专利名称：白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程，具体涉及一种可在细胞内稳定且高效表达的白细胞介素6 (interleukin-6, IL-6)基因重组逆转录病毒载体的构建方法。
背景技术：
白细胞介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子。由于最初是由 白细胞产生又在白细胞间发挥作用，所以由此得名。白细胞介素interleukin缩写为IL。 白细胞介素6 (以下缩写为IL-6)可由多种细胞合成，包括活化的T淋巴细胞和B淋巴细 胞、单核细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、上皮细胞以及成纤维细胞等。人类IL-6基因位于 第7号染色体上；IL-6分子量在21 30kd之间，其差异是由于肽链的糖基化和磷酸程度 不同所致。IL-6是以单体形式存在，主要功能为刺激细胞成长、促进细胞分化，对维持机体 生理平衡具有重要作用。IL-6作用的靶细胞很多，包括巨噬细胞、肝细胞、静止的T淋巴细胞、活化的B淋巴 细胞和浆细胞等；其生物效应是
①促进T淋巴细胞表面IL-2R的表达，增强IL-I(即白细胞介素1)和TNF (肿瘤坏 死因子)对T辅助细胞的有丝分裂作用；
②作为肝细胞刺激因子，在感染或外伤引起的急性炎症反应中，诱导急性期反应蛋白 的合成，其中以淀粉状蛋白a和C-反应蛋白增加尤为明显；
③促进B淋巴细胞增殖、分化并产生抗体；多发性骨髓瘤的恶变B淋巴细胞既能产生 IL-6，又能对IL-6发生应答，提示IL-6可能作为这些细胞的自分泌性生长因子；
④IL-6还能有效地促进TNF和IL-I诱导的恶病质；促进糖皮质激素合成；刺激破骨 细胞活性和角质细胞生长；还能促进骨髓造血的功能。IL-6不能刺激相应细胞分泌其它细胞因子，在生理浓度下对免疫细胞的自分泌作 用亦比较弱，其主要免疫学功能是加强其它细胞因子的效果。逆转录病毒是RNA病毒，它有三个结构蛋白基因gag_编码病毒衣壳、基质等结构 蛋白的基因；Pol-编码逆转录酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶；env-编码gpl20和gp41 两种包膜糖蛋白。在逆转录酶的作用下可使RNA转录为cDNA，整合到宿主细胞基因组中，并 随着宿主细胞中的DNA复制、转录和翻译等蛋白酶作用下扩增。近年来随着基因工程的不 断发展，已设计构建成一些缺陷型病毒，使逆转录病毒成为有用的基因载体，特别是动物基 因克隆载体。其最重要的一点是它可以有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带 的外源基因。病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基 因也不会改变。此外，逆转录病毒载体的寄主范围相当广泛，可以感染各种细胞类型，如淋 巴细胞或肝细胞、肌细胞等，其中有的还能够在人体细胞中生长；而且逆转录病毒载体的感 染效率高，所感染的细胞不会产生病变导致寄主细胞的死亡。目前市场上销售的多为纯化 的重组IL-6细胞因子，价格非常昂贵，若用于动物体内，则以每公斤微克量来计算，一只成 年大鼠体内注射IL-6平均需要花上百元，因此，有必要构建重组质粒来满足科学研究的不断需求。
发明内容
本发明的目的是提供白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，该方法 对设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行， 适合推广应用；得到的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体能够感染多种类型的细胞， 既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；而且 价格较低。本发明所述的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下
(1)白细胞介素6(IL-6)基因片段的扩增；
通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分 别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinD III和BamH I限制性内切酶酶切位点(斜 体下划线为酶切位点)，即
上游引物 5’ -ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3 ’
上游引物 5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3，
touch down PCR扩增获得IL6目的基因片段rIL6，其序列为
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(2)重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；
采用PSEB逆转录病毒载体系统，该系统具有组蛋白标签、hEFH启动子及开放读码框 (ORP) ；hEra启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白 可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤(1)中所获得的基因片段 rIL6的PCR产物及逆转录病毒载体pSEB_3H分别经HinD III和BamH I双酶切，连接转化进 入DH2a感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL-6重组的逆转录病毒质粒 pSm-IL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；
(3)重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；
针对步骤(2)所获得正确序列的逆转录病毒pSEB-IL6质粒在真核细胞中的表达应用。 利用脂质体转染系统，将步骤(2)中所获得的逆转录病毒pSEB-IL6质粒分别转染到大鼠嗜 铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平测定IL-6的表达水平。本发明的有益效果是
(1)本发明所构建的逆转录病毒PSEB-IL6质粒可作为真核表达载体，能够感染多种类 型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率闻；
(2)本发明所采用的载体_逆转录病毒是一种改造后的安全病毒，该载体不仅带有组 蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表 达；
(3)可以本发明为工具，为研究IL-6的免疫调节功能及其相关信号通路提供有用工具。(4)本发明的构建方法所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制 备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。
图1是白细胞介素6 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图。图2是pSEB-3H逆转录病毒质粒HinD III和BamH I双酶切琼脂糖凝胶电泳图。图3是pSEB-IL6重组逆转录病毒质粒PCR鉴定图。图4是pSm-IL6重组逆转录病毒质粒HinD III和BamH I双酶切鉴定图。图5是pSEB-IL6重组逆转录病毒质粒在PC12细胞中IL-6 mRNA表达水平变化图。图6是pSEB-IL6重组逆转录病毒质粒在HEK293细胞中IL_6 mRNA表达水平变化 图。图7是ELISA检测PC12细胞中IL_6分泌蛋白水平变化图。图8是ELISA检测HEK293细胞中IL-6分泌蛋白水平变化图。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明做进一步的描述。所述的白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，步骤如下 步骤(1):白细胞介素6 (IL-6)基因片段的获得。从原代培养的大鼠骨髓间充质干细胞中提取RNA，反转录成cDNA，以此为PCR扩增 模板。Primer 5. 0设计软件设计扩增IL-6基因全长的引物，并在上游5’端添加HinD III限 制性内切酶位点，下游3’端添加BamH I限制性内切酶位点；
上游引物 5’ -ATC AAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC-3 ’ 上游引物 5’ -CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC-3， 利用Pfu高保真DNA聚合酶，通过touch-down PCR方式扩增(94°C 2 min ；93°C 20s， 66 °C -56 °C 20s, 72 °C lmin，每一循环降低 1 °C，IOcycles ;93 °C 20s, 56 °C 20s, 72 °C lmin,28 cycles ；72°C 2min延伸)，获得目的基因片段，经1. 5 %琼脂糖凝胶电泳在600bp 附近有一条特异性电泳条带(参见图1)。步骤(2)重组逆转录病毒pSEB-IL6质粒的构建及鉴定。将步骤(1)中获得IL-6的PCR产物纯化，再经HinD III和BamHI (Takara公司)双 酶切(50ul 体系2· 5μ 1 HinD 111,2. 5ul BamHI,5y 1 IOXK buffer, ？ 1 μ g DNA，37°C 过 夜)，再次纯化后定向连接到同样经HinD III和BamHI酶切处理的逆转录病毒pSEB_3H质粒 (参见图2)，20ul连接体系10μ 1 Τ4 DNA连接酶(Takara公司)，8 μ 1 IL6基因PCR产物， 2μ 1双酶切pSEB-3H质粒，16°C过夜；连接产物转化到感受态大肠杆菌DH5 α中，在氨苄
5青霉素抗性平板上筛选，挑取最小阳性单克隆，含氨苄青霉素(终浓度100μ g/ml)的LB培 养基中37°C 200rpm过夜培养，质粒小抽试剂盒抽提质粒，经0. 8%琼脂糖凝胶电泳可见约 7. Okb大小的电泳条带。以此重组质粒为模板PCR扩增(引物及条件同前)出600bp左右特异 性片断(参见图3)，同时该重组质粒经HinD III和BamHI双酶切可见两条带，一条约7000bp， 另一条与上述PCR产物大小一致的条带(参见图4)，表明重组逆转录病毒载体pSEB-IL6质 粒构建成功，进一步测序结果见SEQ No. 1，与Genebank中NM_012589的OTs序列完全相 同。SEQ No. 1
atgaagtttctctccgcaagagacttccagccagttgccttcttgggactgatgttgttgacagccactgcc ttccctacttcacaagtccggagaggagacttcacagaggataccacccacaacagaccagtatataccacttcaca agtcggaggcttaattacatatgttctcagggagatcttggaaatgagaaaagagttgtgcaatggcaattctgatt gtatgaacagcgatgatgcactgtcagaaaacaatctgaaacttccagaaatacaaagaaatgatggatgcttccaa actggatataaccaggaaatttgcctattgaaaatctgctctggtcttctggagttccgtttctacctggagtttgt gaagaacaacttacaagataacaagaaagacaaagccagagtcattcagagcaatactgaaaccctagttcatatct tcaaacaagagataaaagactcatataaaatagtccttcctaccccaacttccaatgctctcctaatggagaagtta gagtcacagaaggagtggctaaggaccaagaccatccaactcatcttgaaagcacttgaagaatttctaaaggtcac tatgaggtctactcggcaaacc
步骤(3):重组逆转录病毒pSEB-IL6质粒在大鼠PC12细胞及人胚肾HEK293细胞中的表达。为了鉴定本发明的功能，我们将实施例二中获得的重组逆转录病毒PSEB-IL6质 粒分别转染到两种不同来源的真核细胞-大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293 中，观察IL-6的表达状态。在此过程中，为了排除逆转录病毒载体自身对IL-6表达的影 响，我们以转染不含有目的基因的空载体作为IL-6过表达对照，并同时转染来自于两个不 同克隆的重组逆转录病毒PSEB-IL6质粒作为IL-6过表达实验组。当PC12细胞或HEK293细胞达到60%融合时，通过lipofectamine2000试剂盒 (Invitrogen公司)将实施例二获得的序列完全正确的重组逆转录病毒载体pSEB-IL6质粒 4 μ g或不含有目的基因片段的空载体分别转染细胞，转染48小时后，收集细胞培养上清和 转染细胞。提取转染细胞的RNA，逆转录为cDNA，并用特异性扩增IL_6片段(158bp)的引物 (上游 5，ACAGCCACTGCCTTCCCTAC3，，
下游5’ TTGCCATTGCACAACTCTTTTC3’ )进行实时荧光定量PCR扩增，结果显示，重组逆 转录病毒载体PSEB-IL6质粒的转染显著提高PC12和HEK293细胞中IL6 mRNA的表达水平 (参见图5和图6)，与对照组相比，IL-6 mRNA表达水平增高1000-4000多倍。将收集的转染细胞培养上清按照IL-6 ELISA试剂盒(R&D公司)中的操作流程进 行IL-6分泌蛋白的检测，检测结果表明转染重组逆转录病毒载体PSEB-IL6质粒的细胞中 IL-6的分泌显著高于对照组10-20倍(参见图7和图8)。上述结果提示，本发明成功构建了重组逆转录病毒载体PSEB-IL6质粒，并可在大 鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293等真核细胞中表达和分泌。
权利要求
白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下(1)白细胞介素6(IL 6)基因片段的扩增；通过逆转录 聚合酶链反应(RT PCR)方法，以大鼠骨髓间充质干细胞cDNA为模板，分别在上游引物的5’端和下游引物3’端设计HinDⅢ和BamHⅠ限制性内切酶酶切位点(斜体下划线为酶切位点)，即 上游引物5’ ATCAAGCTT ACCACCATGGGC ATGAAGTTTCTCTCCGC 3’上游引物5’ CGT GGATCC GGTTTGCCGAGTAGACCTCATAGTGAC 3’touch down PCR扩增获得IL 6目的基因片段rIL6；(2)重组pSEB rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；采用pSEB逆转录病毒载体系统, 该系统具有组蛋白标签、hEFH启动子及开放读码框(ORP)；hEFH启动子可有效启动插入ORP中靶基因的高效表达，同时3组6个连续组蛋白可以作为检测标签，反映ORP中插入靶基因的表达水平；将步骤(1)中所获得的基因片段rIL6的PCR产物及逆转录病毒载体pSEB 3H分别经HinDⅢ和BamHⅠ双酶切，连接转化进入DH2a感受态菌中，通过氨苄青霉素筛选单克隆，获得具有IL 6重组的逆转录病毒质粒pSEB IL6，并进行PCR、双酶切及序列鉴定；(3)重组pSEB rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定；针对步骤(2)所获得正确序列的逆转录病毒pSEB IL6质粒在真核细胞中的表达应用,利用脂质体转染系统，将步骤(2)中所获得的逆转录病毒pSEB IL6质粒分别转染到大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞和人胚肾细胞HEK293中，mRNA水平和蛋白水平测定IL 6的表达水平。
全文摘要
本发明公开一种白细胞介素6基因重组逆转录病毒载体的构建方法，其步骤如下(1)白细胞介素6(IL-6)基因片段的扩增；(2)重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒的构建和鉴定；(3)重组pSEB-rIL6逆转录病毒质粒在真核细胞中表达功能的测定。本发明所构建的逆转录病毒pSEB-IL6质粒可作为真核表达载体，能够感染多种类型的细胞，既可以应用于体外培养的细胞，也可以用于整体实验动物，应用范围广，感染效率高；所采用的载体-逆转录病毒是改造后的一种安全的病毒，该载体不仅带有组蛋白标签，实时检测表达水平；而且可以整合入宿主细胞中，随着细胞的不断分裂而持续表达；构建过程中所需设备要求不高，逆转录病毒载体的理化性质稳定，在制备、储存和应用过程中简单易行，适合推广应用。
文档编号G01N33/53GK101948863SQ20101028942
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月24日 优先权日2010年9月24日
发明者孙五庆, 张贇, 李廷玉, 毕杨, 陈洁, 魏小平, 龚敏 申请人:重庆医科大学附属儿童医院