抗人IgG抗体。抗原指示线12、抗体指示线13，指示剂为CaS04。金标葡萄球菌A蛋白(40nra)放置抗体金标垫ll处。在固相膜上点HbsAg、HBeAg和HbcAg，形成抗体检测1区18、抗体检测2区19、抗体检测3区20。口腔液体收集垫2为纤维素滤纸盐垫，即将多层纤维素滤纸浸泡于O.85WNaCl和l免BSA中片刻取出，垫干37'C，30分钟，配用。按图l组装各部分。检测乙肝标志物将待检的不同浓度乙肝标志物与正常人口腔液体混匀后，通过本实用新型检测，结果在检测线和对照线条处同时出现红色线条为阳性，无红色线条出现或仅一条红色(对照线)线条出现为阴性。结果观察不超过30分钟。本实用新型成功地检测到上述标志物，其中测得的最低浓度HbsAg为3ng/ml，HbsAb为30mlv/ml，HbeAg为2NCU/ml，HbeAb为4NCU/ml，HbcAb为2NCU/ml。例2:1)分别准备抗s、抗e和抗c—生物素结合物，采用biotin—N—hydroxySuccinimideester结合。2)准备乙肝抗原检测金标垫(抗s，抗e混合)准备同前例l,捕获区膜用链霉亲和素6mg/ml在Trisbutfer中点膜于抗原检测l区16、抗原检测2区17，待干后，生物素化单克隆抗s、抗e(1.0mg/ml)分别直接点于链霉亲和素上。其余步骤同例l，对照为羊抗鼠IgG抗体。3)准备乙肝抗体检测(竞争法)首先制备HBsAg、HBeAg和HBcAg混合金标垫，类似上述先用链霉亲和素在形成抗体检测1区18、抗体检测2区19、抗体检测3区20上点膜，再用步骤l准备生物素化抗s，抗e和抗c，直接于链霉亲和素上，组装各部分。对照为金标抗人IgG抗体。按图l组装各部分。4)测试标本将待测的各种不同浓度的乙肝标志物混匀于正常人口腔液体。结果观察，抗原部分(抗原检测线)有红色线条为阳性，查抗体部分(抗体检测线)红色线条消失为阳性。本例不仅成功检测到乙肝标志物,而且敏感性较例1明显提高，其中测得的最低浓度为HbsAg为lng/ml，HbsAb为10mlv/ml，HbeAg为lNCU/ml，HbeAb为2NCU/ml，HbcAb为lNCU/ml。另与酶联免疫吸附法(Elisa)比较，检测上述测试标本，二者阳性结果见下表<table>complextableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>从表中可见，两者检测结果基本相同。权利要求1、一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，其特征在于由口腔液体收集部分外盖(1)和叠合在一起的试纸条外壳上层(4)、试纸条(6)及试纸条外壳下层(5)组成，试纸条外壳上层(4)由试纸条外壳上层支架(9)支撑，其上有口腔液体样本槽(3)、反应和结果观察窗(7)、手持部位(8)；试纸条(6)上有口腔液体收集垫(2)、抗原金标垫(10)、抗体金标垫(11)、抗原指示线(12)、抗体指示线(13)、抗原检测1区(16)、抗原检测2区(17)、抗体检测1区(18)、抗体检测2区(19)、抗体检测3区(20)、抗原对照线(14)、抗体对照线(15)、抗原吸收垫(21)、抗体吸收垫(22)和试纸条抗原抗体中央隔(23)；试纸条外壳下层(5)上有试纸条外壳下层中央隔(24)。2、根据权利要求l所述的一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，其特征在于口腔液体收集垫(2)为纤维素滤纸盐垫。3、根据权利要求l所述的一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，其特征在于口腔液体样本槽(3)内的样本垫由纤维素滤纸和玻璃纤维盐垫组成。4、根据权利要求l所述的一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，其特征在于试纸条(6)中引用生物素以及亲和素，如生物素--链霉亲和素或生物素--亲和素。5、根据权利要求l所述的一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，其特征在于将叠合在一起的试纸条外壳上层(4)、试纸条(6)及试纸条外壳下层(5)对折。专利摘要一种口腔液体中乙肝病毒标志物的检测装置，涉及一种能快速检测口腔液体中乙肝病毒标志物的装置。由口腔液体收集部分外盖和叠合在一起的试纸条外壳上层、试纸条及试纸条外壳下层组成。本实用新型包括口腔液体样本收集部分和反应、结果观察部分，前者既可直接放入口腔中采集口腔液体或通过收集器完成，后者为抗原、抗体反应和结果观察部分。当收集的口腔液体中如有相应抗原存在，抗原，金标抗体，膜上抗体形成复合物，红色线条出现为阳性(夹心法)。同理可测相应抗体。或用竞争法测抗原、抗体。而且结合生物素、亲和素信号放大系统后，使样本检测敏感性明显提高。本实用新型能快速、简便检测口腔液体中乙肝病毒标志物，具有高度灵敏性和特异性。文档编号G01N33/576GK201075109SQ20072008720公开日2008年6月18日申请日期2007年9月21日优先权日2007年9月21日发明者马北峰,马北阳申请人:马北峰