专利名称：：乙肝e抗原磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种乙肝e抗原磁微粒化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒结合了磁微粒免疫分离技术、生物素-亲和素放大技术和化学发光免疫分析技术。
背景技术：
：乙型肝炎是一种严重的常见的肝脏疾病，在全球影响到数百万人。目前全球人口中，超过20亿人已经在其生命中的某个时期感染过乙型肝炎病毒(HBV)，其中，大约3.5亿仍然为慢性感染者，成为病毒的携带者。全世界四分之三的人口生活在感染的高发区。每年HBV急性临床病例超过4百万，携带者中大约25%,也就是每年100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)通常出现于乙型肝炎病毒感染早期。HBeAg的滴度在病毒复制期迅速升高。HBeAg的存在与感染性病毒(Dane颗粒)数量的上升密切相关，并且与血清中存在病毒特定的DNA聚合酶密切相关。在HBeAgP曰性期，乙型肝炎患者对其接触者具有高度的传染性。乙型肝炎病毒携带者中HBeAg持续的存在通常与慢性活动性肝炎相关。HBeAg向乙型肝炎病毒e抗体(Anti-HBe)的血清转换预示着循环中HBVDNA的减少。HBeAg以及Anti-HBe在HBsAg阳性的患者的病情监测中具有及其重要的意义。目前用于检测乙肝病毒血清标志物的免疫方法主要有酶免疫测定(enzymeimmunoassay,EIA)、力文射免疫测定(radioimmunoassay,RIA)、免疫荧光测定(fluoroimmunoassay，FIA)以及化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)等。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的实验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，化学发光免疫分析最好。放射免疫分析技术使用放射性元素作为标记物，因此对环境产生一定的放射性污染，且操作复杂，试剂保存时间短。酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到lCr15-10-18摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，又因为酶标记物稳定，可长期使用，因而得到了越来越多的关注。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒。将免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性。该技术利用微米级磁微粒作为包被载体，外包被单克隆抗体制备免疫磁微粒，利用免疫磁微粒悬浮于液体中，可增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用。生物素-亲和素系统(biotin-avidinsystem,BAS)是20世纪70年代末发展的一种生物反应放大技术，由于BAS亲和力高,所以具有高灵敏度、高特异性和稳定性等优点，在现代生物免疫学领域中已得到广泛应用，并显示出明显的优越性。上述技术的结合，可以为乙肝e抗原提供一种灵敏、快速的方法，也有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验中的应用与发展。
发明内容本发明综合了生物素一亲和素免疫放大技术、磁微粒免疫分离技术和化学发光免疫分析技术的优点，开发了一种快速、灵敏、可定量检测乙肝e抗原的试剂备jBL。本发明目的是提供一种生物素-亲和素免疫放大技术和免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析测定乙肝e抗原的磁4鼓粒化学发光免疫测定试剂盒。本发明的试剂盒包括乙肝e抗体包被的磁微粒和生物素标记的乙肝e抗体的混合液、辣根过氧化物酶标记的链亲和素、乙肝e抗原校准品、上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管。本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。本发明试剂盒的制备方法包括以下步骤1)配制乙肝e抗体包被磁微粒和生物素标记乙肝e抗体的混合液所述磁微粒为l~10^m粒径、三氧化二铁内核、表面包裹带有氨基或羧基的聚合物，其使用浓度为l~10mg/mL。所述抗体包被磁微粒是通过戊二搭两步法将乙肝e抗体包被于磁微粒上，以含有0.5%~2.0%牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸緩冲液为封闭液封闭包被的磁微粒。所述生物素标记乙肝e抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体偶联反应而实现的。所述的混合液是由乙肝e抗体包被的磁微粒和生物素标记的乙肝e抗体以体积比为1:1混合，以20~40%的新生牛血清配制而成。2)以多束才艮过氧化物酶标记链亲和素釆用改良过碘酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。3)以乙肝e抗原配制校准品；用马血清将乙肝e抗原稀释成校准品，浓度分别为0NCU/mL、0.04NCU/mL、0.12NCU/mL、0.5NCU/mL、2.2NCU/mL、9.0NCU/mL。4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液所述化学发光底物液包括A液和B液。A液包括10mM鲁米诺、0.2mM邻苯三酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0-10.0。B液包括3.5mM过氧化脲、0.05%卵清蛋白、0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，其pH值为7.0-7.6。5)浓缩洗涤液所述的浓缩洗涤液为PBST洗涤液，在使用时先用去离子水进行20倍的稀释。6)分装上述校准品、乙肝e抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液、酶标记链亲和素、化学发光底物液和反应管其中试剂盒使用的反应管材料为透明塑料或玻璃。7)组装为成品试剂盒。根据本发明的试剂盒，先在反应管中加入乙肝e抗体包被的磁微粒与生物素标记的乙肝e抗体混合物，再加入样本，若样本中含有乙肝e抗原，则与前者形成"磁微粒结合的乙肝e抗体-乙肝e抗原-生物素化乙肝e抗体"的双抗体夹心复合结构，之后通过生物素亲和素的高亲合力使酶标链亲和素与该复合物结合，形成"磁微粒抗体-待测抗原-生物素化抗体-酶标亲和素"复合物，洗涤除去游离的酶标记物后，加入化学发光底物产生光信号，在管式发光仪进行读数。本发明"乙肝e抗原》兹」微粒化学发光免疫分析测定试剂盒"可以非常有效地检测出样品中乙型肝炎病毒e抗原的含量。具有快速、灵敏、稳定等优点，且各项指标均达到同类进口试剂盒的水平。具体实施例方式实施例1制备本发明的乙肝e抗原磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒一、乙肝e抗体包祐J兹孩i粒与生物素标记乙肝e抗体的混合液的制备1、乙肝e抗体包被的磁微粒的制备将粒径为l-l(Him的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀3小时后，加磁场，静置2025min,倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐緩冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为50~100mg/mL;每毫升悬浮液中加入乙肝e抗体40100吗，在4。C下搅拌过夜后，加磁场，静置1015min,倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸緩冲液(pH为7.2)于室温封闭3~4小时；最后用pH值为7.4、含吐温-20和叠氮化钠防腐剂的磷酸盐洗涤緩冲液清洗3~5次，并用该溶液配制成510mg/mL的工作液。磁微粒在4'C保存。2、生物素标记的乙肝e抗体的制备生物素标记乙肝e抗体以生物素琥珀酰亚胺酯在孩"咸性条件下与单抗发生偶联反应，对PBS充分透析，生物素标记物以新生牛血清稀释，加入proclin300，-20。C以下保存。3、混合液的制备将乙肝e抗体包被的磁微粒与生物素标记的乙肝e抗体以体积比为1:1混合，以2040%新生牛血清配制而成。二、辣根过氧化物酶标记的链亲和素的制备以辣根过氧化物酶标记链亲和素采用改良过碘酸钠法，具体标记过程如下溶解4mgHRP于lmL蒸馏水中，加入0.4mL过碘酸钠(50mmol/L)室温搅拌20min，经lmmol/L醋酸钠緩沖液，pH4.4透析后加入8mg链亲和素，搅拌2h,最后用200mmol/LNaBH4进行还原，经0.02MPBS緩冲液透析后，加等体积甘油，-20°C以下保存。三、乙肝e抗原校准品的制备用马血清将乙肝e抗原稀释成校准品，浓度分别为0NCU/mL、0.04NCU/mL、0.12NCU/mL、0.5NCU/mL、2.2NCU/mL、9.0NCU/mL,共6瓶。四、酶标记物的制备先配制酶稀释液，每1000ml酶稀释液中含Tris12.12g,BSA5g,甘油100ml,Proclin300lml，加双蒸水至900ml，用盐酸调pH至7.4,再用双蒸水定容至1000ml,配成酶稀释液。釆用方阵法选择酶标记物的工作浓度范围为1:1000-5000。五、配制化学发光底物本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法A液含10mM鲁米诺、0.2mM邻苯三酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0~10.0。B液含3.5mM过氧化脲、0.05%卵清蛋白、0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，其pHH直为7.0—7.6。使用方法A、B液双组分试剂，在使用前根据使用量等体积混合。六、配制浓缩洗涤液洗涤緩冲液是含有0.1~0.5%吐温-20、0.1%生物防腐剂的磷酸盐緩冲液，pH值为7.4。使用时用蒸馏水稀释20倍。七、半成品及成品组成上述试剂经检验合格后进行分装，贴上标签，即为半成品。再把各半成品根据要求组装成成品试剂盒。实施例2本发明的试剂盒的使用方法一、样品的准备采用正确医学方法收集病人血清用于检测。二、；险测方法使用本试剂盒进行实验前，需先取出抗体包被磁微粒与生物素标记抗体的混合液、校准品/待测样品、酶标记的亲和素在室温放置15-30分钟，使它们平衡到室温；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37°C;再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作。使用本发明试剂盒按照实施例2的方法进行实验的具体操作步骤如下1、将圆底聚苯乙烯试管编号后，向试管中加入50pL血清样品或系列校准品溶液，校准品每管加0NCU/mL、0.04NCU/mL、0.12NCU/mL、0.5NCU/mL、2.2NCU/mL、9.0NCU/mL各50pL,2、再加入抗体包被磁微粒与生物素标记抗体的混合液50pL，37。C振荡反应30min。3、每管加入洗涤液500pL，充分混匀，置于磁分离器上分离5min,倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复3次。4、加入辣根过氧化物酶标记的链亲和素lOOpL,37。C振荡反应15min。5、将试管架置于磁分离器上分离5min,然后倒转分离器倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体。6、如步骤3用洗涤液重复洗涤5次。7、各管加入化学发光底物20040(HiL,充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置10min。8、而后在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的HBeAg的浓度。实施例3本发明的试剂盒的方法学检定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下1、试剂盒精密度测定(1)校准品精密度实验将实施例1中制备的试剂盒分别取三批进行精密度实验，每批抽取5个试剂盒。以实施例1中所抽取的试剂盒测定0.2NCU/mL的HBeAg校准品10次。计算测定浓度的变异系数，结果表明变异系数在4.3%~8.7%之间。2、试剂盒准确性测定用临检中心HBeAg2NCU/ml质控血清进行检测，测值偏差小于10%。3、试剂盒特异性、灵敏度实验与HAV、HCV、类风湿、系统性红斑狼疮等疾病未见交叉反应。用国家参考品进行检测，其中15份阴性国家参考品全部检出阴性符合率100%(15/15),10份阳性国家参考品全部冲全出阳性，符合率100%(10/10),三个系列稀释灵敏度参考血清9份全部检出阳性。4、试剂盒稳定性实验对实施例1的试剂盒进行37。C6天加速实验后，与4'C放置试剂盒平行检测高、中、低值质控品，结果表明37°C6天后质控血清测值偏差均小于15%,对实施例1试剂盒进行28。CIO个月的跟踪实验，结果表明各项指标完全符合临床要求。该试剂盒在37'C放置6天和2~8'C放置10个月均能通过国家参考品标准，稳定性良好，完全符合临床需要。利用本发明方法进行检测，灵敏度高，特异性强，检测范围宽，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床;f企测及筛查实验室。实施例4本发明的试剂盒同国外试剂盒临床血样测值比对用本发明试剂盒和国外知名公司的进口HBeAg化学发光试剂盒分别对1024份正常人血清和176份乙肝大三阳患者血清同时进行检测，其检测结果见表1表l临床血样检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>对照试剂敏感性为100%，特异性为99.9%，本发明试剂敏感性为100%,特异性为99.9%,两者间符合率为100%。通过以上结果表明，本发明试剂灵敏度高，特异性好，临床符合性好，且无污染，对于临床检测具有很好的推广价值。权利要求1、一种乙肝e抗原磁微粒化学发光免疫测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由乙肝e抗体包被的磁微粒和生物素标记的乙肝e抗体的混合液、辣根过氧化物酶标记的链亲和素、乙肝e抗原校准品、上述辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管组成。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述乙肝e抗体包被的磁微粒与生物素标记的乙肝e抗体的混合比例为1:1。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，A液包括10mM鲁米诺、0.2mM邻苯三酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0~10.0;B液包括3.5mM过氧化脲、0.05%卯清蛋白、0.2MpH7.2磷酸盐緩沖液，其pH值为7.0—7.6。4、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤1)配制乙肝e抗体包被J兹微粒和生物素标记乙肝e抗体的混合液；2)以辣根过氧化物酶标记链亲和素；3)以基因工程乙肝e抗原配制校准品；4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物液；5)配制浓缩洗涤液；6)分装上述半成品和反应管；以及7)组装为成品试剂盒。5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述配制抗体包被磁微粒和生物素标记抗体的混合液的步骤1)中所述的混合液是由乙肝e抗体包被的磁微粒和生物素标记的乙肝e抗体以体积比为1:1混合，以含20~40%的新生牛血清的磷酸盐緩冲液配制而成；所述磁微粒为l~10pm粒径、三氧化二铁内核、表面包裹带有氨基或羧基的聚合物，其使用浓度为l~10mg/mL;6、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述抗体包被磁微粒是通过戊二醛两步法将乙肝e抗体包被于磁孩i粒上，以含有0.5%2.0%牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液为封闭液封闭包被的磁微粒。7、如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述生物素标记乙肝e抗体是通过生物素琥珀酰亚胺酯在微碱性条件下与抗体赖氨酸残基发生偶联反应而实现的。8、如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活性基团为氨基或羧基。9、如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述以辣根过氧化物酶标记链亲和素的步骤2)中，采用改良过橫酸钠法以辣根过氧化物酶标记链亲和素。10、如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物液包含A液和B液，其中，A液包括10mM鲁米诺、0.2mM邻苯三酚、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0~10.0;B液包括3.5mM过氧化脲、0.05%卵清蛋白、0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，其pH^f直为7.0~7.6。全文摘要本发明属于免疫分析
技术领域：
，涉及一种乙肝e抗原磁微粒化学发光免疫测定试剂盒。本发明试剂盒主要包括乙肝e抗体包被磁微粒和生物素标记乙肝e抗体的混合液、辣根过氧化物酶标记的链亲和素、乙肝e抗原校准品、化学发光底物液、浓缩洗涤液和反应管。本发明利用双抗体夹心法原理，定量检测血清中乙肝e抗原含量，可用于临床判断乙肝病毒的感染状况和乙肝疗效监测。文档编号G01N33/576GK101592663SQ20081011381公开日2009年12月2日申请日期2008年5月30日优先权日2008年5月30日发明者于尚永,唐宝军,宋胜利,应希堂,胡国茂,詹先发申请人:北京科美东雅生物技术有限公司