专利名称：一种检测bank1基因单核苷酸多态性的方法
技术领域：
本发明属于基因工程和基因诊断领域，涉及BANK 1基因rsl0516487和 rsl7266594位点单核苷酸多态性(SNP)的检测及用途。
背景技术：
系统性红斑狼疮(SLE)是一种多系统受累的自身免疫性疾病，患者体内存在多种自身抗体。该病多发于女性，对人体的皮肤、肺部、血管和神经系统都可造成伤害。资料显示，若有SLE家族史，则SLE的发病率为一般人的数十倍。SLE也与人种、民族有关。如美国黑人女性的发病率远低于欧美一般人群，而在中国，SLE的发病率却比欧美国家高。可见这种疾病与遗传以及环境有关。目前认为可能由遗传、激素与环境等因素综合作用引起机体免疫调节功能紊乱、抗原抗体和补体复合物沉积导致局部或全身组织或器官损害。SLE患者常伴有显著的T、B淋巴细胞异常活化。B淋巴细胞作为经典的免疫效应细胞在SLE自身免疫过程中发挥了重要的作用。B细胞支架蛋白上的锚蛋白重复序列1，简称BANK 1 (B-cell scaffold protein with ankyrin repeats 1)。支架蛋白是一种在调节信号传导中起着重要作用的蛋白质，它通过辅助蛋白激酶和磷酸酶与他们各自的底物结合而起作用。锚蛋白重复序列(ANK)是生物体中广泛利用的一种序列模体。ANK结构域介导蛋白质与蛋白质的相互作用，它能够和多种配体结合，从而实现纷繁复杂的生物功能。BANK 1基因编码的B细胞特异性支架蛋白， 在B细胞受体诱导胞内钙离子动员中起着重要作用。同时也可促进Lyn (—种主要在造血细胞中表达的膜结合蛋白酪氨酸激酶)介导的1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3R)发生酪氨酸磷酸化。IP3R是一种化学门控的钙释放通道。钙离子通过IP3R通道从内质网释放入胞浆。 IP3R被激活后可导致内质网或肌质网中Ca2+释放和胞质中Ca2+浓度升高。随后通过NFAT 等多条信号途径使B细胞抗原受体信号通路活化，导致B细胞免疫耐受的丧失，引起B细胞反应性异常增高。2008年Kozyrev等[1]首次发表了关于BANK 1与SLE易感性的报道。他们的研究发现，BANK 1是SLE的易感基因，而且BANK 1上的两个SNP位点，rsl0516487和rsl7^6594 与SLE的发病关系密切。Chang等[2]对中国香港地区人群的调查也证实了这一发现。rsl0516487位于连结IP3R的关键区域[1]，是一个非同义替代的SNP位点。同义替代仅改变密码子但不改变所翻译蛋白质的氨基酸序列，一般认为它不影响蛋白质结构和功能。而非同义替代的密码子变异可导致所编码氨基酸的改变，从而影响蛋白质的生理功能。这种变异常常是导致生物性状改变的直接原因。rsl0516487的第61位氨基酸就是由精氨酸变为组氨酸。研究发现[1]，BANKl存在一长一短两种亚型。短的亚型名为Δ 2亚型，意指BANKl 基因2号外显子全部缺失，导致其翻译生成的蛋白质缺少了 IP3R结合区域。rsl7266594 恰好位于该序列分支点上(图1)，其T等位基因的纯合子具有非常典型的分支点顺序 (YNYTGAYYN) (Y 嘧啶，N表示任何核苷酸)。分支点顺序是位于核mRNA内含子和II类内含子3’端附近的保守序列。内含子的序列分支点、内含子的5’-端剪接点(供位)以及3’-端剪接点(受位)是mRNA前体正确剪接所必需的。因此，rsl7266594的多态性直接关系到BANK 1基因Δ 2亚型的剪接效率。rsl0516487和rsl7^6594的多态性可能会影响到BANK 1基因的功能，从而通过一系列反应促使B细胞受体持续释放信号，导致B细胞过度活化。目前，筛查已知SNP常用检测方法有限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异寡核苷酸片段分析(AS0)、变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、 Taqman探针法、基因芯片、测序等多种技术。但各有缺点，如RFLP仅能检测有酶切位点的 SNP，无酶切位点不能检测；RFLP、SSCP, ASO、DGGE都要用到电泳方法，灵敏度有限，对环境有污染；Taqman探针法价格昂贵；基因芯片不适宜多样本、少数SNP位点的检测；测序虽然是核苷酸检测的金标准，但成本较高，周期长，不适合大样本的疾病关联分析。采用高分辨率熔解法(High-resolution melting，HRM)检测SNP是近年来新推出的一种方法。它根据熔解温度(Tm)判断产物的性质。熔解温度由PCR产物的GC含量、长度、序列和杂合情况决定。结合了新型的饱和染料(如SYTO 9)和具有高分辨率的PCR仪(如 Rotor-Gene 6000)，即使只有一个碱基的改变，也可以从熔解温度上体现出来[3]。只需一种染料就可以满足任何目的基因的检测。但是如果在一个样本中同时存在多个突变，仅靠以上方法是不能判断的。或者当DNA样本纯度不高，PCR扩增出现引物二聚体时，会改变HRM 检测到的熔解温度，从而影响结果的判断。因此，Taqman探针法虽然价格较贵，且受到每个荧光探针仅能针对一个检测靶位等多种限制，却依然广泛被临床采用tt]。对于大规模样本的检测，为了降低成本，迫切需要一种同时结合了探针的特异性和染料的普遍性的分析方法° 未标记探针高分辨率熔角军法(unlabeled probe high resolution melting, unlabeled probe HRM)完全符合了这些要求。未标记探针法在PCR的基础上作了进一步改进3’端封闭的未标记探针、染料以及一对浓度不一致的引物。STOR Green I作为一种经典的染料在PCR中已经沿用了十几年。不过由于这是一种不饱和染料，不能完全填满DNA双链的小沟，在DNA解链的过程中游离下来的STOR Green I会重新结合到未解链的双链中，造成结果失真。过量的STOR Green I还会抑制PCR扩增。在未标记探针法中，适合PCR扩增的STOR Green I浓度仅能检测到熔解温度较高的产物，无法判断异源双链的存在[5]。参考文献
1.Kozyrev SV, Abelson AK, Wojcik J, et al. Functional variants in the B-cell gene BANKl are associated with systemic lupus erythematosus. Nat genet, 2008, 40: 211-216.
2.Chang YK, Yang W, Zhao M, et al. Association of BANKl and TNFSF4 with systemic lupus erythematosus in Hong Kong Chinese. Genes Immun, 2009, 10: 414-420.
3.Reed GH, Kent JO, Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics, 2007, 8: 597-608.
4.Erali M, Palais R, Wittwer C. SNP genotyping by unlabeled probe melting Analysis. Methods Mol Biol, 2008, 429:199-206.5. Zhou L, Myers AN, Vandersteen JG, et al. Closed-tube genotyping with unlabeled oligonucleotide probes and a saturating DNA dye. Clin Chem, 2004, 50, 1328-1335.
发明内容
本发明的目的是提供一种简易的检测BANKl基因多态性的方法。该方法具有快速、简单、无污染的特点，可检测各类标本，包括血清(浆)和各种体液。本发明的另一个目的是提供一种简易的检测BANKl基因多态性的试剂盒。
未标记探针HRM中，不对称PCR反应里的未标记探针由于3 ’端已经封闭，不会在聚合酶的作用下扩增。依靠上、下游引物可以扩增出大量的相互配对的目的片断，当一条引物耗尽后，另一条过量引物会继续扩增DNA单链，游离的探针与这些单链结合。探针与不对称PCR 扩增出的单链产物结合，饱和染料结合到探针/产物以及产物/产物结合形成的双链中。饱和染料(如SYTO 9，LC Green)具有更强的DNA结合能力和很低的抑制作用，完全适用于对单个碱基改变的检测。产物若是含有不同的等位基因，则其与探针形成的双链的熔解温度会显示出明显的差异。产物之间的相互配对同样如此。通过高分辨率仪器自带的软件分析后，可以清晰地显示出不同基因型。在荧光的负导数图(-dF/ dT)中，每个样本至少会出现2个熔解峰，一个是熔解温度较低的探针/产物的熔解峰，另一个则是熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。若扩增片段内还含有其他未知碱基突变，则除上述2个外，还会出现第3个熔解峰。在熔解温度较低的探针/产物的熔解峰中，若由模板DNA扩增出的单链产物与探针完全匹配，由于需要较高的能量才能使双链解链，熔解温度会较高；若待测模板DNA中的 SNP位点与探针不完全匹配，只需较低的能量即可打开双链结构，因此熔解温度较低；若模板DNA为杂合子，则其熔解曲线会同时具有上述2种熔解峰的特征。在熔解温度较高的产物/产物的熔解峰中，当扩增片段内除待测位点外无其他碱基改变时，产物/产物的熔解峰与探针/产物的熔解峰结果一致；当扩增片段内还含有其他位点的碱基改变时，则产物/产物的熔解峰形态会改变，提示存在其他碱基改变。由于不同碱基间产物/产物熔解峰的差异一般<0. 5°C，因此通过软件将数据转换成普通视图进行局部放大后更易观察这类碱基改变。在DNA的双螺旋结构中，G-C碱基对有3对氢键，A-T碱基对有2对氢键，因此破坏G-C间氢键需比A-T氢键付出更多的能量，故CC/GG基因型的熔解温度比TT/AA基因型高，而杂合子由于结合不牢固，熔解温度更低。通过结合荧光导数图和普通视图的结果，可以准确的判断出BANKl基因多态性位点的基因型。
本发明提供了一种检测BANK 1基因单核苷酸多态性的方法，该方法依次包括设计扩增单核苷酸多态性位点序列的引物和探针；以样本DNA为模板，利用上述引物和探针进行 PCR扩增；加入饱和染料；分析熔解度曲线，确定单核苷酸多态性。探针按照单核苷酸多态性位点序列设计。引物按照PCR原理设计，通过后续PCR结果确定。
进行PCR扩增的引物中的上游引物和下游引物浓度不同，一种不小于另一种的浓度的5倍。例如，下游引物浓度是上游引物10倍，15倍，20倍，25倍，30倍，等。所述的样本是血液成分或者体液。所述的饱和染料是SYTO 9或者LC Green (市售，例如hvitrogen公司，美国)。探针浓度不小于两种引物的浓度差。探针浓度也可以略小于上游和下游引物的浓度差，或者探针浓度等同于浓度高的那个引物。在本发明的一个实施例中，所述的单核苷酸多态性的位点是rsl0516487。所述的引物序列如SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO 3所示。在本发明的另一个实施例中，所述的单核苷酸多态性的位点是rsl7^6594。所述的引物序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示，所述的探针序列如SEQ ID NO 6所示。具体而言，本方法从样本中抽提DNA后，采用添加了未标记探针的不对称聚合酶链式反应(PCR)扩增出需要的DNA片断，加入饱和荧光染料，随着温度的下降检测其荧光变化。每个样本有2个熔解峰，温度较低的熔解峰用于判断探针覆盖范围内的碱基变化，温度较高的熔解峰用于判断整个目的片断内碱基变化。1.从血浆中抽提DNA。2.设计引物。3.设计针对待测位点的探针，不标记荧光，3’端用C3封闭。4.加入荧光染料，如SYTO 9进行不对称PCR扩增。结束后，在高分辨率PCR仪上检测熔解温度，分析温度下降时样本荧光信号的变化。5.分析待测样本BANKl基因rsl0516487和rsl7266594多态性。相应的，本发明提供了一种检测BANK 1基因单核苷酸多态性的试剂盒，该试剂盒包括扩增单核苷酸多态性位点序列的引物和探针。还可以包括饱和染料，缓冲液等。发明的检测BANK 1基因单核苷酸多态性方法，可以用于预测患系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎或者系统性硬皮病的易感性。BANKl基因rsl0516487和rsl7^6594两个位点均为SLE的易感位点，携带CT单倍型的人群患SLE的概率为正常人的1. 6倍，可用于评估个体患上该疾病的风险性。BANKl的Δ 2亚型，意指BANKl基因2号外显子全部缺失，其翻译获得的蛋白缺失 IP3R结合区。rsl7^6594恰好位于BANKl该序列分支点上。因此，rsl7266594的多态性直接关系到BANK 1基因的剪接效率和翻译获得蛋白的功能。rsl0516487位于连结IP3R的关键区域，是一个非同义替代的SNP位点。rsl0516487和rsl7^6594的多态性会影响到 BANK 1基因的功能，从而通过一系列反应促使B细胞受体持续释放信号，导致B细胞过度活化。
本发明提供了一种检测BANK 1基因单核苷酸多态性的方法，可采用该方法检测外周血或体液中BANKl基因rsl0516487和rsl7^6594多态性。以判断罹患系统性红斑狼疮、 类风湿性关节炎、系统性硬皮病等自身免疫性疾病的可能性。该方法操作具有快速、简单、 无污染的特点，检测结果分辨率高，可检测各类标本，包括血清(浆)和各种体液。本发明还提供了相应的检测试剂盒。
图1 :rsl0516487和rsl7266594位点示意图。rsl0516487是一个非同义替代的 SNP位点，导致第61位氨基酸由精氨酸变为组氨酸；rsl7^6594位于序列分支点上，具有典型的分支点顺序。图2 :rsl0516487位点的荧光负导数图(_dF/ dT)。左侧为熔解温度较低的探针/ 产物的熔解峰，右侧为熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。红线代表CC基因型，蓝线代表CT基因型，黄线代表TT基因型。图3 :rsl0516487位点产物/产物熔解曲线的普通视图。红线代表CC基因型，蓝线代表CT基因型，黄线代表TT基因型。图4 :rsl7^6594位点的荧光负导数图(-dF/ dT)。左侧为熔解温度较低的探针/ 产物的熔解峰，右侧为熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。红线代表TT基因型，蓝线代表TC基因型，黄线代表CC基因型。图5 :rsl7266594位点产物/产物熔解曲线的普通视图。红线代表TT基因型，蓝线代表TC基因型，黄线代表CC基因型。
具体实施例方式实施例1 :rsl0516487位点多态性检测 1. DNA提取
使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血anl，使用QIAamp DNA Extract Kit (德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA。2.引物设计
使用Primer 3软件(http //frodo. wi. mit. edu/)设计引物，经过人工筛选和PCR实验验证，获得引物。rsl0516487 的上游引物 F :5，_ ACATTTGTAAGACGTTAAGTTCAGCA-3，(SEQ ID NO 1)，下游引物R: 5‘-ATGATATATGAAGMGATGCTGAGGA-3‘ (SEQ ID NO 2)，扩增片段长度150 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3.探针设计
使用 Primer Premier 5. 0 软件设计探针，rsl0516487 的探针为 5，-GAAAAGAGAAATTCT CCAAGCGATATAACAGGATG-3’ (SEQ ID NO 3)，探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，3’端作C3封闭，防止探针延伸。4.样本检测
使用TaKaRa PCR试剂盒(宝生物，日本)进行PCR扩增。反应体系包括0. 1 p. 1 TaKaRa Taq HS(5 U/ μ 1),2 1 10 X PCR Buffer (-) (Mg2+ Free) ,1.2 , 1 MgCl2 (25 mM), 1.6 n 1 dNTP Mixture (各 2· 5 mM)，上游引物 F 1 n 1 (1 n M)，下游引物 Rlnl (10 μ Μ)，探针1 H 1 (10 Μ),加水至总体积19 3 μ 1然后加入0. 7 1样本DNA。PCR扩增条件95°C 2 min,94°C 30 s、58°C 30 s、72°C 30 s，50 个循环后，72°C 5 min 延伸。使用Eppendorf personal基因扩增仪(Eppendorf公司，德国)扩增后加入0. n 1 SYTO 9 染料(50 , M) anvitrogen公司，美国)，再将样品管转移到Rotor-Gene 6000 (Mortlake Corbett Research公司，澳大利亚)，进行高分辨率熔解分析。条件为95° C 2 min, 25° C 2 min预处理后，熔解温度从55° C升至88° C，每升高0.2° C采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。5.多态性分析
在荧光的负导数图(-dF/ dT)中，位于左侧的是熔解温度较低的探针/产物的熔解峰。 若模板DNA的rsl0516487位点碱基为胞嘧啶(C)，则扩增出的单链产物与探针完全匹配， 熔解温度较高，熔解峰偏右；若模板DNA的该位点碱基为胸腺嘧啶(T)，则单链无法与探针完全匹配，熔解温度较低，熔解峰偏左；若模板DNA为杂合子，该位点碱基部分为C，部分为 T，则其熔解曲线会同时具有上述2种熔解峰的特征(图2)。位于右侧的是熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。通过软件将数据转换成普通视图，将产物/产物的熔解曲线局部放大后观察碱基改变。rsl0516487位点的CC基因型 Tm最高，位于右侧，TT基因型其次，而CT基因型由于结合不牢固，Tm最低(图3)。通过结合荧光导数图和普通视图的结果，可以准确判断出BANKl基因rsl0516487 位点的基因型。
实施例2 rsl7266594位点多态性检测 1. DNA提取
使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝的真空采血管采集静脉血anl，使用QIAamp DNA Extract Kit (德国Qiagen公司)试剂盒提取DNA。2.引物设计
使用Primer 3软件(http //frodo. wi. mit. edu/)设计引物，经过人工筛选和PCR实验验证，获得引物。rsl7266594 的上游引物 F :5，-AGGACTTTCATAGAGTTTTTCTCTGG-3，(SEQ ID NO 4)，下游引物R :5，_ CATTCCTCAGCATCTTCTTCA-3，(SEQ ID NO 5)，扩增片段长度 185 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。3.探针设计
使用 Primer Premier 5. 0 软件设计探针，rsl7266594 的探针为 5’ -TAATAATTTAACCTG CTGATAGCATTGCAAATAT-3 (SEQ ID NO 6)。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，3’端作C3封闭，防止探针延伸。4.样本检测
使用TaKaRa PCR试剂盒(宝生物，日本)进行PCR扩增。反应体系包括0. 1 n 1 TaKaRa Taq HS (5 U/ μ 1),2 n 1 10 X PCR Buffer (-) (Mg2+ Free) ,1.2 1 MgCl2 (25 mM), l.bul dNTP Mixture (各 2· 5 mM)，上游引物 F 1 1 (0.6/ n M)，下游引物 R 1 n 1 (10 泳 M)，探针1.5 p. 1 (10 nM)，加水至总体积19.3 1，然后加入0 ι n丄样本DNA。PCR扩增条件95°C 2 min,94"C 30 s、58°C 30 s、72°C 30 s，50 个循环后，72°C 5 min 延伸。使用Eppendorf personal基因扩增仪(Eppendorf公司，德国)扩增后加入0. 1 SYTO 9 染料(50 μ. Μ) anvitrogen 公司，美国)，再将样品管转移到 Rotor-Gene 6000 (Mortlake Corbett Research公司，澳大利亚)，进行高分辨率熔解分析。条件为95° C 2 min, 40° C 2 min预处理后，熔解温度从57° C升至83° C，每升高0.2° C采集一次数据，获得高分辨率熔解曲线图。5.多态性分析
在荧光的负导数图(-dF/ dT)中，位于左侧的是熔解温度较低的探针/产物的熔解峰。若模板DNA的rsl7^6594位点碱基为胸腺嘧啶(T)，则扩增出的单链产物与探针完全匹配，熔解温度较高，熔解峰偏右；若模板DNA的该位点碱基为胞嘧啶(C)，则单链无法与探针完全匹配，熔解温度较低，熔解峰偏左；若模板DNA为杂合子，该位点碱基部分为T，部分为C，则其熔解曲线会同时具有上述2种熔解峰的特征(图4)。位于右侧的是熔解温度较高的产物/产物的熔解峰。通过软件将数据转换成普通视图，将产物/产物的熔解曲线局部放大后观察碱基改变。rsl7^56594位点的CC基因型 Tm最高，位于右侧，TT基因型其次，而TC基因型由于结合不牢固，Tm最低(图5)。通过结合荧光导数图和普通视图的结果，可以准确判断出BANKl基因rsl7^6594 位点的基因型。
权利要求
1.一种检测BANK 1基因单核苷酸多态性的方法，其特征在于，该方法依次包括 设计扩增单核苷酸多态性位点序列的引物和探针；所述的单核苷酸多态性位点是rsl0516487 或者 rsl7266594 ；以样本DNA为模板，利用上述引物和探针进行PCR扩增；引物中的上游引物和下游引物浓度不同，一种不小于另一种的浓度的5倍； 加入饱和染料；分析熔解度曲线，确定单核苷酸多态性。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的样本是血液成分或者体液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饱和染料是SYTO9或者LC Green0
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，探针浓度不小于两种引物的浓度差。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性的位点是 rsl0516487。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的引物序列如SEQID NO 1和SEQ ID NO 2所示，所述的探针序列如SEQ ID NO 3所示。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的单核苷酸多态性的位点是 rsl72665940
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的引物序列如SEQID NO 4和SEQ ID NO 5所示，所述的探针序列如SEQ ID NO 6所示。
9.一种检测BANK 1基因单核苷酸多态性的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括扩增单核苷酸多态性位点rsl0516487或者rsl7^6594序列的引物和探针。
10.权利要求1所述的方法的应用，其特征在于，利用BANK1基因单核苷酸多态性的检测结果预测患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎或者系统性硬皮病的易感性。
全文摘要
本发明属于基因工程和基因诊断领域，提供了一种检测BANK1基因单核苷酸多态性的方法首先，设计扩增rs10516487或者rs17266594位点的引物和探针；然后，以样本DNA为模板，利用上述引物和探针进行PCR扩增；引物中的上游引物和下游引物浓度不同，一种不小于另一种的浓度的5倍；最后，加入饱和染料，分析熔解度曲线，确定单核苷酸多态性。该方法可以检测外周血或体液中BANK1基因rs10516487和rs17266594的多态性，以判断罹患系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、系统性硬皮病等自身免疫性疾病的可能性。该方法快速、简单、无污染，检测结果分辨率高。本发明还提供了相应的检测试剂盒。
文档编号G01N21/64GK102465170SQ201010533518
公开日2012年5月23日 申请日期2010年11月5日 优先权日2010年11月5日
发明者关明, 吴之源, 张心菊, 邹和建, 陈宇明 申请人:复旦大学附属华山医院