专利名称：检测β-内酰胺酶的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及一种检测β -内酰胺酶的试剂盒，特别是检测牛奶中β -内酰胺 酶的试剂盒。
背景技术：
随着人们生活水平的提高，动物源食品中的药物残留日益受到国际社会的重视。 内酰胺类抗生素作为发现最早、用量最多的一类抗生素，在牛乳及动物组织中残留检出
报道最多。内酰胺类抗生素是指化学结构中含有内酰胺环的一类抗生素，主要包括 青霉素类和头孢菌素类，其作用特点是能够抑制细菌黏肽转肽酶的活性，从而阻止细菌细 胞壁的合成，呈现杀菌活性。在动物生产中，内酰胺类抗生素广泛用于控制奶牛的乳房 炎，治疗动物尿道、胃肠道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不当或不遵守休药期规定等 原因，均可造成它在畜产品中的残留，给人类健康带来严重危害，如产生过敏反应、破坏胃 肠道菌群平衡和增强细菌耐药性等。更为重要的是，抗生素被过量食入健康人肠道，会破坏 健康人的正常菌群环境，导致人体免疫力的降低，从而危害消费者的身体健康。目前市场上出现了 “生鲜牛乳抗生素分解剂”，该分解剂的主要成分是β -内酰胺 酶，在我国内酰胺酶是不允许使用的食品添加剂，严禁将内酰胺酶加入到有抗生素 的奶中用于分解抗生素。目前对内酰胺酶常用的检测方法主要有液相法及微生物法， 但是液相法虽然准确度高，但是存在操作复杂，对检测人员要求高，检测时间长，成本高等 缺点，微生物检测方法成本低，但是检测灵敏度低，容易出现假阳性，耗时长，不适合现场使 用。因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、适合大规模推广的检测方 法。
实用新型内容本实用新型的目的提供一种灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的检测 β -内酰胺酶的试剂盒。本实用新型的试剂盒包括试剂盒盒体，具有12个孔的固定用具及放置其中的12 个具塞试剂桶，试剂桶包括2个微孔试剂条、8个试纸条，微孔试剂条有8个反应孔，反应孔 上具有微孔塞，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫 和保护膜等组成，与常规试纸条不同的是，其中的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物 不在是包被在结合物释放垫上，组装入试纸条，而是冻干在微孔试剂条中。将金标抗体冻干在微孔试剂中，这样做的好处是在检测过程中，能够使金标抗体 与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。所述反应膜上分别包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和 包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹。在反应膜上检测线印迹和质控线印迹组合排列为 所述的检测线位于距离样品吸收垫一侧5-8mm，优选6mm，所述质控线位于距离检
3测线4-7mm，优选5_。所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上 的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。本实用新型试剂盒中试纸条底板可为PVC底板或其他硬质不吸水的材料；样品吸 收垫可为吸滤纸或滤油纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜； 保护膜为PE材质保护膜；试剂盒盒体为硬纸盒；试剂桶为塑料试剂桶；固定用具为硬质支 撑材料。本实用新型试剂盒具有如下有益效果1.灵敏度高。β-内酰胺酶检测试剂盒以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基 础制备而成，金标抗体中金颗粒与抗体分子之间无价健形成，二者通过异性电荷间的范德 华力相结合，胶体金对单克隆抗体特异性和亲和力影响很小，且具有较高的标记率。因此， 本实用新型试剂盒具有较高的特异性和灵敏度。本试剂盒对内酰胺酶检测灵敏度达到 1IU/L。2.操作简便快速。使用试剂盒检测时无需任何其它试剂，只要将待检样品溶液 滴加于冻干有青霉素药物的微孔试剂条，即酶测试剂中，40°C 50°C温育25min，室温回温 lOmin，将回温后的酶测试剂滴加于冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔 试剂条中，混勻，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂反应，5min后 观察结果。3.显示检测结果形象、直观准确。检测是试纸条以显示红线色“ I ”及“ I I，，印迹 作为阴性和阳性标记，即在硝酸纤维素膜上显示一条红线“ I ”印迹表示在被检测样本液中 β -内酰胺酶的含量低于1IU/L，两条红线“ I I，，印迹表示在被检测样本中β -内酰胺酶含 量高于或等于1IU/L，结果判定形象、直观、准确、简单明了，不容易出现结果误判。4.成本低，投资少。使用本实用新型试剂盒，不需另配仪器设备及其他试剂，使现 场检测一步到位，成本低廉，投资少，见效快。5.易于大范围推广应用。试剂盒操作简单，能较好满足不同层次人员的需要，如专 业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、乳业企业等，具有广阔的市场前景和较大的经济、 社会效益。
图1为本实用新型试纸条结构示意图；图2为本实用新型试纸条俯视图；图3为本实用新型微孔试剂条图；图4为本实用新型试纸条检测结果判定图；图5为本实用新型试剂桶结构示意图；图6为本实用新型固定用具的俯视图；图7为本实用新型试剂盒盒体与固定用具的俯视图。
具体实施方式
一、β -内酰胺酶检测试剂盒组装制备[0025]1)、试纸条样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品 吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始 端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸两端黏贴有保护膜，保护膜7-1覆盖在吸水 垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样品吸收垫的检测端，在检测端保护膜上印有MAX标记线， 检测线4包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体。底板为PVC底板，样品吸收垫为吸滤纸，反应膜为硝酸纤维素膜，吸水垫为吸水 纸，保护膜为PE材质保护膜。2)微孔试剂微孔试剂8具有微孔塞9，其中一条板孔中冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金 标记物，另一条板孔中冻干有青霉素药物。3)将1)试纸条和2、微孔试剂条装入塑料试剂桶10，将塑料试剂桶放置于试剂盒 盒体12内的固定用具11中。二、试剂盒的使用待检牛奶样品溶液滴加250 μ 1到冻干有青霉素药物的微孔试剂条，即酶测试剂 中，45°C温育25min，室温回温lOmin，将回温后的酶测试剂200 μ 1滴加到冻干有头孢类药 物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂中，混勻后，孵育5min，将试纸标有MAX线标记端 向下，插入孵育后的微孔试剂后计，5min内观察结果。三、检测结果分析β -内酰胺酶在样本中的含量高于或等于1IU/L时，青霉素药物被分解，不能与微 孔试剂条中的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物结合，金标抗体在检测线上与头孢类 药物-载体蛋白结合，检测线出现红色条带，金标抗体与羊抗鼠抗抗体结合，质控线呈红色 条带，当β -内酰胺酶在样本中的含量低于1IU/L时，酶测试剂中的金标抗体与青霉素药物 结合，金标抗体结合位点被封闭，从而在检测区内因为竞争反应，不会与头孢类药物-载体 蛋白偶联物结合而不出现红色条带。如图4所示。阴性当质控线(C)显示一条红色条带，而检测线(T)不显色，试纸条以显示红线 色“I ”，判为阴性，如图4. a图所示。阳性当质控线(C)显示一条红色条带，检测线(T)同时也显示出一条红色条带， 且检测线(T)颜色接近或浅于质控线(C)时，试纸条以显示红线色为“I I ”，判为阳性，如图 4. b所示。无效当质控线(C)不显示出红色条带，则无论检测线(T)显示出红色条带与否， 该试纸条判为无效，如图4. c、4. d所示。四、检测试剂盒中用到的材料制备方法入下1、头孢类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定头孢类药物是小分子物质，只有免疫反应性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免 疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。2)免疫原的制备-头孢类药物与卵清蛋白偶联物合成取头孢匹林的钠盐40mg，用1. 5ml双蒸水溶解，得到⑴液；取EDC40mg和NHS60mg 用0. 5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应lh，得到(III)液；取卵清蛋白60mg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应24h分 别得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分装、冻存。3)包被原的制备-头孢类药物与牛血清白蛋白偶联物合成取头孢匹林的钠盐40mg，用1. 5ml双蒸水溶解，得到(I)液；取EDC40mg和NHS60mg 用0. 5ml水溶解得到(II)液；在搅拌状态下将(II)加入(I)中，反应lh，得到(III)液； 取牛血清白蛋白IOOmg用8ml水溶解，得到(IV)液；将(IV)加入(III)中，室温搅拌反应 24h分别得到免疫原，用0. 02M PBS透析3天，分装、冻存。4)头孢类药物-载体偶联物的鉴定将载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物用pH7. 4的PBS配成 0. 5mg/ml的溶液，以0. 01mol/L pH7. 4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200-800nm范围 内扫描，得到载体蛋白、头孢类药物、头孢类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现 不同的吸收曲线，表明头孢类药物与载体蛋白偶联成功。2、头孢类药物单克隆抗体的制备(1)制备单抗a.动物免疫将步骤1得到的免疫原注入到Balb/c小鼠体内，免疫剂量为150 μ g/只，使其产
生抗血清。b.细胞融合和克隆化取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9 1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合， 筛选得到稳定分泌头孢类药物单克隆抗体的头孢类药物单克隆杂交瘤细胞株。c.细胞冻存和复苏将杂交瘤细胞用冻存液制成IX IO9个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏 时取出冻存管，立即放入37°C水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。d.单克隆抗体的制备与纯化增量培养法将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37°C条件下进行培养，用辛 酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20°C保存。所述细胞培养基为向RPMI-1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清 在细胞培养基中的终浓度为20% (质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度 为0. 2% (质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7. 4。3、羊抗鼠抗抗体的制备以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊 进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。4、头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备(1)胶体金的制备用双蒸去离子水将氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成 0.01% (质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入 2. 5mll%柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BGlI-AR-01KG)，继续搅拌加热反 应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无 沉淀和漂浮物。(2)头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备[0063]在磁力搅拌下，用0. 2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7. 0，按50-100 μ g抗体/ml 胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述头孢类药物单克隆抗体，继续搅拌混勻30min，加入 10% BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、 4°C离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的 复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50ug 单抗/ml溶液，置4°C备用。复溶缓冲液含酪蛋白、吐温-80的0. 02mol/L、pH7. 2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白 在复溶缓冲液中的终浓度为0. 05-0. 1% (体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终 浓度为0. 05-0. 15% (质量百分含量)。5、将头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上向微孔试剂微孔板中加入100 μ 1头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷 冻干燥机中，在冷阱温度为-70°C条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有头 孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂。6、将青霉素药物冻干到酶测试剂微孔板上向酶测试剂微孔板中加入100 μ 1青霉素药物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度 为-70°C条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有青霉素药物的酶测试剂。7、样品吸收垫的准备将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲 液中的终浓度为0. 5% (体积百分含量))、pH为7. 2、0. lmol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37°C 烘池备用；8、反应膜的制备包被过程用磷酸缓冲液将头孢类药物-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL， 用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为1. 0 μ g/cm2 ；用0. 01M、pH 7. 4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μ g/ml，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维 素膜上的质控区，包被量为1. 0μ g/cm2。将包被好的反应膜置于37°C条件下干燥池，备用。
权利要求1.一种检测β-内酰胺酶的试剂盒，其特征在于试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔 的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括8个试纸条和2个微孔试剂条，试 纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，其 中一个微孔试剂条冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物，另一个微孔试剂条冻干有青霉素药物。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述反应膜上具有包被有头孢类药物-载 体蛋白偶联物构成的检测线印迹“ I ”和包被羊抗鼠抗抗体构成的质控线印迹“ I ”。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于所述检测线和质控线平行。
4.如权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于所述的检测线位于距离样品吸收垫一 侧5-8mm，所述质控线位于距离检测线4_7mm。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试纸条两端贴有保护膜，覆盖在吸水 端上的为手柄端，覆盖在样品吸收垫上的为检测端，检测端保护膜上有MAX标记线。
6.如权利要求1所述的试剂盒，所述底板可为PVC底板，样品吸收垫可为吸滤纸或滤油 纸，反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜，吸水垫为吸水纸，保护膜为PE材质保护膜。
7.如权利要求书1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒盒体为硬纸盒，试剂桶为塑 料试剂桶，固定用具是硬纸材料。
8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于微孔试剂条有8个反应孔，反应孔上具有微 孑L塞。
专利摘要本实用新型提供了一种检测β-内酰胺酶的试剂盒，试剂盒包括试剂盒盒体、具有12个孔的固定用具及放置其中的12个具塞试剂桶，试剂桶包括8个试纸条和两个微孔试剂条，试纸条由底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜组成，其中一个微孔试剂条冻干有头孢类药物单克隆抗体-胶体金标记物，另一个微孔试剂条中冻干有青霉素药物，在反应膜具有包被有头孢类药物-载体蛋白偶联物构成的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体构成质控线。本实用新型试剂盒具有便携性好，灵敏度高，检测时间短等特点，可以在β-内酰胺酶检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/558GK201852842SQ20102057903
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月21日 优先权日2010年10月21日
发明者万宇平, 何丽霞, 何方洋, 冯才伟, 冯才茂, 冯静, 崔海峰, 李勇, 汪善良, 王建霞, 罗晓琴, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司