Tgm2检测方法、检测试剂盒及其应用的制作方法

专利名称：：Tgm2检测方法、检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物学领域，具体而言，本发明涉及使用TGM2的检测方法、检测试剂盒及其应用，具体而言，涉及含有单独使用新的标志物检测HCC或者与AFP联用检测AFP阴性的HCC的方法、检测试剂盒及其应用。
背景技术：
：肝癌(Livercancer)是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，2000年全世界新发病例约564，000人，在所有恶性肿瘤中排第五位。由于其恶性程度高、预后不良，五年生存率不足10%。中国是肝癌的高发区，集中了全世界约54%的新发病例，其中肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinomas,HCC)占原发性肝癌的90%以上[1'2]。据1991-2000年间，中国169，871人口的死因抽样调查显示，它的死亡率排在全部恶性肿瘤的第2位，年死亡率为54.7/100，000(男81.2，女29.0)[3]。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein,AFP)是目前临床上认可的肝细胞肝癌标志物。20世纪50年代，Bergstrand等人首次在人类胎儿血清中发现了这种电泳迁移率相当于曱种球蛋白的蛋白质，在正常成人血清中并没有检测到它的存在["。1960年，AbelevG及其同事在小鼠的肝细胞癌中发现了这种甲种球蛋白，它不存在于正常小鼠的任何组织中，经证实它是胎鼠血清中的主要成分，在成年鼠肝细胞再生时会重新出现[5]。后来，肝细胞肝癌患者和畸胎瘤患者血清中胚胎特异性的曱种球蛋白也被检测出来[6'"。因此，人们将这种主要存在于胎儿组织的蛋白命名为甲胎蛋白。目前已知，AFP是一种分泌型糖蛋白，与白蛋白同属于白蛋白样类动物和人胚胎期血清中，由胚胎发育时期卵黄嚢内胚层和胎肝合成并分泌到血液中。在人类胚胎中AFP最高浓度可达3-4mg/ml,出生后，血清中AFP浓度迅速下降，新生儿期约为10-50jag/ml,正常成人一般在10ng/ml以下。怀孕期间母体血清中AFP浓度的变化可以提示多种胚胎发育缺陷[8]。而成人中，升高的血清AFP水平不仅存在于60%-70%的肝细胞肝癌病人，也可见于大约20%的慢性肝炎，20%-60%的肝炎肝硬化和某些胚胎性癌患者[9〗。在有慢性肝炎和肝硬化背景的肝细胞肝癌患者中，AFP的诊断价值更低[1°'11]。综上所述，AFP对于肝细胞肝癌患者的判别灵敏度介于41%-97%之间，特异度在80%-95%，而阳性预测值徘徊在9%-58%之间[1°-12]。更为重要的是，临床上有20%-30%的肝细胞肝癌患者血清AFP水平并不升高，从而大大限制了其在肝细胞肝癌临床检查中的应用价值。因此，目前迫切需要找到能够与AFP联合使用，提高HCC诊断准确度的新标志物，尤其是血清AFP水平不高的肝细胞肝癌分子标志物，以及基于所述标志物的新的肝癌检测方法和可以进行方便快捷的检测试剂盒。
发明内容为了解决上述问题，本发明人利用细胞培养中的稳定同位素标记技术结合高精度质谱(nanoLTQ-FTMS/MS)的定量蛋白质组研究策略分析了两个具有不同AFP表达特性的肝癌细胞系HepG2(AFP阳性)和SK-HEP-1(AFP阴性)与正常肝细胞系HL-7702之间的差异表达蛋白质谱，鉴定出一个在AFP阴性的SK-HEP-1肝癌细胞中明显高表达的蛋白质，即组织转谷氨酰氨酶2(Tissuetransglutaminase2,TGM2)。该蛋白具有多种异构体形式，在SK-HEP-1中的表达水平是HepG2的15倍，是HL-7702中的35倍。TGM2属于转谷氨酰氨酶蛋白家族，具有0&2+依赖的转酰氨基作用，能够将谷氨酸残基交联到蛋白质的赖氨酸e-氨基上，导致蛋白多聚化5或蛋白质交联。此外，TGM2还具有GTP结合能力(封闭其转酰氛基作用)，发挥Goch蛋白活性，与Gph和oclB-肾上腺素受体形成四聚体，调节受体激活的PLC活性。新近发现，TGM2还具有脱氨基酶、二肽酶、二硫异构酶活性，在人乳腺癌细胞膜上的TGM2还有Ser/Thr蛋白激酶活性，能够将IGFBP3(具有IGF非依赖的促凋亡活性)磷酸化，从而诱导死亡受体中介的细胞凋亡信号[13—17]。因此，TGM2是一个多功能蛋白分子，参与细胞分化、凋亡、细胞黏附、受体中介的内吞和细胞运动迁移等多种生物学过程，尤其是其在细胞凋亡中的作用具有两面性，其具体的作用依赖于不同细胞类型中特异存在的凋亡通路、刺激的种类、亚细胞定位和TGM2各种酶活性的转换等因素["'18]。已有文献证明，TGM2在乳腺癌、黑色素瘤和胰腺导管腺癌中高表达，并与化疗耐药和侵袭表型相关[19-21]。在胰腺导管腺癌细胞中，TGM2可以通过AIF依赖，caspase非依赖途径诱发细胞凋亡[22]。定位于肿瘤基质中的TGM2，还可以抑制肿瘤生长和转移过程[23'2"。因此，在肺瘤的发生发展过程中，TGM2具有多样的功能。针对肝脏的研究结果发现，TGM2在肝纤维化的早期表达上调，但随着病程进展，其表达量又逐渐下降。此外，在肝再生过程中，它还可以作用于a1B-肾上腺素受体通路125—29)。在上述发现的基础上，发明人首次建立了将该TGM2分子用于AFP阴性肝癌的辅助诊断来降低误诊的方法、检测试剂盒及其应用。具体而言，本发明提供了检测待测生物样品中的TGM2水平是否异常，进而获得作为中间结果的信息的方法，所述方法包括步骤1)测定待检生物样品中的TGM2水平；2)比较待检生物样品中的TGM2水平和标准生物样品对照的TGM2水平；3)获得作为中间结果的信息，4)根据比较结果确定待检生物样品是否有可能是HCC样品。2.所述1的方法，进一步包括与AFP联合检测。3.所述1或2的方法，其中步骤1)的生物样品是已经脱离人体或者动物体的组织、体液或者排泄物。4.所述1或者2的方法，其中步骤l)的生物样品是组织和血清。5.所述1或2的方法，其中步骤1)的测定是Western印记或者免疫组织化学或ELISA法。6.所述1的方法，其中步骤1)的测定是对TGM2水平的下调的测定。7.使用TGM2检测AFP阴性的HCC的方法，所述方法包括步骤1)测定待检生物样品中的TGM2水平；2)比较待检生物样品中的TGM2水平和标准生物样品对照的TGM2水平；3)根据比较结果确定待检生物样品是否是HCC样品。7.所述6的方法，其中步骤1)的生物样品是组织和血清。8.所述6的方法，其中步骤1)的测定是Western印记或者免疫组织化学或ELISA法。9.TGM2作为HCC的标志物的用途。10.所述9的用途，其中TGM2与AFP联合应用。11.用于检测TGM2的AFP阴性的HCC检测试剂盒。12.所述ll的AFP阴性的HCC检测试剂盒用途，其中包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体。13.用于联合检测TGM2和AFP的HCC检测试剂盒，其中包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体；作为标准的AFP、抗AFP抗体。本发明提供了使用TGM2检测AFP阴性HCC的方法，所述方法包括步骤1)测定待检生物样品中的TGM2水平；2)比较待检生物样品中的TGM2水平和标准生物样品对照的TGM2水平；3)根据比较结果确定待检生物样品是否可能是HCC样品。任选地，上述的方法的步骤1)的生物样品是组织和血清。任选地，上述的方法的步骤l)的测定是Western印记或者免疫组织化学或ELISA法。任选地，上述的方法的步骤1)的测定对TGM2水平的下调的测定。一方面，本发明提供了TGM2作为HCC的标志物的用途。任选地，上述的用途中，TGM2与AFP联合应用。另一方面，本发明提供了用于检测TGM2的AFP阴性的HCC检测试剂盒，还提供了用于联合检测TGM2和AFP的HCC检测试剂盒。所述试剂盒，其中包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体；或者其中还包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体；作为标准的AFP、抗AFP抗体，此外图1.TGM2在肝细胞肝癌中的表达情况。其中，(A)TGM2在18例肝癌配对组织中的Western印记结果。图中，N代表癌旁正常组织；C代表肿瘤组织。每一例右侧的条形图表示TGM2在癌旁正常组织和肺瘤组织中的相对表达量(TGM2/p-actin的灰度值)。(B)TGM2代表性的免疫组织化学染色图(200x)。其中，l和2是一例AFP阴性病例的肿瘤和癌旁正常组织；3和4是一例AFP阳性病例的肿瘤和癌旁组织。图2.HepG2细胞中AFP-siRNA的特异性沉默效应。用如图所示的20nM、50nM、100nM、150nM和200nMAFP-siRNA转染HepG2细胞，转染72h后收获细胞，经Western印记检测AFP和TGM2的表达水平。|3-actin作为上样量对照。图3TGM2在标准健康对照和HCC患者血清中的浓度分布图。纵轴代表了其在两组人群中的分布变异，每一个盒子代表了中间50%数据的分布情况，盒子中间的线代表中位值，上、下边界代表75%和25%百分位数。盒子上方和下方的短横线代表数据的最大值和最小值。圆点代表异常值。从图中可以看出，HCC患者的血清TGM2浓度明显高于健康对照。具体实施例方式为了进一步清楚地阐述本发明，下面提供了本发明的具体实施例，不过本发明的内容并不局限于所述实施例，任何本法的方法和产品的等价的变形和修饰等都包括在本发明的范围内。实施例1:AFP与TGM2的关系的Western印记分才斤鉴于TGM2在肿瘤发生发展以及肝再生、肝纤维化中的重要作用，发明人对其在肝癌组织中的表达情况进行了大样本量的验证分析。使用TransglutaminaseIIAb-l抗体(美国Labvision公司，CloneCUB7402，Cat.No.MS-224-P)对18对配对肝癌组织作了Western印记分析，结果表明TGM2在50%(3/6)的AFP阴性的病例中表达上调，而12例AFP阳性病例全部表现为表达下调。更为重要的是，6例AFP阴性病例中，有4例表现出肿瘤组织内存在多个低分子量的异构体形式，而12例AFP阳性病例中，这种异构体仅存在于9例癌旁正常组织中(图1A)。经过Fisher精确概率检验，这一现象在两组之间具有显著性差异(p-0.0049)。实施例2:AFP与TGM2的关系的免疫组织化学染色分析对47例肝细胞肝癌样本的免疫组织化学染色(图IB)发现TGM2主要定位于胞浆和细胞膜。在29例AFP阴性的病例中，16例表现为肿瘤中表达上调(55.2%)，而18例AFP阳性病例中，仅有3例的TGM2在胂瘤中表达上调。经统计分析，TGM2的表达水平与AFP表达状态明显相关，其在不同AFP表达特性的两组中差异具有显著性(p=0.0354)，但是，其表达与肿瘤大小、分化程度等指标之间没有明显相关性。综合Western印记和免疫组织化学染色结果(有4例样品为两者共用)，TGM2在一半的AFP阴性病例(17/32)中表达上调，而29例AFP阳性病例中只有3例表达上调。这一差异与病例个体的AFP表达9状态明显相关(p=0.0034)。而且，经Spearman等级相关检验，组织中TGM2表达特性与血清中AFP表达水平呈现一种负相关关系(p<0.0001,相关系数=0.4693),也就是说个体血清AFP表达水平越低，其组织中越表现出TGM2在肿瘤中表达上调的趋势。结合已有文献，血清中高水平的AFP是肝细胞肝癌的一个独立的不良预后因素(3°，认为，TGM2在肝损伤中可能发挥保护作用，而且其与AFP之间存在一定的功能联系。实施例3:TGM2与AFP之间的功能相关性的验证为了进一步证明TGM2与AFP之间的功能相关性，发明人设计并化学合成了针对AFP的siRNA，在AFP高表达的HepG2细胞中，特异性的下调了AFP的表达。该siRNA针对人类AFPmRNA开放阅读框的560-579位核苷酸，其序列为5，-CUUCCUGUAUGCACCUACAA-dTdT-3，。同时，使用了一段基因组无关的随机序列作为该siRNA的阴性对照，其序列为5，-UUCUCCGAACGUGUCACGU-dTdT-3，.。具体转染条件如下(1)细胞准备取对数生长期的HepG2细胞(肝癌细胞系，购自美国典型培养物收集中心)，胰酶消化，按照50%~60%的密度接种于24孔板中，每孔加入含10%胎牛血清的MEM完全培养基(MEM液体培养基产自美国GibcoBRL公司，胎牛血清产自奥地利PAA公司)500ju1,混匀备用；(2)瞬时转染准备首先将上述siRNA序列退火处理(2.5nM的双链siRNA加入125ju1通用緩冲液，90。C保温2分钟，自然冷却到室温后，4。C放置过夜备用)。使用美国invitrogen公司的LipofectAMINE2000(Cat.No.11668-019)转染试剂进行siRNA的转染，转染方法详见说明书。实验时，同时设立20nM、50nM、100nM、150nM和200nMAFP-siRM组，每组i殳立三个平行孔，同时设立阴性对照。简而言之，针对每一孔来说，将不同终浓度的siRM加入50p1Opti-MEM培养基中，同时，将LipofectAMINE2000试剂轻柔混匀，取ljalLipofectAMINE2000试剂在另一管中与50jalOpti-MEM培养基混合，室温孵育5分钟。将稀释好的siRNA与稀释后的LipofectAMINE2000在30分钟之内混合，轻轻颠倒混勻，室温孵育20分钟。而后将不同浓度的siRNA与LipofectAMINE2000的混合物lOOp1加入培养孔中，每孔的LipofectAMINE2000最终用量为0.17%。(3)细胞在37。C，5%C02的细胞培养箱中培养72h,而且裂解细胞，用Western印记进行实验分析。结果发现，设计的AFP-siRNA序列以浓度依赖性的方式，有效下调HepG2细胞中AFP的表达，200nM的AFP-siRNA能减少50%~60%的AFP表达。与此同时，发现随着AFP-siRM用量的增加，TGM2的表达水平逐渐增加(图2)。这一结果表明，在肝癌细胞中，AFP可能是TGM2的负性调节因子，部分调控TGM2的表达。实施例4:TGM2的血清ELISA检测及该方法的临床检测应用虽然TGM2不具有信号肽和跨膜区，但文献报道，约有10-20%的TGM2可以存在于细胞表面和细胞外基质中，因此，目前i人为，它可以经非经典分泌途径分泌到细胞外(13]。然而，在人类血浆蛋白质组计划(H蘭nPlasmaProteomeProject,HPPP)产生的正常人血浆蛋白高可信数据集(含3020个蛋白质)中，并没有检测到该蛋白的存在。同时，目前没有任何TGM2可以出现在正常或各种肿瘤患者血浆中的相关报道。基于这一蛋白的表达特性和申请人在肝癌组织中的验证结果，申请人:推测，TGM2可以被肝癌细胞分泌并进入血清/血浆，并作为肝癌早期血清学检测的特异性标志物。因此，申请人首次建立了高灵敏度的人类TGM2的血清间接双夹心ELISA检测方法，并对其检测结果进行了评价。该方法的具体步骤为1.包被用pH9.6的50mM碳酸盐緩沖液(15mMNa2C03;35mMNaHC03)作为稀释液，将山羊抗人TGM2抗体(TGase2(N-18)，SantaCruzBiotechnology公司，Cat.No.sc-34543)稀释为2yg/ml。在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50u1包被液，用保鲜膜封好，在4'C冰箱中放置过夜(>16h)。次日，用350ja1150mM的PBST緩沖液(137mMNaCl,2mMKH2P04，10mMNa2HP04，加入0.05%的Tween-20调节至pH7.4)浸泡式洗板，3rainx3次。2.封闭每孔加入300Ml的2%BSA(Sigma-Aldrich公司，Cat-No.A7906),室温封闭4h。用350y1PBST緩沖液浸泡式洗板，1minx3次。3.抗原孵育在每个反应孔中加入50y1的HCC患者血清，37。C孵育1.5h，同时，用洗涤緩冲液替代抗原作为阴性对照，设立4个阴性对照孔。每个样品设置2个平行孔。孵育结束后，弃去抗原，用350jalPBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。4.检测抗原反应在每个反应孔中加入50m1用pbst緩沖液稀释的0.4jug/ml的小鼠抗人TGM2抗体(Labvision公司，Cat.No.MS-224-P)作为检测抗体，室温孵育lh。而后弃去，用350m1PBST緩沖液浸泡式洗板，3minx3次。5.二抗孵育在每个反应孔中加入50ja1用PBST緩沖液1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠lgG(JacksonImmunoReasearch公司，Cat.No.115—005-003)，室温孵育1h。而后弃去，用350ulPBST緩冲液浸泡式洗板，3rainx3次。6.TMB(3，3，，5，5，-四甲基联苯胺)底物显色称取10mgTMB(Sig歸-Aldrich公司，Cat.No.15053)溶于5ml无水乙醇中,配置成TMB贮存液。而后取0.5mlTMB贮存液加入10ml磷酸柠檬酸底物緩沖液(51.4mMNa2HP04,24.3mM柠檬酸,pH5.O)中,并加入3210.75%的仏02混匀，配置成TMB显色溶液。在每个反应孔中加入100ia1TMB显色溶液，轻轻混匀，室温孵育20min。7.终止待颜色满意并稳定以后，每孔加入100jnl2MH2S0r溶液终止反应，并轻轻混匀。8.OD值的测定立即将酶标板置于Model680酶标仪(Bio-rad乂^司)中，OD450/57Q双波长读数。9.结果的判读首先确定4个阴性对照孔的读数，取平均值作为12本底读数。对于每一例血清样品，先计算2个平行孔的孔间变异(孔间变异=两孔OD值之差/两孔OD值的平均值)，对于那些孔间变异值小于15%的样品，取2次重复的平均值作为该样品的OD值；否则，舍弃该例样品。而后，利用OD值相对定量的表示健康对照和HCC患者之间血清TGM2浓度差异。注上述实验方法所用材料，除特殊注明以外，均为国产分析纯试剂。利用上述方法，申请人对年龄、性别相匹配的31例健康成人(平均年龄55岁，最大年龄68岁，最小年龄36岁)和87例HCC患者(平均年龄53岁，最大年龄74岁，最小年龄15岁)的血清TGM2浓度进行了测定。由于申请人建立的这一系统比较稳定，绝大部分病例结果均有效。实验结果发现，健康成人血清TGM2的浓度中位值为0.0523,检测区间为0~0.1073。而HCC患者的血清TGM2浓度中位值是0.0863，检测区间为0~2.0080。经过Mann-Whitney秩和检验，两者差异具有显著性(p=0.0011)。同时，健康对照中的血清TGM2浓度与其年龄、性别之间没有明显的相关性(p-0.4590，p=0.4287)。而且，在HCC患者中，TGM2血清水平与组织学分级相关，低分化患者(中位值为0.2665)的血清浓度明显高于高分化患者(中位值为0.0618)(p-0.0334)。肺瘤大小介于3cm到5cm之间的肿瘤患者(中位值为0.1687)，血清TGM2水平明显高于小肝癌患者(中位值为0.0685)(p-0.0220)。但是，AFP阳性和阴性的HCC患者，血清TGM2表达水平没有明显差异(p-0.8782)。TGM2在健康对照和HCC患者血清中的浓度分布图见图3。上述结果表明，申请人建立的血清TGM2ELISA检测方法具有重复性好、灵敏度高的特点，将其用于118例健康成人和HCC患者的血清TGM2测定发现，这一指标具有很高的检测灵敏度，而且HCC患者血清中TGM2浓度明显高于健康对照(就中位值之间的比较，肿瘤中上调至少L7倍)，表明它可能是一个很有潜力的血清诊断指标。而且，其血清表达水平和肿瘤的组织学分级和肿瘤大小之间具有明显相关性。因为，这一指标与血清AFP浓度之间没有相关性，表明其除了可以单独用于HCC检测外，还可以与AFP联合使用，提高诊断效力。本发明提供了一种肝癌检测试剂盒，可以有效区分健康对照和HCC患者人群，目前已完成临床试验118例。综上所述，本发明研究了TGM2在肝细胞肝癌组织中的表达情况，发现(1)TGM2在一半的AFP阴性组织中高表达，而在AFP阳性组织中几乎全部表达下调；(2)TGM2具有多种异构体形式，这一现象目前尚无文献报道。发现AFP阴性的肿瘤组织中，存在较多的异构体形式TGM2,而在AFP阳性病例中，这些异构体主要位于癌旁正常组织中，这一特性与血清AFP水平存在明显相关性；(3)发现TGM2在肝癌组织中的表达特性与血清AFP水平之间存在明显的负相关性，即血清AFP水平越低，肝细胞肝癌病例中，肿瘤组织TGM2高表达的趋势越明显；(4)特异性下调AFP的表达后，TGM2的表达水平呈现增加趋势，表明AFP可能是TGM2的负性调控因子。(5)血清ELISA结果表明，TGM2在肺瘤患者血清中明显升高，表明TGM2可能成为一种新的潜在的血清标志物。结合TGM2已知的功能，认为它在肝损伤过程中发挥保护性作用，尤其在AFP表达阴性的肝细胞肝癌癌变过程中发挥重要作用。更为重要的是，不同AFP表达状态的肝细胞肝癌中，TGM2的表达特性，提示其可能发展成为一个有潜力的肝癌细胞的标志物。根据文献检索，目前国内外尚无相同的工作的报道。参考文献1.ParkinDM，BrayF，FerlayJ，PisaniP，全球癌症统计，2002(Globalcancerstatistics,2002).CA:临床医生肿瘤杂志(CA.CancerJ.Clin)，2005;55(2):74-108。2.FaraziPA，DePinhoRA,肝细胞肝癌致病因素从基因到环境(Hepatocellularcarcinomapathogenesis:fromgenestoenvironment).自然综述癌症(NatRevCancer)，2006，6(9):674-687。3.HeJ，GuDF，WuXG，ReynoldsK，DuanXF，YaoCH，Wang几，ChenCS，ChenJ，WildmanRP，KlagMJ，WheltonPK，中国男性和女性的主要死因分析(MajorCausesofDeathamongMenandWomeninChina).新英格兰医学杂志(NEnglJMed)，2005;353:1124-34。4.BergstrandCG，CzarB，从人类胎儿血清中新发现的一种蛋白片段(Demonstrationofanewproteinfractioninserumfromthehumanfetus).临床和实验观察的斯堪的纳维亚杂志(Scand.J.Clin.Lab.Invest.),1956;8:174-179。5.AbelevGI，PerovaS，KhramkovaNI，PostnikovaZA，IrlinI,由移植鼠肝细胞瘤产生的胚源性alpha球蛋白(Productionofembryonalalpha-globulinbytransplantablemousehepatomas).移植公报(Transplant.Bull),1963;1:74-180。6.TatarinovIuS,人类血清中当前已知的胚胎特异性抗原成分(Currentdataonembryo—specificantigeniccomponentsinthehumanbloodserum).Voprosymeditsinskokhimii杂志(Vopr.Med.Khim.)，1964;10:584-589。7.AbelevGI，AssecritovaIV，KraevskyNA，PerovaSD，PerevodchikovaNI，癌症病人中的胚源性血清alpha球蛋白诊断价值。(Embryonalserumalpha-globulinincancerpatients:diagnosticvalue).国际癌症杂志(Int.J.Cancer)，1967;2:551-558。8.MizejewskiGJ,正常和疾病状态下怀孕和婴幼儿期的血清alpha甲月台蛋白7JC平(Levelsofalpha—fetoproteinduringpregnancyandearlyinfancyinnormalanddiseasestates)，妇产科外科手术杂志(ObstetGynecolSurv)，2003;58(12):804-826。9.FujiyamaS，TanakaM，MaedaS,AshiharaH，HirataR，TomitaK，肝细胞肝癌的早期诊断和随访标志物以及患者管理(Tumormarkersinearlydiagnosis,follow—upandmanagementofpatientswithhepatocellularcarcinoma).肿瘤学(Oncology)，2002;62Suppl1:57-63。10.DeMasiS，TostiME，MeleA，肝细胞肝癌的筛查(Screeningforhepatocellularcarcinoma).消化道和肝疾病杂志(Dig.LiverDis)，2005;37(4):260-268。11.SpangenbergHC，Thi購R，BlumHE,肝细胞肝癌的血清学标志物(Serummarkersofhepatocellularcarcinoma).肝疾病研讨(Semin.LiverDis)，2006;26(4):385-390。12.MarreroJA，肝细胞肝癌(Hepatocellularcarcinoma).胃肠病学当前观点(Curr.Opin.Gastroenterol)，2003;19(3):243-249。13.ZemskovEA，JaniakA，HangJ，WaghrayA，BelkinAM,组织转谷氨酰胺酶在细胞-细胞外基质相互作用中的作用(Theroleoftissuetransglutaminaseincell-matrixinteractions).生命科学前沿(Front.Biosci.)，2006;11:1057-1076。14.FesusL，PiacentiniM，组织转谷氨酰胺酶2:—种迷样的多功負巨酵(Transglutaminase2:anenigmaticenzymewithdiversefunctions).生物化学科学趋势(TrendsBiochem.Sci.),2002;27(10):534-539。15.MangalaLS，MehtaK，肿瘤生物学研究中的组织转谷氨酰胺酵2(Tissuetransglutaminase(TG2)incancerbiology).实验肿瘤研究进展(Prog.Exp.TumorRes.)，2005;38:125-138。16.FesusL，SzondyZ，平衡细胞死亡和生存的转谷氨酰胺酶2(Transglutaminase2inthebalanceofcelldeathandsurvival).FEBS通讯(FEBSLett.)，2005;579(15):3297-3302。17.FacchianoF，FacchianoA，FacchianoAM,转谷氨酰胺酶2及其底物在人类疾病中的作用(Theroleoftransglutaminase-2anditssubstratesinhumandiseases).生物科学前沿(Front.Biosci.)，2006;11:1758-1773。18.RodolfoC，MormoneE，MatarreseP，CiccosantiF，FarraceMG，GarofanoE，PireddaL，FimiaGM，MalorniW，PiacentiniM，组织转谷氨酰胺酶2是一种多功能的仅有BH3结构域的蛋白质(TissuetransglutaminaseisamultifunctionalBH3-onlyprotein).生物化学杂志(J.Biol.Chem.)，2004;279(52):54783-54792。19.Her,JF，MangalaLS,MehtaK，组织转谷氨酰胺酶2在耐药乳腺癌细胞MCF-7中表达增加的意义(Implicationsofincreasedtissuetransglutaminase(TG2)expressionindrug-resistantbreastcancer(MCF-7)cells).癌基因(Oncogene)，2006;25(21):3049-3058。20.FokJY，EkmekciogluS，MehtaK，恶性黑色素瘤中组织转谷氨酰胺酶2表达的意义(Implicationsoftissuetransglutaminaseexpressioninmalignantmelanoma).肿瘤分子治疗(MolCancerTher.)，2006;5(6):1493-1503。21.Ve簡A，WangH，ManavathiB，FokJY，MannAP，KumarR，MehtaK,组织转谷氨酰胺酶在胰腺导管腺癌中表达增加及其在耐药和转移中的意义(Increasedexpressionoftissuetransglutaminaseinpancreaticductaladenocarcinomaanditsimplicationsindrugresistanceandmetastasis).肿瘤研究(CancerRes.)，2006;66(21):10525-10533。1722.FokJY，MehtaK，组织转谷氨酰胺酶诱导凋亡诱发因子表达并导致胰腺癌细胞凋亡(Tissuetransglutaminaseinducesthereleaseofapoptosisinducingfactorandresultsinapoptoticdeathofpancreaticcancercells),凋亡杂志(Apoptosis),2007;12(8):1455-1463。23.XuL，BegumS，HearnJD，HynesR0，GPR56,—个非典型的G-蛋白偶联受体结合组织转谷氨酰胺酶2(TG2)并抑制黑色素瘤细胞生长和转移(GPR56,anatypicalGprotein-coupledreceptor,bindstissuetransglutaminase,TG2，andinhibitsmelanomatumorgrowthandmetastasis).美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)，2006;103(24):9023-9028。24.MangalaLS,ArunB，SahinAA，MehtaK，组织转谷氨酰胺酶"i秀发的细胞外基质改变抑制肿瘤^f曼袭(Tissuetransglutaminase—inducedalterationsinextracellularmatrixinhibittumorinvasion).分子肿瘤(MolCancer)，2005;4:33。25.MirzaA，LiuSL，FrizellE，ZhuJ，MaddukuriS，MartinezJ，DaviesP，SchwartingR，NortonP，ZernMA，组织转谷氨酰胺酶被NF-kappaB调节，及其在肝损伤和肝纤维化中的作用(Arolefortissuetransglutaminaseinhepaticinjuryandfibrogenesis，anditsregulationbyNF—kappaB).美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)，1997;272(2Pt1):G281-288。26.GrenardP，Bresson-陽niS，ElAlaouiS,ChevallierM，VuittonDA，Ricard-BlumS,转谷氨酰胺酶中介的交联反应参与人肝纤维化过程中的细胞外基质稳定过程(Transglutaminase-mediatedcross-linkingisinvolvedinthestabilizationofextracellularmatrixinhumanliverfibrosis).肝脏病学杂志(J,Hepatol.)，2001;35(3):367-375。27.PiacentiniM，FarraceMG，HassanC，SerafiniB，AutuoriF,组织转谷氨酰胺酶在肝纤维化过程中由凋亡细胞释放入细胞外基质('Tissue'transglutaminasereleasefromapoptoticcellsintoextracellularmatrixduringhumanliverfibrogenesis)，病理学杂志(J.Pathol.)，1999;189(1):92-98。28.NardacciR，LoIacono0，CiccosantiF，FalascaL，AddessoM，AmendolaA，AntonucciG，CraxiA，FimiaGM，IadevaiaV，MelinoG，RucoL，TocciG，IppolitoG，PiacentiniM，转谷氨酰胺酶2在肝损伤过程中发挥保护作用(TransglutaminasetypeIIplaysaprotectiveroleinhepaticinjury).美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)，2003;162(4):1293-1303。29.SarangZ，MolnarP,NemethT，GombaS，KardonT，MelinoG，CotecchiaS，FesusL，SzondyZ，组织转谷氨酰胺酶2(TG2)具有G蛋白活性，在小鼠中拮抗Fas-中介的肝细胞死亡(Tissuetransglutaminase(TG2)actingasGproteinprotectshepatocytesagainstFas-mediatedcelldeathinmice)肝脏病学(Hepatology)，2005;42(3):578-587。30.PengSY，ChenWJ，LaiPL,JengYM,SheuJC，HsuHC，肝细胞肝癌中高水平的甲胎蛋白与临床分期、早期复发和不良预后相关肝炎病毒感染、年龄、p53和beta-catenin突变的意义(Highalpha-fetoproteinlevelcorrelateswithhighstage,earlyrecurrenceandpoorprognosisofhepatocellularcarcinoma:significanceofhepatitisvirusinfection,age,p53andbeta-cateninmutations)国际癌症杂志(Int.J.Cancer.),2004;112(1):44-50。权利要求1.检测待测生物样品中的TGM2水平，进而获得作为中间结果的信息的方法，所述方法包括步骤1)测定待检生物样品中的TGM2水平；2)比较待检生物样品中的TGM2水平和标准生物样品的TGM2水平；3)获得作为中间结果的信息；4)根据比较结果确定待检生物样品是否有可能是HCC样品。2.权利要求l的方法，进一步包括与AFP联合检测。3.权利要求1或2的方法，其中步骤l)的生物样品是已经脱离人体或者动物体的组织、体液或者排泄物。4.权利要求1或者2的方法，其中步骤l)的生物样品是组织和血清。5.权利要求1或2的方法，其中步骤1)的测定是用Western印记、免疫组织化学或ELISA法。6.权利要求1的方法，其中步骤1)的测定是对TGM2水平与血清AFP水平呈负相关关系的测定。7.使用TGM2检测AFP阴性的HCC的方法，所述方法包括步骤1)测定待检生物样品中的TGM2水平；2)比较待检生物样品中的TGM2水平和正常生物样品对照的TGM2水平；3)根据比较结果确定待检生物样品是否是HCC样品。8.权利要求6的方法，其中步骤l)的生物样品是组织。9.权利要求6的方法，其中步骤1)的测定是Western印记或者免疫组织化学或ELISA法。10.TGM2作为HCC的标志物的用途。11.权利要求10的用途，其中TGM2与AFP联合应用。12.用于检测TGM2的AFP阴性的HCC检测试剂盒。13.权利要求12的AFP阴性的HCC检测试剂盒用途，其中包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体。14.用于联合检测TGMZ和AFP的HCC检测试剂盒，其中包括作为标准的TGM2、抗TGM2抗体；作为标准的AFP、抗AFP抗体。全文摘要本发明涉及使用TGM2的检测方法、检测试剂盒及其应用，具体而言，涉及含有单独使用新的标志物TGM2检测HCC或者与AFP联用检测HCC的方法、检测试剂盒及其应用。文档编号G01N33/574GK101629958SQ20081013259公开日2010年1月20日申请日期2008年7月17日优先权日2008年7月17日发明者乔媛媛,芳刘,周兰萍,孙玉琳,张达矜,佳曲,蔡建强,杨许,赵晓航申请人:中国医学科学院肿瘤研究所;中国人民解放军海军总医院