专利名称：：稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法
技术领域：
：本发明涉及金霉素药物的检测方法，具体涉及一种稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，属于药物分析
技术领域：
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背景技术：
：金霉素(chlortetracycline，CTC)，化学名6-甲基_4_(二甲氨基)_3，6，10，12，12a，-五羟基-1，11-二氧代-7-氯-1，4，4a，5，5a，6，11，12a_八氢_2_并四苯甲酰胺盐酸盐。它是从金色链霉素的培养液中提取的广谱抗生素，对革兰氏阳性菌、阴性菌、立克次体和大型病毒有广泛的抑制能力。虽然金霉素药效明显，但是其可在肝中富集，毒性反映主要表现为对内脏的损害；易在骨骼和牙齿中沉积，导致牙齿持久染色；还会出现肌肉酸痛等症状，甚至造成过敏反应、二次感染等作用。因此金霉素一般不用于人体，而被广泛用作抗菌促生长饲料添加剂。金霉素作为饲料添加剂已被世界认可，且其效果也是确切的。但过量添加会造成动物组织中的残留，以及对周边土壤和水体的排放污染，使大多菌种产生抗药性，从而危害人体健康，因此许多国家对CTC残留例行监控。我国于1995年版药典规定金霉素含量测定方法为微生物检定法，但是该法步骤繁琐，实验周期过长。目前欧共体都采用了高效液相色谱(HPLC)法。HPLC法检测可靠，但是通过液相色谱检测的过程毕竟还是较为复杂。此外，还有如双波长分光光度法，斑点金免疫渗滤法，ELISA法等方法的报道。荧光光度法因其具有灵敏度高、快速的优点已被广泛应用于该类药物的检测，但是荧光法在分析含有多种荧光物质的组分时，特别是存在波段重叠的物质时，会对目标产物造成干扰，无法得到令人满意的结果，因此，需要探索新的金霉素检测方法。
发明内容本发明提供了一种快速、灵敏的稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，利用稀土铽离子(Tb3+)与金霉素、十二烷基苯磺酸钠(SDBS)形成多元配合物，使铽离子发出的荧光大大增强，而SDBS选择性增敏该多元配合物体系发出的荧光，从而实现样品中金霉素药物的选择性测定。—种稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，包括以下步骤(1)配制Tb3+贮备液将氧化铽(Tb407)溶于盐酸中，加水定容，配制Tb3+浓度为1.0X10—3mol/L的Tb3+贮备液;(2)将0.2mL2.OmLpH=7.58.0、氨基乙酸(即甘氨酸)的质量百分浓度为2%10%的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，O.5mL2.OmL1133+贮备液，0.5mL2.OmL5.OX10—3mol/L的SDBS水溶液和含金霉素药物的待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置15min60min，得到化3+浓度为5.0X10—5mol/L2.0X10—W/L的供试液;(3)将供试液置于荧光分析仪中，设定激发波长为290nm300nm，扫描速度为300nm/min1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm15nm，测定发射波长540nm550nm处的荧光强度。配制Tb"贮备液时，盐酸的用量不必过多，只要能使化407溶解即可，具体操作可包括将氧化铽溶于盐酸中，加热蒸发至近干，加水溶解并定容。pH的影响氨基乙酸-NaOH缓冲溶液的pH<7.5时，随pH的增大，测试体系的荧光强度增强，当pH=7.58.0时，测试体系的荧光强度达到最大并保持稳定，当pH>8.0时随pH的增大荧光强度逐渐变弱。因此，选用pH=7.58.0的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，调节测试体系的pH值。由于常规的缓冲溶液如磷酸缓冲溶液、硼砂缓冲溶液、Tris缓冲溶液等有熄灭荧光的作用，本发明选用氨基乙酸-NaOH缓冲溶液来调节供试液的pH值，使供试液pH值趋于稳定，且不会影响测试结果。所述的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液的配制将氨基乙酸溶于水中，用NaOH调节pH值即可。供试液中Tb3+浓度的影响供试液中Tb3+浓度低于1.OX10-W/L时，测试体系的荧光强度随着Tb"浓度增加而显著增强，当Tb"浓度达到1.0X10—iol/L时，体系荧光强度达到最大并保持稳定，因此，本发明保证供试液中Tb"浓度为5.0X10—5mol/L2.OX10—iol/L，优选供试液中Tb3+浓度为1.OX10—4mol/L，以达到好的检测效果。放置时间的影响配制供试液时需在摇匀后放置一定时间，本发明发现放置时间>15min，荧光强度就会一直保持稳定，稳定时间至少为45min，因此，本发明将供试液放置15min60min，最优选放置20min后进行荧光强度检测，以保证在节约检测时间的同时达到好的检测效果。作为优选，所述的稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，包括以下步骤(1)配制Tb"贮备液将氧化铽溶于盐酸中，加水定容，配制Tb"浓度为1.OX10—3mol/L的Tb3+贮备液;(2)将1.OmLpH=7.7、氨基乙酸质量百分浓度为5%的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，1.OmLTb3+贮备液，1.OmL5.0X10—3mol/L的SDBS水溶液和含金霉素药物的待测样品混合，加水定容至lOmL，摇匀后在室温放置20min，得到Tb3+浓度为1.0X10—4mol/L的供试液；(3)将供试液置于荧光分析仪中，设定激发波长为296nm，扫描速度为300nm/min1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，测定发射波长545nm处的荧光强度。线性关系(即标准工作曲线)的确定取金霉素标准品溶于水配制一系列由低浓度到高浓度的CTC标准溶液，按本发明所述方法加入与供试液相同的其它试剂并在相同的荧光检测条件下分别测定荧光强度，以荧光强度为纵坐标、金霉素的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，确定金霉素的浓度为2.OX10—8mol/L2.OX10—6mol/L时，荧光强度(为了减小误差，一般采用荧光强度与空白试验的荧光强度的荧光强度差)与CTC浓度呈线性关系。按照本领域分析测试的常规操作标准，一般还需要做空白试验，即除了不加待测样品或者标准品溶液，用与待测样品或者标准品溶液同样的方法进行处理和测试的实验，将测试结果减去空白试验的结果，对待测样品或者标准品溶液的检测结果进行校正，减小系统误差和因分析中所用水、试剂中的杂质和仪器而带来的响应误差。本发明方法空白试验的操作包括另取与供试液中相同的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液、Tb"贮备液和SDBS水溶液，混合后加水定容至10ml，摇匀并放置相同时间，作为空白液，在本发明的荧光检测条件下测试空白液的荧光强度即可。具体计算时，将上述测得的待测样品的荧光强度减去空白液的荧光强度所得的荧光强度差，结合上述线性关系得出供试液中金霉素的浓度。本发明方法检测限的确定选择荧光强度接近空白的CTC标准溶液，即CTC浓度为2.0X10—8mol/L的CTC标准溶液，在本发明优选的最佳实验条件下测定荧光强度，连续测定11次，按近似检测限的计算方法(3s/x)Xc进行计算，得到其检测限为4.0X10—9mol/L(S/N=3);其中s表示由11次测得的荧光强度计算得到的标准偏差，x表示11次测得的荧光强度的平均值，c表示选定的CTC标准溶液的浓度，即为2.0X10—8mol/L。金属离子干扰试验在浓度为1.OX10—6mol/L的CTC标准品溶液中添加金属离子作为待测样品，采用本发明方法进行检测，考察多种常见金属离子对化3+-0^-5085体系荧光强度的影3向，结果如表1所示。表1金属离子对体系荧光强度的影响金属离子浓度(mol/L)AIF(%)K+5.0X10—4+4.3Na+5.0X10—4-5.9Ba2+1.5X10—4+5.2Ca2+1.0X10—5-7.5Cu2+2.5X10—5-6.8Zn2+2.5X10—6-7.8Mg2+5.0X10—5+0.2Al3+2.5X10—5-l.9La2+1.0X10—5-8.3Gd2+5.0X10—5-6.5Ce3+5.0X10—5-6.1Dy3+2.5X10—6+1.05备注表中AIf表示荧光偏差，"+"表示增强，"-"表示减弱。由表1可见，大部分金属离子需要达到较高的浓度才会对本发明方法中的Tb3+-CTC_SDBS体系产生干扰，表明本发明方法具有较好的选择性。药物干扰试验在浓度为1.0X10—6mol/L的CTC标准品溶液中添加常与CTC配伍使用的药物作为待测样品，采用本发明方法进行检测，考察几种常与CTC配伍使用的药物对Tb3+-CTC-SDBS体系荧光强度的影响，结果如表2所下。表2其它药物对Tb3+-CTC_SDBS体系荧光强度的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>备注表中AIf表示荧光偏差，"+"表示增强，"-"表示减弱。由表2可见，常用的配伍药物对CTC的测定干扰较小；在相同浓度下，不同四环素类药物的干扰差异较大，其中四环素和强力霉素对体系荧光强度影响不大；而土霉素则有一定的干扰。本发明所用的试剂均选用分析纯，所用的水均选用纯水或蒸馏水。本发明具有以下有益效果1.通过加入SDBS，使体系的荧光强度提高了3倍，提高了检测的灵敏度，检测限达4.0X10—9mol/L。2.本发明方法简单、快速、准确，具有高的灵敏度与好的选择性，应用范围广泛，是CTC药物测定的理想方法。3.本发明采用稀土配合物荧光探针可实现对金霉素药物的选择性测定，且金属离子和其他常与CTC配伍使用的药物的干扰较小。图l为本发明检测的荧光光谱示意图；其中，l表示Glycine-Tb3+;2表示Glycine-CTC;3表示Glycine-Tb3+-SDBS;4表示Glycine-CTC-Tb3+;5表示GlyCine-CTC-Tb3+-SDBS，即实施例1检测的荧光光谱示意图；实验条件为CTb3+=1.OX10—4mol/L，CCTC=1.OX10—6mol/L，CSDBS=5.0X10—4mol/L，CGlycine=0.5%(质量百分浓度)；C表示浓度，Glycine是甘氨酸；图2为本发明实施例1中的标准工作曲线。具体实施方式实施例1按最佳测试条件将l.OmLpH=7.7、氨基乙酸质量百分浓度为5%的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，1.OmL1.0x10—3mol/L的Tb3+贮备液，1.0mL5.0x10—3mol/L的SDBS水溶液和待测样品混合，加水定容至lOmL，摇匀后在室温放置20min，得到供试液。将供试液置于荧光分析仪的lcm石英比色池中，设定激发波长为296nm，扫描速度为300nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，测定发射波长545nm处的荧光强度。另取与供试液中相同的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液、Tb3+贮备液和SDBS水溶液，混合后加水定容至lOml，摇匀并放置相同时间，作为空白液，在上述荧光检测条件下测试空白液的荧光强度。根据标准工作曲线的绘制方法，取CTC标准品溶于水配制一系列由低浓度到高浓度的CTC标准溶液2.0x10—8mol/L，5.0x10—8mol/L，1.0x10—7mol/L，2.0x10—7mol/L，5.0x10—7mol/L，1.0x10—6mol/L，1.5X10—6mol/L，2.0x10—6mol/L的CTC标准溶液，分别将上述CTC标准溶液替换待测样品按上述最佳测试条件和荧光检测条件下测定各CTC标准溶液的荧光强度，以各CTC标准溶液的荧光强度减去空白液的荧光强度的荧光差(AF)为纵坐标、CTC的浓度为横坐标绘制标准工作曲线，如图2。取l.OmL盐酸金霉素眼膏(南京白敬宇制药有限责任公司)作为待测样品，按上述最佳测试条件的处理方法操作，并在上述荧光检测条件下测定体系的荧光强度，将该荧光强度减去空白液的荧光强度得到荧光差，通过图2的标准曲线得出l.OmL盐酸金霉素眼膏中CTC的浓度，进一步计算CTC的含量(以质量百分比计)；测定结果见表3。表37平均值，x±s标示值(％。)RSD(%)5.10，5.06，5.01，4.99，5.165.06±0.07151.41实施例2回收试验在头孢拉定和头孢氨苄药物浓度均为5.OX10—7mol/L的水溶液中采用标准加入法进行了CTC的回收试验，每个浓度设定五个平行样品，测定结果如表4所示。表4药物(5.0xl(T7mol/L)力口入量(l(T7mol/L)测定值(10-7mol/L)平均值x±s回收率(%)头孢拉定1.00.93,0.94,1.03,0.95,0.990.97±0.04297.05.05.17,4.89,4.99,4.68.5.014.95±0.1899.0头孢氨千1.01.04，1.23,1.14,1.06,1.09Ul±0.076111.45.04.95,4.92,4.95,5.25,4.995.01±0.14100.2从表4的加标回收率来看，回收率都在97.0%111.4%之间，回收率良好，表明该检测方法抗干扰力较好，方法可靠，准确度高。权利要求一种稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，包括以下步骤(1)配制Tb3+贮备液将氧化铽溶于盐酸中，加水定容，配制Tb3+浓度为1.0×10-3mol/L的Tb3+贮备液；(2)将0.2mL～2.0mLpH＝7.5～8.0、氨基乙酸质量百分浓度为2％～10％的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，0.5mL～2.0mLTb3+贮备液，0.5mL～2.0mL5.0×10-3mol/L的十二烷基苯磺酸钠水溶液和含金霉素药物的待测样品混合，加水定容至10mL，摇匀后在室温放置15min～60min，得到Tb3+浓度为5×10-5mol/L～2×10-4mol/L的供试液；(3)将供试液置于荧光分析仪中，设定激发波长为290nm～300nm，扫描速度为300nm/min～1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5nm～15nm，测定发射波长540nm～550nm处的荧光强度。2.如权利要求l所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的放置时间为20min。3.如权利要求l所述的测定方法，其特征在于，步骤(2)中，供试液中Tb"浓度为1X10—W/L。4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，包括以下步骤(1)配制Tb"贮备液将氧化铽溶于盐酸中，加水定容，配制Tb"浓度为1.0X10—3mol/L的Tb"贮备液；(2)将1.0mLpH=7.7、氨基乙酸重量百分浓度为5X的氨基乙酸-NaOH缓冲溶液，l.OmLTb"贮备液，1.0mL5.0X10—3mol/L的十二烷基苯磺酸钠水溶液和含金霉素药物的待测样品混合，加水定容至lOmL，摇匀后在室温放置20min，得到Tb"浓度为1.OX10—4mol/L的供试液；(3)将供试液置于荧光分析仪中，设定激发波长为296nm，扫描速度为300nm/min1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为10nm，测定发射波长545nm处的荧光强度。全文摘要本发明公开了一种稀土配合物荧光探针对金霉素药物的测定方法，包括将氨基乙酸-NaOH缓冲溶液、Tb3+贮备液、十二烷基苯磺酸钠水溶液和含金霉素类药物的待测样品混合，加水定容，摇匀并放置15～60min，作为供试液；在激发波长为290～300nm，扫描速度为300～1000nm/min，激发狭缝宽度和发射狭缝宽度均为5～15nm的荧光分析仪中，测定供试液发射波长540～550nm处的荧光强度。该方法通过加入十二烷基苯磺酸钠，使体系的荧光强度提高了3倍，提高了检测的灵敏度，且操作简单、快速、准确，具有高的灵敏度与好的选择性，应用范围广泛，是金霉素类药物测定的理想方法。文档编号G01N21/64GK101713736SQ200910157118公开日2010年5月26日申请日期2009年12月22日优先权日2009年12月22日发明者瞿姗姗,童裳伦申请人:浙江大学