专利名称：一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法
技术领域：
本发明涉及一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法。
背景技术：
自然界中，脊椎动物硬组织的主要生物矿物相是羟基磷灰石。研究发现， 人工合成的羟基磷灰石具有与矿物相羟基磷灰石相同的成分、结构和优秀的生 物相容性，因此被认为是最理想的骨组织修复替代材料之一，在临床上已被广 泛用于骨组织缺失和缺损的修复和替代。
近年来，随着分析检测方法和技术的飞速发展，人们发现构成人体硬组织 的羟基磷灰石颗粒的基本构成单元都保持在纳米尺度一有序的羟基磷灰石颗粒
镶嵌在胶原蛋白中，赋予了骨组织优秀的生物学和力学性能"Gao H., Ji B.， Jager I. L., Arzt E.， Fratz P., PNAS， 2003,100, 5597; Curry J . D., Proc. R. Soc. Lond. B,1997,196 , 443"。生物矿化及仿生材料研究使得人们将目标转向了纳米羟基磷 灰石。目前认为人体内钙化过程是在正确时间、正确地点，生成和维持正确量 和正确结构的矿化产物"王夔，化学通报，2003， 15， 428 ;杨晓达，张天蓝， 王夔，化学进展，2004， 16， 836"，在此过程中，细胞和有机基质起到了重要 的调控作用，但是其调控机理却知之甚少。此外，作为一种新型的生物医用材 料，人们更多关注的是纳米羟基磷灰石的生物相容性。目前比较一致的结论是 纳米羟基磷灰石能够抑制肿瘤细胞和癌细胞的增殖和分化"Fu Q， ZhouN, Huang W, Wang D, Zhang L， Li H.， J Biomed. Mater. Res.(A) 2005,74A 156; Wang Y., Yan Y.H.， Li Sh.P., J Wuhan Univ. Tech.(mater. Scien. Edition) 2005,20， 184",但对 于普通细胞的影响则具有多样性。相关的研究工作还有很多"Thomas J.W., Celaletdin E.， Robert H.D., Rochard W.S., Biomaterials 2000,21,1803; Sun J" Lin F., Hung T.， Tsuang Y., Chang W., Liu H., J. Biomed. Mater. Res. 1999,311; Welzel T., Radtke I., Meyer-Zaika W.， Heumannb R., Epple M. J Mater. Chem. 2004,14,2213."。磷酸钙这种特殊的细胞生物相容性以及近来在用作非病毒基因/ 药物载体以及龋齿修复和牙小管填充等方面表现出来的潜能使得人们对其在生 物医学方面的应用寄予厚望。但是关于磷酸钙与细胞作用的机理研究却刚刚起 步，很多疑问还亟待回答，例如磷酸钙是在哪个位置上对细胞产生影响，细胞 膜上还是细胞内？它的哪些特征是影响细胞的关键因素？它通过哪些途径实现对细胞的生物学行为的影响？是否可以通过人为改变磷酸钙的物化性能来调控 细胞的行为？这些问题的解决对于我们了解生物矿物矿化机理和设计开发新型 医用材料以及制定安全性评价标准都有着深远且现实的意义。
进行纳米羟基磷灰石的生物相容性、矿化机理以及与细胞相互作用的研究 时，我们首先遇到的一个问题是如何对该种材料进行示踪。解决这个问题最有 效的办法是对该材料进行生物标记。例如，将近红外荧光量子点与羟基磷灰石 复合"储茂泉，金鑫，发明专利，近红外荧光量子点标记的羟基磷灰石及其制
备方法和应用。公开号CN1693410A"，或者将铽、铕等"Doat A.， Fanjul M.， Pellie F.， Hollande E., Lebugle A.， Biomaterials 2003,24， 3365; Riwotzki K.， Meyssamy H.， Schnablegger H. Angew Chem lnt Ed. 2001,40， 573."稀土离子掺杂到羟基磷灰石 中，使其可发出荧光等，但这些材料的制备方法通常比较复杂，而且量子点和 稀土元素的生物相容性还有待于考证。
发明内容
为了克服背景技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种对羟基磷灰 石进行荧光标记的方法，所得材料具有很好的生物相容性，稳定的光学性质， 较窄的荧光激发波长范围，适用于需要对羟基磷灰石进行示踪的环境中，尤其 适用于羟基磷灰石和细胞间界面及作用机理的研究。
本发明采用的技术方案是
配制重量百分比为1.5 3%的重碳酸钠缓冲溶液，将异硫氰酸荧光素溶解在 该缓冲溶液中，控制异硫氰酸荧光素在缓冲溶液中的浓度为0.02~0.1克每升； 再将羟基磷灰石颗粒分散在上述溶液中，颗粒浓度为0.5~1.5克每升，搅拌0.5~2 小时；利用羟基磷灰石的强吸附作用将异硫氰酸荧光素吸附到颗粒表面，再将 该悬浊液避光环境保存在1 8'C下继续作用10 20小时后，通过离心、透析和过 滤作用除去颗粒表面未吸附的荧光素；将标记好的羟基磷灰石颗粒在35 45'C避 光环境中真空干燥，得到干燥的荧光标记的羟基磷灰石颗粒。
所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为110-125 °C，压力为104-108kPa， 在15 20min下进行灭菌。
所述荧光标记的羟基磷灰石的最大吸收波长为490纳米，最大发射波长为 503纳米。
本发明具有的有益效果是
本发明采用的标记物异硫氰酸荧光素是一种生物荧光素，具有较好的生物 相容性；经过长时间反应和充分洗涤之后，异硫氰酸荧光素己经与羟基磷灰石颗粒实现牢固结合，使用过程中不会从羟基磷灰石表面脱离下来对试验结果造
成负面影响；所得到的荧光物质吸收峰范围较窄，为480 510纳米之间，适用 于多种荧光同时存在的环境中。本发明可应用于材料和生物医学研究领域，尤 其适用于羟基磷灰石颗粒与细胞相互作用时的界面、过程及机理研究。
图1是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒的荧光图谱。
图2是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒的共聚焦显微镜图片。
图3是经过异硫氰酸荧光素标记后的羟基磷灰石颗粒在细胞中的共聚焦图片。
具体实施例方式
本发明中所用到的羟基磷灰石是一种弱碱性磷酸钙盐，包括人工合成的羟 基磷灰石或动物体内的羟基磷灰石，可通过固相反应法、水热法、水解法、共 沉淀法、溶胶-凝胶法、微乳液法等或者通过煅烧动物骨的方法获得，得到的颗 粒是尺寸为10至10微米的轻基磷灰石颗粒，呈针状、棒状、球状、多边形状 或不规则颗粒状。
一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，以异硫氰酸荧光素为标记物，使 羟基磷灰石标记过程在异硫氰酸荧光素水溶液中进行，经过反应、低温陈化、 离心分离、洗涤、透析和密闭真空干燥工艺步骤在羟基磷灰石表面复合上异硫 氰酸荧光素荧光物质。
实施例l:
一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，选用直径为40纳米左右的球状羟 基磷灰石颗粒，其标记过程依次为
(1) 将分析纯的重碳酸钠1.5克溶解于50毫升去离子水中，得到缓冲溶液， 用磁力搅拌器搅拌至完全溶解；
(2) 取异硫氰酸荧光素粉末1毫克，溶解在上述第一步的重碳酸钠溶液中， 在黑暗环境下磁力搅拌30分钟。
(3) 取羟基磷灰石颗粒75毫克，放入上述第二步中配制好的异硫氰酸荧光素 溶液中，黑暗环境下磁力搅拌0.5小时；
(4) 将上述第(3)步悬浊液放置在4'C黑暗环境下低温反应10小时；
(5) 对上述第(4)步所得悬液在8000g离心，分离出经过标记的羟基磷灰石颗 粒，用去离子水离心清洗三次；
(6) 分别将2.65克分析纯碳酸钠和18.9克分析纯碳酸氢钠溶解于500毫升去离子水中，用氨水调节其pH值至9.0，制得pH9.0的碳酸盐缓冲溶液；
(7) 将上述第(5)步得到的羟基磷灰石颗粒放置在上述第(6)步碳酸盐缓冲溶 液中透析5小时，透析膜分子量为10000，透析过程在黑暗环境中进行；
(8) 将上述第(7)步悬浊液8000g离心，分离出羟基磷灰石颗粒，黑暗环境中 置于40。C真空烘箱中干燥24小时，得到荧光标记的羟基磷灰石颗粒。
(9) 所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为110 °C，压力为104kPa，灭菌 15分钟。
(10) 用荧光光谱仪对标记后的羟基磷灰石的吸收光谱和发射光谱进行了检 测(见图l所示)，结果表明该颗粒的吸收波长范围约为480-510纳米之间，最 大吸收波长为490纳米，最大发射波长为503纳米；采用激光共聚焦显微镜对 所得到的羟基磷灰石颗粒进行分析(见图2所示)，结果表面在激发波长为488 纳米时，羟基磷灰石颗粒发出明亮的绿色荧光；将标记后的羟基磷灰石颗粒(图 中虚线标出部分)与细胞共培养后，用激光共聚焦显微镜观察(见图3所示)， 结果表明该荧光强度很高，可穿透细胞膜，清晰的表明羟基磷灰石颗粒所在位 置。
(11) 将标记后的羟基磷灰石颗粒置于灯光下照射6小时后，该颗粒携带的荧 光完全消失。
实施例2:
一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，选用尺寸为200纳米的不规则羟 基磷灰石颗粒，其标记过程依次为
(1) 分析纯的重碳酸钠1.2克溶解于50毫升去离子水中，得到缓冲溶液，用 磁力搅拌器搅拌至完全溶解；
(2) 取异硫氰酸荧光素粉末3毫克，溶解在上述第一步的重碳酸钠溶液中， 在黑暗环境下磁力搅拌30分钟。
(3) 取羟基磷灰石颗粒30毫克，放入上述第二步中配制好的异硫氰酸荧光素 溶液中，黑暗环境下磁力搅拌1.5小时；
(4) 将上述第(3)步悬浊液在rC避光环境中低温反应20小时；
(5) 对上述第(4)步所得悬液在8000g离心，分离出经过标记的羟基磷灰石颗 粒，用去离子水离心清洗三次；
(6) 分别将2.65克分析纯碳酸钠和18.9克分析纯碳酸氢钠溶解于500毫升去 离子水中，用氨水调节其pH值至9.0，制得pH9.0的碳酸盐缓冲溶液；
(7) 将上述第(5)步得到的羟基磷灰石颗粒放置在上述第(6)步碳酸盐缓冲溶液中透析10小时，透析膜分子量为10000，透析过程在黑暗环境中进行；
(8) 将上述第(7)步悬浊液8000g离心，分离出羟基磷灰石颗粒，黑暗环境中 置于45'C真空烘箱中干燥24小时，得到荧光标记的羟基磷灰石颗粒。
(9) 所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为U5。C，压力为105kPa，灭菌 20分钟。
(10) 用荧光光谱仪对标记后的羟基磷灰石的吸收光谱和发射光谱进行了检 测，其结果与实施例l所得结果相似，即颗粒的最大吸收波长为490纳米，最 大发射波长约为503纳米；在激发波长为488纳米时，羟基磷灰石颗粒发出明 亮的绿色荧光。
(11) 将标记后的羟基磷灰石颗粒置于普通灯光下照射6小时后，该颗粒还有 残余绿色荧光。
实施例3:
一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，选用尺寸为100纳米的针状羟基
磷灰石颗粒，其标记过程依次为
(1) 分析纯的重碳酸钠1.0克溶解于50毫升去离子水中，得到缓冲溶液，用 磁力搅拌器搅拌至完全溶解；
(2) 取异硫氰酸荧光素粉末2毫克，溶解在上述第一步的重碳酸钠溶液中， 在黑暗环境下磁力搅拌30分钟。
(3) 取羟基磷灰石颗粒60毫克，放入上述第二步中配制好的异硫氰酸荧光素 溶液中，黑暗环境下磁力搅拌1.5小时；
(4) 将上述第(3)步悬浊液在8°。避光环境中低温反应20小时；
(5) 对上述第(4)步所得悬液在8000g离心，分离出经过标记的羟基磷灰石颗 粒，用去离子水离心清洗三次；
(6) 分别将2.65克分析纯碳酸钠和18.9克分析纯碳酸氢钠溶解于500毫升去 离子水中，用氨水调节其pH值至9.0，制得pH9.0的碳酸盐缓冲溶液；
(7) 将上述第(5)步得到的羟基磷灰石颗粒放置在上述第(6)步碳酸盐缓冲溶 液中透析10小时，透析膜分子量为10000,透析过程在黑暗环境中进行；
(8) 将上述第(7)步悬浊液8000g离心，分离出羟基磷灰石颗粒，黑暗环境中 置于4(TC真空烘箱中干燥24小时，得到荧光标记的羟基磷灰石颗粒。
(9) 所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为125'C，压力为108kPa，灭菌 15分钟。
(10) 用荧光光谱仪对标记后的羟基磷灰石的吸收光谱和发射光谱进行了检测，其结果与实施例l所得结果相似，即颗粒的最大吸收波长为490纳米，最 大发射波长约为503纳米；在激发波长为488纳米时，羟基磷灰石颗粒发出明 亮的绿色荧光。
(ll)将标记后的羟基磷灰石颗粒置于普通灯光下照射6小时后，该颗粒还有 残余绿色荧光。
权利要求
1. 一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在于配制重量百分比为1.5～3％的重碳酸钠缓冲溶液，将异硫氰酸荧光素溶解在该缓冲溶液中，控制异硫氰酸荧光素在缓冲溶液中的浓度为0.02～0.1克每升；再将羟基磷灰石颗粒分散在上述溶液中，颗粒浓度为0.5～1.5克每升，搅拌0.5～2小时；利用羟基磷灰石的强吸附作用将异硫氰酸荧光素吸附到颗粒表面，再将该悬浊液避光环境保存在1～8℃下继续作用10～20小时后，通过离心、透析和过滤作用除去颗粒表面未吸附的荧光素；将标记好的羟基磷灰石颗粒在35～45℃避光环境中真空干燥，得到干燥的荧光标记的羟基磷灰石颗粒。
2. 根据权利要求1所述一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在 于所述荧光标记的羟基磷灰石颗粒在温度为110 125 °C,压力为104-108kPa， 在15 20min下进行灭菌。
3. 根据权利要求1所述一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法，其特征在 于所述荧光标记的羟基磷灰石的最大吸收波长为490纳米，最大发射波长为 503纳米。
全文摘要
本发明公开了一种对羟基磷灰石进行荧光标记的方法。该方法是将生物荧光素—异硫氰酸荧光素通过吸附或共价键等方法连接到羟基磷灰石颗粒上，使羟基磷灰石颗粒被标记上荧光。本发明采用的标记物异硫氰酸荧光素，是一种生物荧光素，具有较好的生物相容性；经过长时间反应和充分洗涤之后，异硫氰酸荧光素可以与羟基磷灰石颗粒实现牢固结合，使用过程中不会从羟基磷灰石表面脱离下来对试验结果造成负面影响；所得到的荧光物质吸收峰范围较窄，为480～510纳米之间，适用于多种荧光同时存在的环境中。本发明可应用于材料和生物医学研究领域，尤其适用于羟基磷灰石颗粒与细胞相互作用时的界面、过程及机理研究。
文档编号G01N21/64GK101419140SQ200810162190
公开日2009年4月29日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者姚菊明, 李恭楚, 王秀华, 蔡玉荣 申请人:浙江理工大学