专利名称：一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法
技术领域：
本发明属中药技术领域，涉及一种中药化学成分的提取纯化方法，特别是涉及自中
药荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法。
背景技术：
中药化学对照品是中国药典、部(局)颁标准所收载的，在中药检定时为求得鉴别、 含量测定、杂质和相关物质检査等项的准确一致，用以与被测样品对比，判定其质量的 实物标准。中药化学对照品是制定中药材、中药提取物、中药饮片、中药配方颗粒、中 成药质量标准必不可少的物质基础；是指导GAP基地建设，实现中药原料生产、产地 加工规范化和质量控制的重要保证；是进行GMP建设，实现中药饮片生产、中成药生 产规范化，确保临床用药安全、有效、质量稳定可控的重要保证；是加快中药新药研制， 提高中药新药研制水平，加速中药现代化和国际化进程的关键。因此，中药化学对照品 的制备是中药标准化、现代化、国际化规范建立的关键和基础，常常是一个对照品的出 现，即带动一批含此种成分中药检验方法及质量标准的建立。2-羟基-l-甲氧基阿朴啡是 荷叶的主要活性成分之一，开发简便实用、经济可行、稳定可控的2-羟基-l-甲氧基阿朴 啡对照品制备技术，确保该对照品的质量稳定和供应充足，满足荷叶药材在生产、加工、 流通、使用中的质量检测，确保荷叶药材、提取物、饮片、炮制品、配方颗粒和含荷叶 制剂的质量能够得到有效控制和合理评价，具有重要意义。目前未见有关自中药荷叶中 分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡方法的报道和专利申请。
技术方案
本发明的目的在于提供一种从荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法。 本发明的目的是通过如下技术方案实现的
1. 荷叶提取物的制备
取荷叶药材，加入10~16倍体积份的70~90%乙醇，加热回流提取0.5 2小时，静 置，过滤。药渣用同样的方法再提取2~4次，提取液合并，水浴(60~70°C)减压回收 溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏。
2. 2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品的分离
42-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品的分离采用硅胶干柱层析方法。
取上述荷叶提取物浸膏，加药材2 5倍体积份的1。/。HC1水溶液超声分散G0min， 100kHz)，离心(30min， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至6~8，用氯
仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂， 得氯仿萃取物。
氯仿萃取物采用硅胶(200~300目)干柱色谱法分离，方法为取萃取物用5~10 倍体积份甲醇溶解，按质量比1:1~3拌入硅胶(上海五四化学试剂有限公司，200~300 目)，自然干燥，得到拌样硅胶；另按药材与硅胶质量比为1~2:1取硅胶(上海五四化 学试剂有限公司，200 300目)干法装柱，色谱柱径高比1:5 10。将拌样硅胶装于柱 顶，以石油醚-丙酮(1~4:1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1 3倍柱 体积。色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20 25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减 压回收溶剂，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G 预制薄层板(青岛海洋化工厂)，展开剂为石油醚-丙酮U 4:l)混合溶剂，显色剂为 改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的4~7至9~16份甲醇洗脱液，回 收溶剂得2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品。
3. 2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的纯化
2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品采用氧化铝(100~200目)柱色谱法纯化，方法为取 2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品用5~10倍体积份甲醇溶解，按质量比1:1~3拌入氧化铝(上 海五四化学试剂有限公司，100~200目)，自然干燥，得到拌样氧化铝；另按2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品与氧化铝质量比为20~50:1取氧化铝(上海五四化学试剂有限公司， 100-200目)湿法装柱，色谱柱径高比1:5~10。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂 为石油醚-丙酮U 4:l)，分份收集，每份20 100mL，减压浓縮至小体积(约5 15mL) 后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G预制薄层板(青岛海洋化工厂)， 展开剂为石油醚-丙酮(1~4:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟 基-l-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得2-羟基-l-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。
4. 纯度检查
(1) 差示扫描量热法(DSC)检查纯度。仪器岛津公司DSC-60型差示扫描量 热仪。测试温度范围150~250°C;升温速度0.5 5。Omin";测试样品用量2~4mg。 测定2-羟基-l-甲氧基阿朴啡纯度大于98.00%。
(2) 高效液相色谱法(HPLC)检查纯度。仪器美国Waters公司Watere 1525高效液相色谱仪，Waters2996 二极管阵列检测器，Empower色谱工作站，Waters公司25pL 可调进样器。色谱柱HypersilC18， 250 mm x 4.6 mm， 5nm (美国Thermo公司)。流 动相乙腈-0.1%三乙胺(40 50:60 50);流速1.0-1.2mL/min;柱温30-35 。C;检 测波长254nm、 272nm、 300nm;进样量0.5~5|ig。归一化法测定2-羟基-l-甲氧基阿 朴啡纯度均大于98.00%。 5.结构测定
2-羟基-l-甲氧基阿朴啡为白色针状结晶(石油醚-丙酮)，分子式为C18H19N02，分 子量为281，熔点195 197'C，易溶于氯仿、甲醇。365nm紫外灯下呈淡紫色荧光，改 良碘化铋钾试液显色为橙红色。UV、ax(nm): 272(MeOH)。 EI-MS: m/z 281[M]+， 266 [M-CH3〗+， 251 [M-2CH3]+， 250， 178;'關MR(CDCl3， 500MHz): S 8.27(H， d， J二8.0Hz， OH)， 7.25， 7.26， 6.60， 3.56(3H， s， 0-CH3), 3.11(2H， t， H-5)， 3.01(2H， t， H-7)， 2.68(2H， t， H-4)， 2.55(3H， s， N-CH3)， 2.48(1H， d， J二4.0， 8.0 Hz, H國6a); 13C-NMR(CD3OD， 125MHz): S 147.9(C-2)， 143.0(01)， 136.3(C-7a)， 131.8(C-lla)， 128.0(C-8)， 127.3(C-la)， 127.2(C-9)， 127.2(C國lb)， 127.3(C國ll)' 127.3(C-4a)， 125.8(C-10)， 114.1(C-3)， 62.4(C-6a)， 60.3(OCH3)， 53.3(C陽5)， 43.8(N-CH3)， 34.8(C-7)， 28.7(C國4)。 2-羟基-l-甲氧基阿朴啡结构式如下
H3CO
图1差示扫描量热法测定2-羟基-l-甲氧基阿朴啡熔融曲线 图2不同检测波长下2-羟基-l-甲氧基阿朴啡HPLC图谱
实施例l:
取荷叶药材200g，用16倍体积份的90%乙醇回流加热提取3次，每次1小时。合 并3次提取液，水浴(60°C)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏40g。荷叶提取物浸膏40g加lOOOmL P/。HC1水溶液超声分散G0min， 100kHz)，离心 GOmin， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至7.5，用氯仿萃取至水层无 生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物1.2g。
氯仿萃取物1.2g用8mL甲醇溶解，拌入2g硅胶(200~300目)，自然干燥，得到 拌样硅胶；另取硅胶(200-300目)200g，干法装柱(直径2.5cm，高17.5cm)。将拌样 硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(2:1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱 l倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20份，各份用甲醇洗脱，洗脱液 减压回收溶剂，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶 G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(3:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。 其中第6~12份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基-l-甲氧 基阿朴啡粗品0.56g。
取2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品0.56g，用5mL甲醇溶解，加到lg氧化铝(100~200 目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝20g (100~200目)湿法装柱(色谱柱直径2cm， 高10cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(2.5:1)，分份收集， 每份20mL，减压浓縮至约8mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G 预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合 并含有2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-l-甲氧 基阿朴啡56.4mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98%。
实施例2:
取荷叶药材500g，用75%乙醇加热回流提取2次，每次2小时，溶剂用量第一次 为16倍体积份，第二次为14倍体积份。合并2次提取液，水浴(60°C)减压回收溶剂 至无醇味，得荷叶提取物浸膏105g。
荷叶提取物浸膏105g加1500mLl。/。HCl水溶液超声分散(30min， 100kHz)，离心 G0min， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至7.0，用氯仿萃取至水层无 生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物2.8g。
氯仿萃取物2.8g用15mL甲醇溶解，拌入4.5g硅胶(200-300目)，自然干燥，得 到拌样硅胶；另取硅胶(200~300目)330g，干法装柱(直径3cm，高30cm)。将拌样 硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(3:1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱 1.5倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为 硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1.5:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾 试液。其中第6~15份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基 -l-甲氧基阿朴啡粗品1.8g。
取2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品1.8g，用10mL甲醇溶解，加到4g氧化铝(100-200 目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝40g (100-200目)湿法装柱(色谱柱直径2.5cm， 高13cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(4:1)，分份收集，每 份30mL，减压浓縮至约10mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G 预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合 并含有2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-l-甲氧 基阿朴啡146mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98%。
实施例3:
取荷叶药材lkg，用70%乙醇加热回流提取2次，每次1.5小时，溶剂用量为14倍 体积份。合并2次提取液，水浴(7(TC)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏220g。
荷叶提取物浸膏220g加2000mLl。/。HCl水溶液超声分散GOmin， 100kHz)，离心 (30min， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至6.5，用氯仿萃取至水层无 生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物7.2g。
氯仿萃取物7.2g用40mL甲醇溶解，拌入10g硅胶(200-300目)，自然干燥，得 到拌样硅胶；另取硅胶(200-300目)625g，干法装柱(直径8.5cm，高43cm)。将拌 样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(1.5:1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析， 洗脱2倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为20份，各份用甲醇洗脱， 洗脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附 剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(2:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋 钾试液。其中第7~13份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟 基-l-甲氧基阿朴啡粗品5.0g。
取2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品5.0g，用25mL甲醇溶解，加到5g氧化铝(100~200 目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝100g (100~200目)湿法装柱(色谱柱直径3cm， 高22cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(3:1)，分份收集，每 份50mL，减压浓縮至约10mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(2:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合 并含有2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-l-甲氧 基阿朴啡286mg。高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度大于98%。
实施例4:
取荷叶药材2kg，用85%乙醇加热回流提取3次，每次1小时，溶剂用量为12倍 体积份。合并3次提取液，水浴(6(TC)减压回收溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏450g。
荷叶提取物浸膏450g加5000mL 1%HC1水溶液超声分散(30min， 100kHz)，离心 GOmin， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至7.5，用氯仿萃取至水层无 生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂，得氯仿萃取物 14.5g。
氯仿萃取物14.5g用100mL甲醇溶解，拌入25g硅胶(200~300目)，自然干燥， 得到拌样硅胶；另取硅胶(200~300目)lkg，干法装柱(直径9cm，高63cm)。将拌样 硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(2.5:1)混合溶剂为展开剂，下行法进行干柱层析，洗 脱2.5倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平均切割为25份，各份用甲醇洗脱，洗 脱液减压回收溶剂后，得各洗脱物。各洗脱物用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂 为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾 试液。其中第5~11份含有2-羟基-1-甲氧基阿朴啡，合并，减压回收溶剂，得到2-羟基 -l-甲氧基阿朴啡粗品Ug。
取2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品llg，用70mL甲醇溶解，加到20g氧化铝(100~200 目)中，拌匀，挥干溶剂；另取氧化铝240g (100 200目)湿法装柱(色谱柱直径4cm， 高30cm)。将拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(2.5:1)，每份100mL， 减压浓縮至约15mL后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G预制薄层板， 展开剂为石油醚-丙酮(2:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液。合并含有2-羟基 -1-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得白色针状结晶2-羟基-1-甲氧基阿朴啡56511^。 高效液相色谱法及差示扫描量热法的定其纯度大于98%。
权利要求
1.一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法，其特征在于荷叶用乙醇加热回流提取得荷叶提取物浸膏；浸膏用1％HCl水溶液超声分散，取上清液调pH，氯仿萃取得氯仿萃取物；萃取物采用硅胶干柱色谱法分离得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品；粗品采用氧化铝柱色谱法纯化得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。
2. 如权利要求l所述的自荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法，其特征 在于取荷叶药材，加入10 16倍体积份的70~90%乙醇，加热回流提取0.5~2小时，静 置，过滤；药渣用同样的方法再提取2 4次，提取液合并，水浴(60 70°C)减压回收 溶剂至无醇味，得荷叶提取物浸膏。
3. 如权利要求l所述的自荷叶中分离制备2-径基-l-甲氧基阿朴啡的方法，其特征 在于取荷叶提取物浸膏，加药材2~5倍体积份的1%HC1水溶液超声分散(30min， 100kHz)，离心GOmin， 3000rpm)，上清液用lmol/LNaOH溶液调pH值至6~8，用氯 仿萃取至水层无生物碱成分(改良碘化铋钾试液显色为阴性)，氯仿萃取液回收溶剂， 得氯仿萃取物。
4. 如权利要求l所述的自荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法，其特征 在于取氯仿萃取物用5~10倍体积份甲醇溶解，按质量比1:1~3拌入硅胶(200~300目)， 自然干燥，得到拌样硅胶，另按药材与硅胶质量比为1 2:1取硅胶(200 300目)干法 装柱，色谱柱径高比1:5 10;将拌样硅胶装于柱顶，以石油醚-丙酮(1 4:1)混合溶剂 为展开剂，下行法进行干柱层析，洗脱1 3倍柱体积，色谱柱挥干展开剂，自上而下平 均切割为20 25份，各份用甲醇洗脱，洗脱液减压回收溶剂，得各洗脱物；各洗脱物用 薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮(1~4:1)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液；合并含有2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的 4~7至9~16份甲醇洗脱液，回收溶剂得2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品。
5. 如权利要求l所述的自荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法，其特征 在于取2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品用5~10倍体积份甲醇溶解，按质量比1:1~3拌入氧 化铝(100~200目)，自然干燥，得到拌样氧化铝，另按2-羟基-l-甲氧基阿朴啡粗品与 氧化铝质量比为20~50:1取氧化铝(100~200目)湿法装柱，色谱柱径高比1:5 10;将 拌样氧化铝加于柱顶，洗脱，洗脱剂为石油醚-丙酮(l 4:l)，分份收集，每份2(M00mL， 减压浓縮至小体积(约5~15mL)后，用薄层色谱检识，薄层色谱条件吸附剂为硅胶G预制薄层板，展开剂为石油醚-丙酮U 4:l)混合溶剂，显色剂为改良碘化铋钾试液； 合并含有2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的流份，避光自然结晶，得2-羟基-l-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。
6. 如权利要求l所述的自荷叶中分离制备2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的方法，其特征 在于分离制备的2-羟基-l-甲氧基阿朴啡白色针状结晶经高效液相色谱法及差示扫描量 热法测定其纯度均大于98%。
7. 如权利要求6所述的采用高效液相色谱法测定2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的纯度， 其特征在于该方法是色谱柱为Hypersilds柱(250mmx4.6mm， 5|xm);流动相为乙 腈-0.1%三乙胺(40~50:60~50);流速为1.0~1.2mL/min;柱温为30~35 。C;检测波长为 254nm、 272nm和300nm;进样量为0.5 5pg。
8. 如权利要求6所述的采用差示扫描量热法测定2-羟基-l-甲氧基阿朴啡的纯度， 其特征在于该方法是测试温度范围为150~250°C;升温速度为0.5 5'Omin";测试样 品用量为2~4mg。
全文摘要
本发明公开了一种自荷叶中分离制备2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的方法。荷叶用乙醇加热回流提取得荷叶提取物浸膏；浸膏用1％HCl水溶液超声分散，取上清液调pH，氯仿萃取得氯仿萃取物；萃取物采用硅胶干柱色谱法分离得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡粗品；粗品采用氧化铝柱色谱法纯化得到2-羟基-1-甲氧基阿朴啡白色针状结晶。经高效液相色谱法及差示扫描量热法测定其纯度均大于98％。
文档编号G01N25/20GK101575316SQ200910147799
公开日2009年11月11日 申请日期2009年6月22日 优先权日2009年6月22日
发明者斌 刘, 昊 吴, 伟 王 申请人:斌 刘