专利名称：微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因鹏检测施，具糊用环介导纖广增(LAMP)技术与纳米硫化铅标己基因序列电化学分析S^ffl检测转基因^^卜M因(CP4EPSPS) 6<]^法~~l:孑Lfe固定与纳米硫化铅硫电化雜测转基因烦的方法。
技术背景蹄来，转基因植鹏絲的榊直面积3ffiS增长，主导的转基因旭^^^ 因作物的63%以 上，所有的转基因烦均为Sm草剂旭，mf^t^甘l^基因旭。该品系烦的外源蛋白为CP4 EPSPS,可以有效的,除草齐瞎甘膦，而经动物实飽正实对人畜无害。在中国的转基因检测的国家标 准中，确^ffi^测CP4EPSPS基因列为筛;^因。fM^现有^^测方法都^S于鄉拥fi^的PCR或 者荧光PCRfe^的，没有4顿环介导^a扩增技^^测CP4EPSPS基因的，也没剤拂环介导^^" 增狱与纳斜射己电化学分析^^OT检测CP4EPSPS基因附艮导。现有的方法雜检测赫高、耗时 长纖点。 发明内容本发明的目的^M^纳米硫化铅标d^W^^列微 UK^交电化学分析与环介导^M扩增糊检测转基因，HiS因cP4EPSPS的方S^孑版固定与纳米硫化铅禾射己电化^^测转基因m以划艮现有S7lt的Jd^缺点，从而为转基因产品的检测M^，行的方法。本发明的錢原鹏(1) ^^设it"^且可以i湖鹏DNA六个不同序列的两个内引物(上游内引 物和下游内弓嫩)和两个外弓鹏(上微卜引物和下微卜弓卿)，内引t^含耙DNA的JEX链和反义紘(2)其中一个内引牧虔先和耙DNA杂交，te的MB换DNA合^具有高度,换活性的DNA聚 娜的参与下由一个外引物启动，释放出单链DNA,荆乍为由杂效U耙的另一端的—内引物和一个外 引物启动的DNA合礙鎌，产生一个原始的新DNA; (3)内弓物以原始執DNAf^fc启繊 置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一，的由两倍茎M的，DNA; (4)在^^劍牛 下，内引物以莲环DNA为禾莫板，fflam^^成多^^WlGDNASfiJ^列的，DNA，在一小时内 该循环^^ f鞭DNA累积Slj 10^拷贝。LAMP^r增的J^t^微孑Lfei:固定后与纳米硫化铅feia的 徽序列姓舒杂^aS而结合，利用鹏躲效链DNA掘微子溶解后翻高灵敏的电化学 分t^^测定溶解的^a离子，产生的电化学分析信号与LAMP^T增 ^tl相关，进而超0^^测转 基因±^卜源基因(CP4EPSPS)的电化^1i测的目的。本发明涉及的环介导^r增翻检测转基因旭，扩增飄在棘乙纖 版固定，纳米硫化铅标B^雜,列电化学分析lW^法，其中的淑l泡括如下(1) - (4): (1)环介导織广增(LAMP)鹏瓶 包括lOxThomopd鹏缓冲液、300—500Mmol/LdNTP、 2—4mmol/L硫,、0.8—1.2pmol上游内 弓胸、0.8—1.2nmol/L下游内弓嫩、0.2-03nmo]/L上黻卜弓胸、0_2—0.3Mmol/L下微卜弓胸和1—1.5 mol/L 甜魏；1U/mLUNG酷；其中10xltemopoiaSM冲液含有200mmol/LpH8.8的三P強甲基錢甲烷 —盐酸、100 mmol/L氯化钾、100mmol/L硫^^、 20 mmo!/L硫lg^和1 %曲繊X—100;其中，上游内弓嫩5-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGACACC-3、 下游内引物5-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3、 上微卜弓胸5"CCATGGGCGCCAGGAT-3 、 下微卜引物5-ATCGGGCGCnTGTGAG-3;(2) BstDNA聚鲷8U4iL; 上面M^环介导^S扩增SiS液每管23iiL的最^a^为2.5jiL 10xTheimopol^iM爰冲液、l.O^LlOmmol/LdNTP (四种脱ftf亥塘核酸的混溯)、1.0pL20Mmol/L上游内弓胸(FIP)、 1.0nL20nmol/L下 游内引物(BIP)、 0.25ML20^imol/L上微卜引物(F3)、 0.25nL20Mmol/L下微卜引物(B3)、 0.5|4L 100mmol/L MgS04、 12.5pL2MSW^4pLddH20 (灭菌双蒸冰)。(3) 转基因掛卜源基因CP4EPSPS^f序列的纳米硫化铅(PbS) —^f十序歹!fei己液，其帝恪 施如下将8.(M3.0 mL M乙,口到50.0 mL浓度为0.2-0.5 mmol/L的Pb(NQ3)2溶液中混合均匀，用0.44).6 md/L NaOH溶液调节混合液的pH值约为7，通氮气線20^ 45min后，在勸^^禾nE气微下向上 述混合液中缓厦滴加1.2-1.6 mmol/L的Na2S溶液30.0 mL。滴加完毕后，^l#2( 0h，混合^m 地 ^色，即得到纳米PbS溶胶。取5.0mL纳米PbS溶M心纯化，水te分散于2,0mL水中，加 入100nL40.歸.0mmol/L乙教3-二甲基氨^)^二3El^fc^fe (EDC)、 100 40.0~60.0 mmol/L N-，5MJ6SBa安(NHS)及0.1mmol/LssDNA^f序列(5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3')，室温下 15-20 h， i^S/S鹏10000 r/minT^心2040 min，用PBS溶液洗涤多次，再分散于PBS溶液中，f穀廿 含有硫徽序列的纳米PbS-徽序列硫液，于-2 下保存。^fflJJ^溶液检测扩增品系为GTS 4(W-2的转基因，卜源基因CP4 EPSPS，依次包括下列步骤(l) -(4):(1) 待检样品DNA鹏取4顿样品核酸，提取方法不限定，只要會^f呆ffi^取的DNAOI 26028o會鹏超iJl.6"2.0即可， 至Ul(M00ng/ml即可以。(2) 进俩介导^^增:鹏A_ ^W23MLLAMP鹏液的鹏管中力B入lpL待检样品赚DNA，和0.5nL的UNG瓶于 恒温95 。C體3—5 min，立即置于冰上1 —3 min;B. 在ffi管中加入lnLBstDNA聚，；C. 于直温60—65。C體45 —90min;D. 将鹏调到80—95。C，鹏3—5min后中ibaM穀i」环介导^T增鹏的转基因;^卜麟 因(CP4EPSPS)双链目标靜U的扩增T^，取出待用。(3) J^^链目标序列鑭早附寻的单链目标序列与纳米CdS—^ft序滩斜己液中的feiBMt"序列微将J^X链目标序列在100 。C7K浴中煮沸10min，然Jg在冰浴中'K^4卩得到单链目标序列,取100 ML单链目标序列W^SM微孑版中，37T孵育过夜，再于60t千燥箱中0.5-1.5 h蒸干，用PBST清 鹏去其中未固定的单链目标序列；再取100nL ^fei鹏序列的纳米PbS—^m"序列fei己^S微 版中，并且在45"C7]Ci^^交2(M0min，得至lJ杂^t/双链DNA，取出该微孑画PBST、 PBS和7乂各冲 洗5次，每次一射中，以清洗除去除去未杂交的丰新己Mf序列，即得到固定了杂^^双链DNA时微 孑版。(4)电化翔啶将固定了杂^tl双链DNA时微孔板中残留的溶鹏出后取100 mL 1.0 mol/l的5^^^ffiA各 孑L，静置5min，氧化溶解杂^tl双链DNA上的纳米PbS，然后注入20ML5.0mol/LNaOH调节溶液 的pH值。翻同位線阳极溶出伏安法检测溶解的Pb2+的缝取150 pLpH4.5-5.0含1.8xl04mol/L Hg^的NaOAoHOAc加入微孔板中，以微孔为电,，以玻碳电极为工作电极，在-1.4 V下沉积 12(M80s，静止58后从-1.2丫向~0.6丫溶出扫描，在4).84V处出现的阳极溶出峰电流即为测量信号，该 信号即为转基因，卜源基因(CP4EPSPS)的响应信号，荆乍为环介导^T增嶺 l^^M米电化 ^^测转基因^的 ,进行同位 阳极溶出伏安齒，的电化学工作站的其它#^ 如下电 位增量0.003"a005V,振幅a03"0.05V，脉冲鹏0.则.07s，采样離0.02s，脉冲周期a2s。
具体实施方式
下列^ffi例进"i^兑明本发明，但不应当作对本发明的限制。 鄉例l按照下歹舰方制條基因爆鹏因CP4 EPSPS微糊的纳米CdS—微序歹臓瓶(1) 将11.0 nL巯遂乙働瞎U 50.0 mL浓度为0.4 mmo]/L的PbCNQ^溶液中混合均匀，用0.5咖]/L NaOH溶液调节混合液的pH^^勺为7，通氮气線30 min后，在磁力ffl^下和氮气微下向J^&混合 液中缓侵滴加1.5 mmol/L的N&S溶液30.0 mL。滴加完毕后，^P^24h，混合^liffi^g^色。 跡法希恪的纳米PbS具有舰的稳定性。(2) 取5.0mL纳米PbS溶麟心纯化，水ffi分散于2.0mLzK中，加入100mL50.0mmd/LEDC、 100 HL50.0 mmol/LNHS及0.1 mmol/L微序列，室温下鹏18 h，该S/S鹏l画r/minTM心30min， 用PBS溶液洗涤多次，再分散于PBS溶液中，得至晗有标Smt"序列的纳米PbS—撤序列标己液，于 陽2T下保機用。按照以1 謝翻(1) ^S分离蛋白样品DNA的提取{顿GBT 19495.3-2004方^^取样品的DNA。(2) 进行转基因烦EPSPS基因环介导離扩增破a. 23 nLLAMP ^Z液a的Ri^管中加入1 mL待检微dna，和0.5 的ung酶，于直 ^7jC浴上50。C腿3min， 95。C艘5min,立即置于冰上lmin;B. 在鹏管中力口入1 pL Bst DNA聚合酶；C. 于直M7jC浴上65 。C腿1小时；D. 将7jC浴调到80。C， a^3min后中jha^薛杯介导^a扩增皿的转基因;^卜MS因(CP4 EPSPS)双链目标序列^T增，，取出待用。(3)微孑,交电化雜测将i^i链目标序列在100 。C水浴中蕭弗10min，然后在冰浴中'|^1辦卩得到单链目标序列，取1007ML单链目标序列的溶^S微孑版中，37 ^孵育过夜，再于60T干燥箱中lh蒸干，用PBST清鹏去其中未固定的单链目标序列；再取iooml ^^lamf序列的纳米Pbs—撤序列iH己輕微孑版中，并且在45^ 7jC^V交30min，得至U杂^tl双链DNA，取出^^孑UK^ PBST、 PBS和7JC各械5次， 每次一併中，以潸鹏去除去未杂交的硫己^^序，即得妾睏定了得到杂^tl双链DNA时微孑版。将Jd丞固定了杂^tl双链DNA时微孑版中残留的溶M出后取100 tiL 1.0 mol/L的石fKi^液ffiA 斜L，静置5min，氧^^解杂^t/dsDNA上的纳米PbS，然后注入20pL5.0moI/LNaOH调节溶液 的pH值。細同位镀荥阳极溶出伏安法检测溶解的Pb2+的含量再取150pLpH4.7含1.8xl04mol/L Hg2"的NaOAc-HOAc加入微孑版中，以微孔为Wlfe，以繊电f励工作电极，^1.4V下^3只150s， 静止5 s后从-1.2 V向~0.6 V溶出扫描，在>0.84 V处出现的阳极溶出峰电流即为领懂信号，i^ft号即为 转基因掛卜源基因(CP4EPSPS)的响应信号，荆乍为环介导^T增魂孑UK^M米电化^^测转 基因旭的依据，进行同位顿阳极溶出伏安fef^的电化学工作站的其它織體如下实^M吓: 电位增量0.004 V，振幅0.03~0.05￥，脉冲鹏0.04"0.07s，采样宽度0.02s,脉冲周期0,2s。鄉例21. 按下歹鹏方带Jfmi啭基因旭(品系GTS格3-2)夕卜源基因CP4EPSPS的环介导^Titi^iJ品.:(1) LAMP鹏液含有2.5nL10xTherniopoiaS^冲液、1.0pL10mmol/LdNTP、 1.0pL20fjmol/L上游内引物(FIP)、 1.0nL20pmol/L下游内引物(BIP)、0.25nL20nmol/L上微卜弓物(F3)、 0.25 nL20nmol/L下激卜弓嫩 (B3)、 0.5ML100mmo]/LMgSO4、 12.5(jL2mol/L甜翻，UNG酶lpL的1 U4iL和4nLddH20。其中戶; M上游内引物、下游内引物、上微卜引物、下微卜引物同上。，dNTP内的四种脱WH核酸盼混^/的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTE^2:l:l:l。(2) Bst聚^HB: 8U4iL;2. 1拂GBT 19495.3-2004方^^取样品的DNA3. 转基因旭(品DNA系GTS40O-2)夕卜M因CP4EPSPS环介导^TmSiS:A 23 pLLAMP S^液A的^gj^管中加入1 pL待检微DNA，和0.5的UNG酶，于恒M7jC浴上5(TC腿3min， 95。C腿5min,立即置于冰上lmin;B. 在鹏管中加入1 pLBstDNA聚铺；C. 于〖亘船K浴上65 。C腿1 h;D. 将7jC浴调到8(TC， Sm3min后中ihSi^得到环介导^a扩增，的转基因;^卜源基因(CP4 EPSPS)双链目标序列的扩增，，取出待用。(3) 微孔驗交电化雜测将J^5i链目标靜i」在100 。C水浴中蕭弗10min，然Jg在冰浴中'K^賴卩得到单链目标靜i」，取100 ML单链目标序列的溶^S微 版中，37Ji贿过夜，再于60t千燥箱中lh蒸干，用PBST ^ 去其中未固定的单链目标序列；再取100mL ^gifi^t靜啲纳米PbS—^f"序列^H己^S微孑版中， 并且在45"€ 7乂麟交30 min，得到杂^t/双链DNA，取出i^t孑鹏PBST、 PBS禾口水各鹏5次，每次一併中，以、唐冼除去除去未杂交的标己 "序，即得到固定了得到杂^tl双链DNA时微孑版。将战固定了杂^tl双链DNA时微孔板中残留的溶液拍出后取100 nL 1.0 mol/L的硝败溶液^A 粉L静置5min，氧化溶解杂^tldsDNA上的纳米PbS，然后aA20ML5.0mol/LNaOH调节溶液 的pH值。細同位線阳极溶出伏安法检测溶解的Pb2+的缝再取150MLpH4.7含1.8xl04mol/L Hg^的NaOAc-HOAc力口入微孑版中，以微孔为fUIWtfe，以玻碳电极为工作电极，^1.4V下^f只150s， 静止5 8后从-1.2￥向~0.6￥溶出扫描，在-0.84丫处出现的阳极溶出峰电流即为测量信号，i^ft号即为 转基因媳卜源基因(CP4EPSPS)的响应信号，荆乍为环介导^W增魂孑Ufe^鄉米电化^^测转基因^S的依据，进行同位IS^阳极溶出伏安齒fffl的电化学工作站的其它,^g如下实^^n下:电位增量0.004 V，振幅0.03"0.05V，脉冲宽度0.则.07s，采样宽度0.02s，脉冲周期0.23。蹄,列表<iio青岛科fe^:学<120>微孔板固定与纳米硫化铅标己电化^i啭基因旭的方法<160>4 <10>1 <211>38 <212>DNA <213> Ali^列 <221> prim—bind <222>(1)—(38) <400>1aatcgagcgg cgccteaggc cgtaaggaag gcgacacc 38〈10>2<211〉33<212>DNA<213> AXJ^列〈21> prim—bind〈22>(1>..(33)<400>2aa^ccgcca c鹏ctcgtc gccgalgaag魄33 <210>3〈11>16 <212>DNA <213> AI^列 <221> prim—bind <222>(1) (16) <400>3
ccalgggcgc caggat 16
〈10>4
〈11> 17
<12>DNA
<213> AU^列
<221>prim_bind
<222>(1》.(17)
<400>4
ategggcgctttgtgag17
《0>5
<11>16
<212>DNA
<13> AW列
<221>prim_bind
<222>(1)"16)
Ctccgcggcg agctaa 1权利要求
1.一种微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征在于该方法包括以下步骤环介导等温扩增反应扩增品系为GTS 40-3-2的转基因大豆外源基因CP4 EPSPS，得到外源基因CP4 EPSPS的双链目标序列扩增产物，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化铅对来源于外源基因CP4 EPSPS的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，且环介导等温扩增反应中的试剂包括(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；1U/μL UNG酶；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中上游内引物5-AATCGAGCGGCGCCTCAGGCCGTAAGGAAGGCGAC ACC-3、下游内引物5-AATGCCGCCACGGGCTCGTCGCCGATGAAGGTG-3、上游外引5-CCATGGGCGCCAGGAT-3、下游外引物5-ATCGGGCGCTTTGTGAG-3。(2)Bst DNA聚合酶8U/μL；
2. 根据权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大 豆的方法，其特征是上述的dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP: dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 根据权利要求l中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆，其特征是环介导等温扩增反应依次包括下列步骤(1)待检样品DNA的提取 提取样品核酸，即提取待检样品DNA作为环介导等温扩增反应的模板，其中提 取样品DNA的光密度值OD26o/28o在1.6-2.0范围内，浓度在10-100 ng L之内；(2)进行环介导等温扩增反应A. 在装有23 pL LAMP反应液的反应管中加入lpL待检样品模板DNA，恒温50 。C放置3min后于恒温95 。C放置3 —5min,立即置于冰上l一3min;B. 在反应管中加入1 pLBstDNA聚合酶；C. 于恒温60 — 65 'C放置45—卯min;D. 将温度调到80 — 95 °C，反应3 — 5min后中止反应得到环介导等温扩增反应的 待测外源基因CP4 EPSPS的双链目标序列的扩增产物，取出待用。
4. 如权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆， 其特征是上述的双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定， 其步骤如下首先将待测外源基因CP4 EPSPS的双链目标序列的扩增产物在100 'C水浴中煮沸 IO分钟，然后在冰浴中快速冷却得到待测外源基因CP4 EPSPS的单链目标序列，取 100 pL该单链目标序列目标序列的溶液至微孔板中，37 。C孵育过夜，再于60。C干 燥箱中0.5-1.5h蒸干，用0.2mol/L磷酸盐缓冲溶液清洗除去未固定的单链目标序列， 即得到固定了待测外源基因CP4 EPSPS的单链目标序列的微孔板。
5. 如权利要求1中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆， 其特征是上述的纳米硫化铅对来源于外源基因CP4 EPSPS的探针序列进行标记得到 含有标记探针序列的纳米硫化铅一探针序列标记液的步骤如下将8.0-13.0 巯基乙酸加到50.0 mL浓度为0.2-0.5 mmol/L的硝酸铅溶液中混合 均匀，用0.4-0.6 mol/L氢氧化钠溶液调节混合液的pH值约为7，通氮气除氧20- 45min 后，在磁力搅拌和氮气保护下向上述混合液中缓慢滴加1.2-1.6 mmol/L的硫化钠溶液 30.0 mL。滴加完毕后，继续搅拌20-30 h，混合液逐渐地变成棕色，即可得到纳米硫 化铅溶胶。取5.0 mL纳米硫化铅溶胶离心纯化，水洗后分散于2.0mL水中，加入100 HL 40.0-60.0 mmol/L乙基(3-二甲基氨丙酸)碳二亚胺盐酸盐、100 40.0-60.0 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺及0.1 mmol/L ssDNA探针序列5'-CTCCGCGGCGAGCTAA-3'，室 温下搅拌15-20 h，该反应物在10000 r/min下离心20-40 min，用磷酸盐缓冲溶液洗涤 多次，再分散于磷酸盐缓冲溶液中，即得到含有标记探针序列的纳米硫化铅一探针序 列标记液，于-2。C下保存待用。
6.如权利要求l中所述的微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆，其特征是上述的纳米硫化铅一探针序列标记液中的标记探针序列与固定了单链目标 序列的微孔板上的单链目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，其步骤如下取100pL上述的纳米硫化铅一探针序列标记液至微孔板中，45 。C水浴杂交20-40 min，得到杂交产物双链DNA，取出微孔板用含有1%吐温-20的磷酸盐缓冲溶液、磷 酸盐缓冲溶液和水各冲洗5次，每次一分钟。将固定了单链目标序列的微孔板中残留 的溶液拍出后分别取100pL 1.0mol/L的硝酸溶液注入各孔，静置5min，氧化溶解杂 交产物双链DNA上的纳米硫化铅，然后注入20 5.0 mol/L氢氧化钠调节溶液的pH 值到中性；取150 nLpH 4.5-5.0含1.8xl(T4 mol/L汞离子的醋酸缓冲溶液加入上述各 个微孔板中，以微孔板上的微孔为微型化电解池，采用同位镀汞阳极溶出伏安法检测 溶解的铅离子的含量，以玻碳电极为工作电极，在-1.4 V下沉积120-180s，静止5 s 后从-1.2V向-0.6 V溶出扫描，在-0.84 V处出现的阳极溶出峰电流即为测量信号，该 电化学信号即为电化学检测转基因大豆外源基因CP4 EPSPS的依据，从而达到对品系 为GTS 40-3-2的转基因大豆检测的目的。
全文摘要
本发明涉及一种微孔板固定与纳米硫化铅标记电化学检测转基因大豆的方法，其特征在于该方法包括以下步骤环介导等温扩增反应扩增品系为GTS 40-3-2的转基因大豆外源基因CP4E PSPS得到扩增反应物-待测外源基因CP4 EPSPS的双链目标序列，将该双链目标序列在水浴中热解成单链目标序列后在微孔板上进行固定，然后将纳米硫化铅对来源于外源基因CP4 EPSPS的探针序列进行标记得到标记探针序列，将该标记探针序列与固定在微孔板上的目标序列进行分子杂交并进行同位镀汞阳极溶出伏安法的电化学测定，进而达到对检测转基因大豆外源基因(CP4 EPSPS)的电化学检测的目的。本发明优点是快速、特异性强、灵敏度高而且使用方便。
文档编号G01N27/26GK101260441SQ20081009398
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月25日 优先权日2008年4月25日
发明者伟 孙, 奎 焦, 鹏 覃, 钟江华, 高宏伟 申请人:青岛科技大学