专利名称：肽展示阵列的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于肽的阵列，产生所述阵列的方法和相关的使用方法。
背景技术：
在以下讨论中，将出于背景和介绍的目的描述某些物品和方法。本文所含的内容不被解释为对现有技术的“承认”。申请人明确地保留在适当时证明在适用的法律规定下，本文所提及的物品和方法不构成现有技术的权利。蛋白质组学，即对蛋白的功能、结构和相互作用的研究，要求产生足够的量的蛋白并以高通量方式研究这些蛋白的能力。蛋白微阵列是用于蛋白的所述高通量分析的非常有用的工具，但由于蛋白产生的困难和成本，对于大规模蛋白质组学研究，微阵列技术的可用性仍非常有限(Henderson G 和 Bradley M, Curr Opin Biotechnol. Aug ； 18 (4) :326-30,(2007) ,Epub 2007Aug 6 ；Tapia VE Methods Mol Biol. 2009 ；570 :3-17 (2009))。传统上，肽阵列通过在表面上点印预合成的肽(Salisbury CM等人，J Am Chem Soc. 2002Dec 18;124(50) :14868-70(2002))或通过利用标准固相肽合成，也称作SPOT方法(Frank R，JImmunol Methods. 2002Sep I ；267(1) :13-26(2002))在纤维素滤板上的点(spot)中合成肽来制造。生成具有几万至几十万的肽的阵列的成本非常高，使该阵列的大规模、高通量的使用成本昂贵。最近，已开发了通过体外翻译的肽阵列制造方法，所述方法包括蛋白原位阵列(PISA)产生(He M 和 Taussig MJ, Nucleic Acids Res, 29, e73 (2001))，核酸可编程性蛋白阵列(NAPPA)产生(Ranachandran N 等人.，Science305 :86-90 (2004)), DNA 到蛋白阵列(DAPA)构建(He M Nat. Methods5 :175-177 (2008))，和利用原位嘌呤霉素捕捉而排列蛋白(Tao S-C 和 Zhu H，Nat. Biotech 24 1253-1254(2006)) 这些方法要求单独合成的核酸模板，然而，成本比通过传统方法排列的单独的肽的成本要高。制造密集的、高质量的、序列多样的肽阵列的能力将使高通量结合和酶活性概括分析研究成为可能，其将在研究、诊断和治疗开发中具有多种应用。本发明解决了该需要。发明概述以简化形式提供本概述以介绍所选择的概念，这些概念在下面在详述中进一步描述。本概述既不意在确定要求保护的主题的关键特征或基本特征，又不意在用来限制要求保护的主题的范围。要求保护的主题的其他特征、细节、用途和优点将从包括附图中所示出和所附权利要求中所限定的那些方面的以下书面详述变得明显。本发明提供阵列、构建阵列的方法和使用所述阵列的方法。本发明的阵列包括基底，所述基底具有任选地经由连接物分子在所述基底的表面上缔合(associate)的两个或多个不连续的构建体或不连续的构建体的组。构建体包括编码感兴趣的肽的寡核苷酸和感兴趣的肽本身。寡核苷酸与基底表面缔合，且肽直接地或经由连接物分子与该寡核苷酸缔 口 o在具体的方面，阵列的构建体包括编码感兴趣的肽和亲和标记物(affinity tag)的第一寡核苷酸区域、位于所述第一寡核苷酸的5’并包括非翻译区的第二寡核苷酸区域、包括感兴趣的肽和亲和标记物两者的融合肽；和与寡核苷酸缔合的与融合蛋白的亲和标记物形成结合配对的捕捉剂。寡核苷酸的非翻译区包括转录起始位点和编码感兴趣的肽和亲和标记物的区域5’的核糖体结合位点。捕捉剂可直接地或经由连接物分子与寡核苷酸缔合。在一个优选的方面，融合肽经由与直接地或间接地与寡核苷酸缔合的捕捉剂的结合在寡核苷酸远离基底表面的末端与寡核苷酸缔合。在某些另外的方面，肽经由与寡核苷酸缔合的捕捉剂或与寡核苷酸通过其与基底表面连系(attach)的连接物缔合的捕捉剂，在基底表面附近与寡核苷酸缔合。在一个优选的方面，捕捉剂经由例如利用合成连接物分子与寡核苷酸连接的引物序列在寡核苷酸上远离基底表面的位置处缔合。在某些方面，阵列基底是平面支持体、薄膜、珠子或其组合。寡核苷酸的一条链包 括用于将非翻译区导入到寡核苷酸的引物区域。非翻译区包括用于起始转录反应的核糖体起始位点和转录启动子区域。在一个具体的方面，构建体排列在流动池(flow cell)的表面上，所述流动池优选地为用于高通量测序的流动池。可任选地在流动池中原位克隆扩增序列。在该方面，序列随机排列，但每个克隆序列的身份可在蛋白产生和其在筛查测定中使用之前或之后确定。排列几百万DNA模板和确定其序列的能力可非常便宜地实现，例如，通过在寡核苷酸模板的合成过程中使限定位置处的碱基随机化，通过组合较短的寡核苷酸以形成较长的模板，或通过从基因组DNA或cDNA文库衍生序列的文库来实现。在本发明的一些方面，阵列的构建体包括与肽缔合的双链寡核苷酸。在另外的方面，在肽缔合以后可能需要移除寡核苷酸链之一，且阵列将包括与感兴趣的肽缔合的单链寡核苷酸。本发明还提供构建本发明的阵列的方法。产生本发明的肽阵列的特定的方法利用在基底表面(例如，平面基底或珠子组)上合成的核酸的组。编码氨基酸序列的已知序列的核酸优选地直接合成到表面上，例如，利用化学合成技术来合成。阵列上每个不同的位置或位点处的序列的身份可以是预定的或在固体基底上的合成或组装为固定形式(例如，在珠子的情况下)诸如微阵列之后确定。序列身份还可在构建肽阵列之后确定。在合成产生核酸之后，利用方法诸如化学方法和优选地酶促连接、引物延伸、扩增等将包括需要的序列信息(例如，编码肽阵列的元件的序列、转录或翻译所需的序列、和类似序列)的另外的核酸与基底表面上合成的核酸连系。延伸的核酸用作经由体外转录和翻译产生感兴趣的肽和其他肽元件(例如，亲和标记物)的模板。在构建肽阵列的另一个具体的方面，制造了包括一组编码氨基酸序列的化学合成的寡核苷酸的核酸微阵列。利用方法诸如化学方法和优选地酶促连接、引物延伸、扩增等将包括需要的序列信息(例如，编码肽阵列的元件的序列、转录或翻译所需的序列、和类似的序列)的另外的核酸与这些阵列的寡核苷酸连系。延伸的核酸用作经由体外转录和翻译产生感兴趣的肽和其他肽元件(例如，亲和标记物)的模板。肽产生之后，在基底表面上的已知位置处捕捉肽。优选地，利用本文更详细地描述的方法，将肽与其各自的核酸模板的位置缔合，或直接与实际的模板缔合。本发明的这些方法利用合成和合成后核酸构建的组合，在于基底表面上产生大量已知序列的肽的方面是尤其有用的。例如，利用这些方法，可在基底表面上产生至少100、至少1000、至少5000和至少10，000个可解析的肽的阵列。
可选地，将延伸的核酸序列转移(直接地或作为拷贝地)到表面并在原位扩增，在该处进行肽阵列构建的其余程序。在一些方面，阵列可利用包括含编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸模板区域的两个或多个构建体的表面来产生。在一方面，将单链寡核苷酸模板转化为双链寡核苷酸区域，并将包括转录起始位点和核糖体结合位点的非翻译区导入到双链寡核苷酸区域的5’端。在另外的优选的方面，在将单链寡核苷酸转化为双链模板之前将非翻译区添加到单链区域。然后使双链寡核苷酸区域进行体外转录和翻译事件以产生包括感兴趣的肽和亲和标记物的融合肽，并通过将融合肽的亲和标记物部分与直接地或间接地与寡核苷酸缔合的捕捉剂结合来捕捉构建体中的融合肽。捕捉剂任选地与寡核苷酸的非翻译区缔合，并经由与该非翻译范围的区域互补的区域导入到寡核苷酸。可选地，捕捉剂可经由肽编码区域或经由将寡核苷酸模板与基底表面连系的连接物与构建体缔合。在另一方面，阵列可利用表面来产生，所述表面包括含包括与编码感兴趣的肽的序列互补并与编码亲和标记物的序列互补的序列的单链寡核苷酸模板区域的两个或多个构建体。将单链寡核苷酸模板转化为双链寡核苷酸区域，并将包括转录起始位点和核糖体 结合位点的非翻译区导入到双链寡核苷酸区域的5’端。然后使双链寡核苷酸区域进行转录和翻译事件以产生包括感兴趣的肽和亲和标记物的肽，并通过将融合肽的亲和标记物与捕捉剂结合而在构建体中捕捉融合肽。捕捉剂任选地与非翻译区缔合并将该区域导入构建体。可选地，捕捉剂可经由肽编码区域或经由将寡核苷酸与基底表面连系的连接物与构建体缔合。在又一方面，本发明提供通过提供包括具有含编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸的两个或多个构建体的表面的基底来构建阵列的方法。第二通用寡核苷酸包括具有转录起始位点和核糖体结合位点的非翻译区，与构建体的寡核苷酸连系，且捕捉剂经由与通用寡核苷酸杂交而与寡核苷酸缔合。将构建体的单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域；和使双链寡核苷酸模板区域进行转录和翻译事件以产生包括感兴趣的肽和亲和标记物的融合肽。从该翻译事件中产生的融合蛋白经由肽的亲和标记物被捕捉剂捕捉。所得的阵列包括含与由核酸编码的肽缔合的核酸的不连续的单元。这些不连续的构建体单元可包括与具有不同的感兴趣的肽的其他构建体可区别的一个或多个构建体。在又一方面，本发明提供通过提供包括具有含编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸的两个或多个构建体的表面的基底来构建阵列的方法。第二通用寡核苷酸包括具有转录起始位点和核糖体结合位点的非翻译区，与构建体的寡核苷酸结合，且捕捉剂经由与通用寡核苷酸杂交而与寡核苷酸缔合。将构建体的单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域；和使双链寡核苷酸模板区域进行转录和翻译事件以产生包括感兴趣的肽和亲和标记物的融合肽。从该翻译事件中产生的融合蛋白经由肽的亲和标记物被捕捉剂捕捉。所得的阵列包括含与由核酸编码的肽缔合的核酸的不连续的单元。这些不连续的构建体单元可包括与具有不同的感兴趣的肽的其他构建体可区别的一个或多个构建体。在又一方面，本发明提供通过提供包括具有含包括编码感兴趣的肽和亲和标记物的区域和非翻译区的单链寡核苷酸的两个或多个构建体的表面的基底来构建阵列的方法，其中寡核苷酸在其5’端与基底表面连系。与寡核苷酸的非翻译区的引物退火在转录起始位点产生双链区域，其有效地起始编码感兴趣的肽和亲和标记物的肽的转录和翻译。在转录和翻译起始之前未将阵列的构建体转化为双链寡核苷酸。本发明还提供用于检测剂与感兴趣的肽的结合的方法，所述方法包括检测样品中剂的存在或不存在。这些方法包括提供包括以下的阵列具有表面的基底；在基底的表面上缔合的两个或多个单独的构建体，所述单独的构建体具有编码感兴趣的肽的寡核苷酸和感兴趣的肽本身两者。在具体的方面，用于这些检测方法中的阵列具有包括以下的两个或多个构建体编码感兴趣的肽的寡核苷酸区域、编码亲和标记物的寡核苷酸区域、和非翻译区；包括感兴趣的肽和亲和标记物的肽；和与亲和标记物选择性地结合的捕捉剂。剂与感兴趣的肽的结合的检测通过将阵列暴露于剂并检测剂与感兴趣的肽的结合的存在或不存在来实现。单独的构建体通过寡核苷酸与基底表面的缔合与阵列缔合，并且肽与寡核苷酸缔合，例如，通过亲和标记物与捕捉剂的结合。附图简述
图1A-1F示出用于本发明的复合的寡核苷酸-肽阵列的示例性构建体。图2示出包括含相同的融合肽的相同的构建体的组的阵列。图3示出包括以不同的构造含相同的寡核苷酸区域的构建体的组的阵列。图4示出包括具有相同的肽但具有不同的亲和标记物和捕捉剂的构建体的阵列。图5示出用于产生本发明的复合的寡核苷酸-肽阵列的第一一般方法。图6示出用于利用捕捉剂产生本发明的复合的寡核苷酸-肽阵列的第二一般方法。图7不出在珠子上利用捕捉剂和寡核苷酸模板的第一产生方法。图8示出在平面表面上利用捕捉剂和寡核苷酸模板的第二产生方法。图9示出利用对由寡核苷酸模板产生的肽的嘌呤霉素捕捉的第三产生方法。图10示出利用翻译后修饰，图9的产生方法的更具体的方面。图11示出利用图10中所示出的方法利用FGE的LCTPSR肽。图12示出利用测序流动池的一般测定系统。图13示出对本发明的阵列使用不同的构建体构造。图14示出对本发明的阵列使用扩散以产生光圈效应以减少假阳性。图15示出利用图7的珠子阵列获得的肽结合结果。图16示出利用如图8中所示产生的载玻片阵列获得的肽结合结果。定义本文所用的术语意在具有如本领域中的一般技术人员所理解的平常的和一般的含义。以下的定义意在协助读者理解本发明，除非特别指明，并不意在改变或以其他方式限制所述术语的含义。如本文所用的术语“亲和标记物”指选择性地与捕捉剂结合的结合配对中的一个成员。术语“结合配对”意为已知互相选择性地结合的任何两种分子。在两种蛋白的情况下，分子选择性地互相结合，如本文所更具体地描述。所述结合可包括共价和/或非共价结合。实例包括，但不限于，生物素和亲和素；生物素和链霉亲和素；抗体和其特定表位；和类似的结合。如本文所用的术语“捕捉剂”指经由与肽的亲和标记物结合或键合而允许捕捉肽的任何部分。捕捉剂和其亲和标记物之间的结合可以是共价键和/或非共价键。捕捉剂包括，例如，与融合肽上的亲和标记物选择性地结合的结合配对的成员，通过重组技术或其他机制添加的化学键，和类似的捕捉剂。在一个特定的方面，捕捉剂是与亲和标记物表位选择性地结合的抗体。利用包括杂交、交联(例如，利用补骨脂素的共价固定)、通过翻译后修饰导入和类似的常规技术可将捕捉剂与构建体缔合。术语“互补”指核酸结合配对的相互作用表面的拓扑相容性或交互结构。优选的互补结构互相具有结合亲和力，且核酸互相所具有的互补性程度越大，结构之间杂交越大。如本文所用的，术语“诊断工具”指用以对患者样品进行诊断检验或测定的本发明的任何组合物或测定。作为诊断工具，可考虑本发明的组合物为分析物特异性试剂的集合，且如此可形成由联邦或州政府机构所管理的诊断检验的部分。本发明的组合物作为诊断工 具的应用并不意在与治疗剂开发中的组合物的任何应用相关。本文所用的术语“寡核苷酸”意为核苷酸单体的线型聚合物。如本文所用的，该术语可指单链形式或双链形式。组成核酸的单体和寡核苷酸能够通过单体与单体相互作用的规则模式与天然多核苷酸特异性结合以形成双链体或三链体形式，所述规则模式比如碱基配对的Watson-Crick类型、碱基堆积、碱基配对的Hoogsteen或反向Hoogsteen类型，或类似的规则模式。所述单体和其核苷酸间键合可以是天然存在的或可以是其类似物，例如，天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可包括肽核酸、锁核酸、硫代磷酸核苷酸间键合、含允许标记物的连系的连接基团的碱基，所述标记物比如荧光团、或半抗原、和类似物。当寡核苷酸或核酸的使用要求酶促加工，比如被聚合酶延伸、被连接酶连接、或类似的酶促加工时，一般技术人员将理解当核苷酸间键合、糖部分或碱基的某些类似物与酶促反应不相容时，那些例子中的寡核苷酸或核酸将在任何位置或一些位置处不包含所述类似物。核酸的大小范围通常从几个单体单元(此时其通常被称作“寡核苷酸”)，例如，5-40个，至数十万或更多的单体单元。除非另外指明或从文中明显的情况，当核酸或寡核苷酸由字母(大写或小写)序列诸如“ATGCCTG”所代表时，将理解核苷酸从左到右按5’> 3’顺序，且“A”表示脱氧腺苷，“C”表示脱氧胞苷，“G”表示脱氧鸟苷和“T”表示脱氧胸苷，“I”表示脱氧肌苷，“U”表示尿苷。通常核酸包括由磷酸二酯键连接的天然核苷酸(例如，对于DNA的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或其对于RNA的核糖对应物)；然而，其还可包括非天然核苷酸类似物，例如，修饰的碱基、糖或核苷酸间键合。对于本领域中的技术人员，在酶对于活性具有特定的寡核苷酸或核酸底物需求，例如，单链DNA、RNA/DNA双链体或类似物时，则关于寡核苷酸或核酸底物选择适当的组合完全在一般技术人员的知识之内，尤其利用来自论文的指导，比如Sambrook等人 ，Molecular Cloning, SecondEdition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989),和类似的参考文献。术语“肽”、“多肽”和类似物在本文可互换地使用，且指任何长度的氨基酸聚合形式，其可包括编码氨基酸和非编码氨基酸、化学修饰或生物化学修饰的或衍生的氨基酸、和具有修饰的肽骨架的多肽。如本文所用的术语“研究工具”指用于科学探索、学术性质或商业性质的，包括药物治疗物和/或生物治疗物的开发的本发明的任何组合物或测定。本发明的研究工具将不意在为治疗性的或待经监管批准的；而是，本发明的研究工具意在协助研究和帮助这种开发活动，包括以产生支持监管提交的信息为目的进行的任何活动。
如本文所用的，术语“选择性地结合”、“选择性结合”和类似的术语当涉及结合伴侣(例如，蛋白、核酸、抗体等)时，指两种或多种结合伴侣以高亲和力和/或互补性进行的结合反应以确保在指定的测定条件下的选择性杂交。通常，特异性结合将为背景信号或噪声的至少三倍，更通常地为背景的多于10到100倍。从而，在指定的条件下，结合伴侣结合其特定的“靶标”分子但不以显著的量结合样品中存在的其他分子。术语“Tm”关于“解链温度”而使用。解链温度是一类双链核酸分子变为半解离成单链所处的温度。用于计算核酸的Tm的一些等式是本领域中熟知的。如由标准参考文献所指出的，Tm值的简单评估可通过等式Tm = 81. 5+0. 41 (%G+C)来计算，此时核酸在IM NaCl的水溶液中(参见，例如，Anderson 和 Young, Quantitative Filter Hybridization, inNucleic Acid Hybridization(1985)) 其他参考文献(例如，Allawi,H. T. & SantaLucia,J. ,Jr. ,Biochemistry 36,10581-94(1997))包括可选的计算方法，其将结构特征和环境特 征以及序列特征考虑在内以计算Tm。发明详述除非另外指明，本文所描述的技术的实践可采用有机化学、聚合物技术、分子生物学(包括重组技术)、细胞生物学、生物化学和测序技术的常规技术和描述，其在本领域中的实践者的技能之内。此类常规技术包括聚合物阵列合成、多核苷酸的杂交和连接、和利用标记物检测杂交。适宜的技术的具体例证可通过对本文所描述的实例的参考来获得。然而，当然也可使用其他等效的常规程序。此类常规技术和描述可见于标准实验室手册中，比如 Green,等人.,Eds. (1999), Genome Analysis A Laboratory Manual Series (Vols.I-IV) ；ffeiner, Gabriel, Stephens, Eds. (2007), Genetic Variation A LaboratoryManual ；Dieffenbach, Dveksler, Eds. (2003), PCR Primer ALaboratory Manual ；Bowtell和 Sambrook(2003) , DNA Microarrays AMolecular Cloning Manual ；Mount(2004),Bioinformatics Sequence and Genome Analysis ；Sambrook 和 RusselI (2006),Condensed Protocols from Molecular Cloning A Laboratory Manual ;以及 Sambrook和 Russell(2002), Molecular Cloning A Laboratory Manual (都来自 Cold SpringHarbor Laboratory Press) ；Stryer, L. (1995)Biochemistry(4th Ed. )ff. H. Freeman,New York N. Y. ；Gait, " Oligonucleotide Synthesis A Practical Approach" 1984,IRL Press, London ;Nelson 和 Cox(2000), Lehninger, Principles of Biochemistry 3rdEd.，ff. H. Freeman Pub.，New York, N. Y.；和 Berg 等人.(2002) Biochemistry, 5th Ed.，ff. H. Freeman Pub. , New York, N. Y.，其均为了所有目的以其整体通过引用并入本文。注意如本文和所附权利要求书中所用的，除非文中另外清楚地规定，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the) ”包括复数的指代对象。从而，例如，提及“阵列”指一个或多个这种阵列，提及“方法”包括提及本领域中的技术人员已知的等效步骤和方法，等等。除非另外定义，本文所用的所有科学和技术术语具有与本发明所属领域中的一般技术人员之一所普遍理解的相同的含义。为了描述和公开关于本文所描述的发明可使用的装置、制剂和方法的目的，本文所提到的所有出版物通过引用并入。在提供值的范围时，理解为范围的上限和下限之间的每个居中值和指定的范围中的任何其他指定的值或居中值包括在本发明中。这些较小的范围的上限和下限可独立地包括在较小的范围中，且也包括在本发明中，取决于指定的范围中的任何特定排除的极限。当指定的范围包括一个极限或两个极限时，排除那些包括的极限的任一个或两个的范围也包括在本发明中。在以下的描述中，列出了大量具体的细节以提供本发明的更彻底的理解。然而，对本领域中的技术人员将明显的是，本发明可在无这些具体细节的一个或多个的情况下实践。在其他的情形中，未描述本领域中的技术人员熟知的众所周知的特征和程序以避免混淆本发明。
发明概要本发明的阵列提供新颖的阵列组合物和以成本有效的方式产生这些阵列的方法。本发明的阵列包括寡核苷酸肽-编码模板和优选地双链寡核苷酸肽-编码模板两者，它们与由寡核苷酸模板编码的肽缔合。本发明的微阵列利用通过非常廉价的基于微阵列的合成获得的寡核苷酸模板的体外转录/翻译来产生。通过将与阵列表面连系的寡核苷酸转录为RNA模板，然后将这些模板翻译为肽而将阵列的寡核苷酸转化为寡核苷酸-肽复合构建体。然后所翻译的肽经由不同的机制与寡核苷酸模板缔合，所述不同的机制包括化学连接物基团的使用、捕捉剂的使用和类似物。在阵列上可获得的多种肽反映阵列上的初始寡核苷酸模板的复杂性。在本发明的一个具体的方面，阵列包括用来与肽上的亲和标记物区域结合的捕捉齐U。在该例子中，肽是包括亲和标记物区域的融合肽，所述亲和标记物在C-末端区域结合捕捉剂，并在N-末端区域结合感兴趣的肽。亲和标记物由构建体中的寡核苷酸模板所编码，并用来捕捉通过转录和翻译产生的融合肽。在一个优选的方面，阵列上的多种肽将包括相同的亲和标记物，允许使用待用于构建体中的共同的捕捉剂。例如，阵列可包括具有单一共同亲和标记物和捕捉剂的不同的序列的肽。这允许在阵列的构建过程中使用待添加的单一肽结合部分，显著地降低产生的复杂性和成本。在另一个实例中，阵列可包括具有相同的感兴趣的肽序列但具有不同的亲和标记物和捕捉剂的两个或多个构建体。后一种方法允许形成具有内部控制机制的阵列以确保感兴趣的肽的活性不受构建或使用该阵列的过程的不利影响。本发明的蛋白微阵列产生的方法是可靠的和可重复的，且能够产生同样品质和蛋白量的相同的阵列。本发明的阵列在包括来自不同的种类和大小的蛋白和其片段的多种肽的展示中是有用的。每阵列单元的蛋白的产量是足够高的以允许特定阵列单元的可重复的和不连续的检测和/或活动。这允许阵列在相对低的成本下以具有极高密度的大规模来产生。重要地，本发明的阵列具有展示功能性肽的能力，所述功能性肽包括完整的蛋白、肽结构域、蛋白的活性位点、和类似的功能性肽。本发明的一个特征是可产生肽阵列以研究一般难以从体内来源分离的功能性蛋白，例如，不溶的蛋白诸如朊病毒或P淀粉样肽。本发明的阵列包括与基底表面和感兴趣的肽两者缔合的双链或单链寡核苷酸。图IA到IF示出3种示例性的分子。在图IA中，阵列构建体包括寡核苷酸部分102，其包括非 翻译区110、编码感兴趣的肽的区域112和编码亲和标记物和终止密码子的区域114。寡核苷酸可直接地与表面缔合，或任选地利用连接物106与阵列连系。一般，单链与阵列表面连系，且该链可在其3’或5’端连系。寡核苷酸远离阵列的部分包括肽缔合部分116，其允许从寡核苷酸模板产生的肽在体外转录和翻译之后与构建体缔合。缔合的肽150包括由寡核苷酸的编码区域112编码的感兴趣的肽120，所述感兴趣的肽120与由寡核苷酸的区域114所编码的亲和标记物122融合。亲和标记物122允许肽150连系到寡核苷酸。在图IB中，肽缔合部分116包括捕捉剂，例如，抗体或蛋白结合配对的成员。在图IC中，寡核苷酸构建体可在转录和翻译之后移除一条链，得到具有编码肽的序列或与编码肽的序列互补的序列的单链分子104。该单链可在其3’或5’端与基底表面连系。虽然示出了非翻译区邻近捕捉剂的构建体，可构造构建体以使非翻译区与基底表面连系且编码亲和标记物的区域与捕捉剂邻近。例如，图ID示出具有与图IB中的那些相 b同的组分的构建体，但其中寡核苷酸102的方向有效地翻转了。在图IE和IF中,捕捉剂116相对于寡核苷酸在基底表面的邻近缔合。捕捉剂116可经由将寡核苷酸部分与基底表面108连系的连接物106 (如IE中所示出的)或经由寡核苷酸102自身(如IF中所示出的)与构建体缔合。此处所示的寡核苷酸构建体102可以是如图IC中所示出的单链的，或如图1A、1B和ID中所示出的双链的。一般，单链与阵列表面连系，且可将链在其3’或5’端与基底表面连系。阵列可包含单独的构建体，其自身是用于分析感兴趣的肽的不连续的、可询问的单元。然而，对于某些应用，需要增加在阵列上产生的信号的强度。从而本发明还包括具有含展示同样的感兴趣的肽的两个或多个相同的构建体的不连续的可询问单元的阵列。例如，在图2中，阵列包括具有位于阵列上的不同的构建体的基底，所述构建体在两个或多个构建体的不连续的组中，其优选地应用用于将肽与寡核苷酸缔合的同样的捕捉剂和亲和标记物。第一组的构建体包括含非翻译区210、编码第一感兴趣的肽的区域212、和编码亲和标记物和终止密码子的区域214的寡核苷酸部分202。第二组的构建体包括含非翻译区210、编码第二感兴趣的肽的区域232、和编码亲和标记物和终止密码子的区域214的寡核苷酸部分204。两组的寡核苷酸均可直接地与表面缔合，或任选地利用连接物206与阵列连系。寡核苷酸远离阵列的部分包括肽缔合部分216，其允许从寡核苷酸模板产生的肽在体外转录和翻译后与构建体缔合。第一组的缔合的肽250包括与由214编码的亲和标记物222融合的第一感兴趣的肽220。第二组的缔合的肽252包括与和第一组同样的亲和标记物222融合的第二感兴趣的肽240，所述亲和标记物222如在第一构建体中一样由共同区域214所编码。在另外的方面，阵列可包括单独的构建体，所述单独的构建体具有相对于基底以不同的关联的同样的寡核苷酸区域。在图3中，构建体具有与图IB和ID的构建体同样的组分，其中一组构建体在阵列上具有至少一个图IB的构造的构建体，第二组构建体在阵列上具有至少一个图ID的构造的构建体。第一组的构建体包括含非翻译区310、编码第一感兴趣的肽的区域312、和编码亲和标记物和终止密码子的区域314的寡核苷酸部分302，其中后一区域314与基底表面连系。第二组的构建体包括含非翻译区310、编码第一感兴趣的肽的区域312、和编码亲和标记物和终止密码子的区域314的寡核苷酸部分304，但在该构造中第一区域310与基底表面连系。两组的寡核苷酸均可直接地与基底表面缔合，或任选地利用连接物306与阵列连系，且它们可经由3’或5’端与表面连系。寡核苷酸远离基底表面的部分包括肽缔合部分316，其允许从寡核苷酸模板产生的肽在体外转录和翻译后与构建体缔合。在本发明的另外的方面，需要的是在阵列上具有两个或多个构建体，所述构建体包括与不同的亲和标记物融合的和与寡核苷酸上的不同的捕捉剂缔合的同样的感兴趣的肽。这在图4中示出。这里，所示出的阵列包括单独的构建体，所述单独的构建体包括编码同样的感兴趣的肽的寡核苷酸，但其中每种肽与寡核苷酸上的两种不同的捕捉剂缔合。第一组寡核苷酸402和452包括同样的非翻译区410和编码第一感兴趣的肽420的区域412，但它们与编码不同的亲和标记物的不同的区域414和444连接。从这两个构建体产生的肽将包括同样的感兴趣的肽，但所述同样的感兴趣的肽与利用两种不同的捕捉剂416、446捕捉的两种不同的亲和标记物融合。相似地，第二组寡核苷酸404和454包括同样的非翻译区410和编码第二感兴趣的肽440的 区域442，但它们与编码不同的亲和标记物422、432的不同的区域414和444连接。肽阵列制造过程的一般方法本发明的阵列可利用采用大量技术中的任何一种初始定做的寡核苷酸阵列来产生。阵列可在平面表面上产生或在一系列不连续的平面，例如，珠子上产生，所述一系列不连续的平面在一起形成阵列。复合寡核苷酸-肽阵列可利用任何单链或双链寡核苷酸阵列来产生。用于此类寡核苷酸阵列产生的适宜的方法可见于，例如，2009年7月授予Chenchik等人的美国专利第7，556，919号；2007年11月授予Sampson等人的美国专利第7，291，471号；2001年9月授予Boyce-Jacino等人的美国专利第6，294，336号；2001年9月授予Pirrung等人的美国专利第6，291，183号；2001年9月授予Sabanayagam等人的美国专利第6，284，497号；2001年7月授予Pirrung等人的美国专利第6，261，776号；2001年4月授予Dellinger等人的美国专利第6，222，030号；2000年7月授予Dale的美国专利第6,087，112 号;2000 年 6 月授予 Schliefer 和 May 的 6，077，674 ;1999 年 7 月授予 Sundberg等人的美国专利第5，919，523号；1999年I月授予Chee等人的美国专利第5，861，242号；1999年I月授予Lipshutz等人的美国专利第5，856，174号；1998年11月授予Chee等人的美国专利第5，837，832号；1998年6月授予Lockhart等人的美国专利第5，770722号；1998年5月授予Rosch等人的美国专利第5，750，669号；1998年12月授予McGal I的美国专利第5，843，655号；1997年12月授予Southern的美国专利第5，700，637号；1998年3月授予Dehlinger的美国专利第5，723，320号；1997年12月授予Drmanac等人的美国专利第5，695，940号；1997年5月授予Stern等人的美国专利第5，631，724号；1996年9月授予Lockhart等人的美国专利第5，556, 752号；1996年7月授予Drmanac等人的美国专利第5，525，464号；1996年2月授予Drmanac等人的美国专利第5，492，806号；1995年8月授予Fodor等人的美国专利第5，445，934号；和1995年7月授予的美国专利第5，436，327号。利用这些或其他此类阵列技术，可在阵列上平行地合成许多寡核苷酸模板。除编码感兴趣的肽(或与编码感兴趣的肽的序列互补的序列)之外，单链寡核苷酸包括对应于非翻译区或与通用非翻译区互补的区域的通用引物序列。而且，寡核苷酸与用于在翻译之后捕捉妝的区域缔合。可合成寡核苷酸以具有这些元件中的每一个，或可通过将不同的元件添加到与基底表面缔合的初始寡核苷酸而在基底上构建寡核苷酸。例如，在一个实例中，用于构建阵列的寡核苷酸在该寡核苷酸的一端包括编码亲和标记物的区域和终止密码子并在该寡核苷酸的另一端包括用于连系长的通用非翻译区的引物区域。当单链寡核苷酸用于阵列的构建时，该单链寡核苷酸还包括与引物互补的区域，其用来合成与单链寡核苷酸互补的链，导致单链寡核苷酸延伸成为用于体外转录和翻译反应的双链寡核苷酸模板。在一个优选的方面，寡核苷酸将包括用于在寡核苷酸的5’端连系非翻译区和在寡核苷酸的3’端连系编码亲和标记物的序列的引物。可选地，基底结合的单链寡核苷酸可包括反向互补序列，且与初始寡核苷酸互补的链将被转录。在后者的情况下，包括与非翻译区互补的序列和亲和标记物的单链寡核苷酸最初与基底结合。本发明的阵列上的构建体的一个特征是，具有缺失的肽片段或肽将被选择排除，因为从含有缺失或插入(例如，来自寡核苷酸合成的副产物或转录中的错误)的模板表达的融合肽一般将不会在阵列上被捕捉，因为它们在翻译过程中将具有移码且将不会展示亲和标记物的正确的序列。非翻译区优选地包括用于起始转录和翻译事件以产生阵列的肽的5’端的转录启 动子区域、其后为核糖体结合位点(RBS)。非翻译的序列可包括在最初合成的寡核苷酸中，或可利用多种技术将其与寡核苷酸模板连系。在一个实例中，寡核苷酸的5’引物区域可包括限制性内切酶位点，并且可通过消化和连接将通用非翻译区添加到寡核苷酸的5’。在另一个实例中，可使用与5’引物区域和通用非翻译区二者互补的引物用于两个分子的夹板连接(splint ligation)。图5示出利用单链寡核苷酸阵列产生本发明的阵列的一般方案。本方法始于排列在表面508上的寡核苷酸500，所述寡核苷酸500任选地经由连接物序列506与表面连系。寡核苷酸500各包括编码亲和标记物和终止密码子的第一区域514，且其包括与用于寡核苷酸的引物延伸的引物选择性地杂交的序列，所述寡核苷酸500包括编码肽或与编码肽的区域互补的编码区512、和用于连系通用非翻译区518和/或所编码的肽的捕捉剂516的第二引物区域510。捕捉剂516可以是与亲和标记物相互作用和结合的化学连接物基团。在步骤511中单链分子从引物区域514的延伸和非翻译区的连系产生双链模板502，其包括构建体上位置远离基底508的捕捉剂516。在该实例中，编码区域512编码感兴趣的肽，引物延伸区域514包括与捕捉剂516结合的亲和标记物的编码区域和终止密码子。体外转录和翻译将产生融合肽550，其包括感兴趣的肽520和亲和区域522，其中后者在肽合成后与捕捉剂516缔合。在本发明的某些方面，产生DNA作为双链分子。为将捕捉剂添加到该分子，可利用末端转移酶对其加尾以添加缔合寡聚dA的捕捉区域可与其杂交的单链寡聚dT区域。图6示出利用单链寡核苷酸阵列和捕捉剂产生本发明的阵列的另一个一般方案。本方法始于排列在表面608上的寡核苷酸600,所述寡核苷酸600任选地经由连接物序列606与表面连系。寡核苷酸600各包括编码亲和标记物和终止密码子的第一区域614，且其包括与用于寡核苷酸的引物延伸的引物选择性地杂交的序列，所述寡核苷酸600包括编码肽或与编码肽的区域互补的编码区612、和用于连系通用非翻译区618和/或捕捉剂616的第二引物区域610，所述捕捉剂616包括与区域614所编码的亲和标记物特异性结合的捕捉齐U。在步骤611中单链分子从引物区域614的延伸和非翻译区的连系产生双链模板602，所述双链模板602包括位于构建体上远离基底表面608的捕捉剂。在该实例中，所编码的区域612编码感兴趣的肽，引物延伸区域614编码与捕捉剂616结合的亲和标记物、以及终止密码子。体外转录和翻译将产生融合肽650，其包括感兴趣的肽620和亲和区域622两者，其中后者在肽合成后与肽缔合部分616缔合。
在某些产生方法中，将寡核苷酸拴系在不同的表面，例如，在溶液中提供的珠子上。图7示出利用寡核苷酸与分离的表面例如珠子的连系来构建本发明的阵列的更详细的方法。利用寡核苷酸模板700构建阵列，所述寡核苷酸模板700包括用于导入捕捉剂的区域710、编码感兴趣的多肽的区域712、和编码亲和标记物和随后的终止密码子的区域714。区域714还包括用于引物延伸单链寡核苷酸的引物位点，且任选地通过连接物分子708将其与珠子718的表面连系。珠子718上的寡核苷酸700以磷酸化的形式来提供，或可选地在步骤711中磷酸化以允许添加寡核苷酸延伸物。然后在步骤713中寡核苷酸延伸物702经由夹板连接技术利用与寡核苷酸800和寡核苷酸延伸物802 二者均选择性结合的连接寡核苷酸840与模板寡核苷酸700连接。寡核苷酸延伸物702包括包括非翻译区和用于夹板连接的引物区的区域704 ;任选地连接物分子738 ;和用于连系捕捉基团716的寡核苷酸区域736。产生阵列的下一步骤是组合步骤715，以添加捕捉剂716和用于引物延伸的引物724。然后，与寡核苷酸延伸物702的区域736互补的寡核苷酸742缔合的捕捉剂716、和用作用于引物延伸的引物的寡核苷酸724与珠子上的寡核苷酸杂交。进行引物延伸步骤717以将编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸转化为用于体外转录和翻译的双链模板。在步骤719中从该双链模板进行转录和翻译，产生包括感兴趣的肽720和亲和标记物722的融合肽750。因为所产生的融合肽750在翻译后从寡核苷酸模板扩散，其被捕捉剂716来捕捉。直接在珠子上合成的构建体可作为合成的来使用，S卩，作为分离的表面例如珠子的集合上的构建体的阵列，或可在在它们的表面上合成寡核苷酸-肽融合物之前或之后将它们排列在平面表面上。在排列珠子之前进行合成的情况下，一般采取措施来防止肽与邻近构建体的相互作用，例如，可利用每个含有在平板中的不同的孔中分开的不同的序列的珠子类型进行转录和翻译以确保来自包括一个构建体的珠子组(bead set)的肽不会被不同的珠子组所捕捉。这些表面例如珠子可利用诸如以下中所描述的技术来分离和排列，例如，2006年6月授予Chee等人的美国专利第7，060，431号。图8示出用于利用寡核苷酸与平面阵列的连系来构建本发明的阵列的更详细的优选的方法。利用寡核苷酸模板800来构建阵列,所述寡核苷酸模板800包括用于导入捕捉剂的区域810、编码感兴趣的多肽的区域812和编码亲和标记物以及随后的终止密码子的区域814。区域814还包括用于引物延伸单链寡核苷酸的引物位点，并且其任选地通过连接物分子808与基底804的表面连系。在步骤811中平面阵列804上的寡核苷酸800被磷酸化以允许添加寡核苷酸延伸物。然后在步骤813中经由夹板连接技术利用与寡核苷酸800和寡核苷酸延伸物802两者选择性地结合的连接寡核苷酸840将寡核苷酸延伸物802与模板寡核苷酸800连接。寡核苷酸延伸物802包括包括非翻译区和用于夹板连接的引物区域的区域804 ;任选地连接物分子838 ;和用于连系捕捉基团816的寡核苷酸区域836。产生阵列的下一步是步骤815以添加捕捉剂816和用于引物延伸的引物824。缀合与寡核苷酸延伸物802的区域836互补的寡核苷酸842的捕捉剂816,引物824可同时地或顺序地与载玻片上的寡核苷酸杂交。进行引物延伸步骤817以将编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸转化为用于体外转录和翻译的双链模板。在步骤819中从该双链模板进行的体外转录和翻译反应产生包括感兴趣的肽820和亲和标记物822的融合肽850。因为所产生的融合肽850在翻译后从寡核苷酸模板区域扩散并远离平面表面，所以通过捕捉剂816将其捕捉。在另一个实例中，本发明的构建体利用嘌呤霉素捕捉方法来产生。图9示出用于在平面表面上构建所述阵列的一般方法，然而也设想了阵列可在珠子上形成，比如图7中所描述的。本方法始于在基底表面908上排列的双链寡核苷酸900,任选地经由连接物序列906在寡核苷酸的3’端或5’端与表面连系。寡核苷酸900各包括编码感兴趣的肽的编 码区域912、含RNA亲和标记物以及随后的终止密码子的区域914、和含转录启动子的非翻译区910，DNA 918的RNA结合区和嘌呤霉素916与所述非翻译区910连系。体外转录步骤911产生包括编码感兴趣的肽的区域926和亲和标记物924的mRNA分子。亲和标记物924与寡核苷酸的区域918选择性地杂交，将mRNA分子拴系在构建体。在翻译过程中，当核糖体到达RNA-DNA杂交区域时将停顿。在体外翻译步骤913后，肽920被嘌呤霉素剩余区域916捕捉。通过翻译后修饰的肽捕捉在特定的方面，可添加化学反应性物质(例如，醛标记物)以协助构建体的构建和其他结合区域的标记元件的导入。例如，导入由甲酰甘氨酸生成酶识别的硫酸酯酶共有序列导致将醛基位点特异性地导入到重组蛋白中。该共有序列可以为6-13个氨基酸之间，且最小的此类“醛标记物”不大于His6标记物。通过甲酰甘氨酸生成酶(FGE)在硫酸酯酶基序处进行酶修饰生成甲酰甘氨酸(FGly)残基，其允许通过对肼或肟标记的寡核苷酸模板的共价捕捉使捕捉剂或其他感兴趣的部分与肽位点特异性地连系。该修饰也是可逆的，且从而该标记物导入到重组肽中允许可逆地以多个表位修饰醛标记的蛋白。用于本发明的醛标记物的实例描述于以下中，例如，US2008/0187956 ；T. Dierks和M. -A. Frese,ChemBioChem 10，425-427(2009) ；JS Rush 和 CR Bertozzi J. Am. Chem. Soc. 9 Vol. 130 37, (2008) ； JLandgrebe 等人.，Gene 31647-56 (2003) ；I Carrico, Nat. Chem. Biology 3 6(2007) ;Carlson等人 ，J Biol Chem. 2008Jul 18 ；283(29) :20117-25 ;和Wu等人 ，ProcNatl Acad Sci U S A. 2009Mar 3 ；106(9) :3000-5 ;其每一项以其整体通过引用并入以用于教导有用的标记物及其在肽修饰中的应用。在更具体的方法中，共价连接的肽阵列的生成显示于图10中。该方法是进行图I中所描述的更一般的方案的示例性方法，但使用共价连系。其应用了利用由最近报道的将半胱氨酸残基氧化为甲酰甘氨酸的甲酰甘氨酸生成酶(FGE)所识别的6-mer肽共有序列(LCTPSP，称作醛标记物)将醛基位点特异性地导入到重组蛋白的方法。在该方面，在肽阵列产生过程中醛标记物将会将FGE添加到体外转录/翻译过程。可生成具有C-末端醛标记物的肽，且标记物中的半胱氨酸残基转化为甲酰甘氨酸，所述甲酰甘氨酸将与掺入到阵列表面上的DNA模板中的活性基团反应。这将产生与其DNA模板共价连接的肽的阵列。该方面在图10和11中更详细地示出。寡核苷酸模板编码感兴趣的肽序列1006和包括醛亲和标记物(LCTPSP)和终止密码子的区域1004。含非翻译区(UTR)以及17启动子和核糖体结合位点(RBS)的通用序列1010经由远端标记物1018被添加1001到模板并用于延伸模板以产生双链核酸1002，所述双链核酸1002包括用于由与基底1008缔合的链上的1006所编码的感兴趣的肽1016的捕捉基团1014。反应基团1022任选地依靠连接物分子1012与双链寡核苷酸模板1002的另一条链缔合。包括感兴趣的肽序列1016和醛标记物1020的肽被产生1003后，其通过感兴趣的肽和捕捉基团1014的相互作用被捕捉。醛标记物1020被转化1005为醛基1024，且其与反应基团1022相互作用。在未与基底1008缔合的核酸的链解离1007后，编码感兴趣的肽1016的单链寡核苷酸仍经由反应基团和醛基与肽1016缔合。任选地，可去除捕捉剂1014。在图11中，具有感兴趣的序列的肽1116在FGE酶存在下经由体外转录/翻译而生成。如在图11中详细地示出的，与感兴趣的肽1116融合的醛标记物1120可通过1116中的肼或氨基氧乙酸残基与FGE的相互作用而生成，所述FGE将掺入到肽中的LCTPSR区域转化1101为醛基1124。该醛基用于与反应基团1122相互作用以将感兴趣的肽1116与编码感兴趣的肽的寡核苷酸1106、通用序列和编码醛标记物的序列1104缔合。利用测序流动池的测定系统 在一个特定的方面，在流动池的表面上提供了用于肽阵列的产生的编码序列，所述流动池例如用于测序技术的流动池。可将编码序列随机地排列在流动池的表面上。阵列的构建体可通过以下来产生通过在寡核苷酸模板的合成过程中使限定位置处的碱基随机化，通过组合较短的寡核苷酸以形成较长的模板，或通过从基因组DNA或cDNA文库衍生序列的文库。已将序列置于流动池的表面上后，在产生拴系的蛋白和其在筛查测定中应用之前或之后可确定每个序列的身份。在表面上产生肽阵列之前，可任选地在原位克隆扩增编码序列，其中每个序列形成克隆扩增的DNA分子的“簇”。在该特定的方面，可获得非常高的堆积密度，例如，可将几亿的簇排列在流动池表面上。排列数百万DNA模板并确定其序列的能力开启了非常高效且廉价地生成大型组合蛋白文库的可能性。图12中显示利用用于阵列基底的测序流动池的一般方案。寡核苷酸1202构建于流动池表面1208上，包括感兴趣的序列1212、连接物区域1204和引物结合区域1214。在表面1206上任选地存在其他连接物区域以用于原位扩增寡核苷酸模板的目的。在对这些构建物测序之后，寡核苷酸-抗体缀合物1216与成簇的DNA序列的3’端退火1201。所有DNA序列编码肽或蛋白并具有17启动子(或相似的)以能够进行有效的转录，以及有效的翻译所需的非翻译区(UTR)。利用DNA聚合酶延伸1203缀合物1216的寡核苷酸部分以产生与所连系的寡核苷酸1202互补的寡核苷酸1222。偶联的转录/翻译反应(TNT) 1205导致由成簇的DNA 1202编码的肽或蛋白1220的产生和其与自己的模板的连系。所有肽具有用于抗体捕捉(未显示)的C-末端亲和标记物。可使用其他捕捉分子和亲和标记物组合。这种结合配对的实例包括，但不限于，链霉亲和素和生物素，Ni-NTA和His6标记物，或两个化学反应基团(醛标记物和肼残基)。该方法还适用于允许体外克隆单分子的其他形式。例如，代替利用表面PCR在流动池的表面上进行捕捉和扩增，模板分子可被捕捉在珠子上并通过乳液PCR来扩增。该过程用于生成用于某些下一代测序技术的克隆模板。虽然单独的模板的扩增是优选的，在某些方面，可在不使用克隆扩增的情况下确定单分子序列。
任选地，流动池的表面可包括表面上的其他连接物区域，其为寡核苷酸模板的原位扩增的目的而存在。在构建肽-核酸杂交体之前或构建和/或使用(未显示)之后对这些构建体进行测序。在前者的情况下，在产生这些肽-核酸构建体之前对构建体进行测序，并将寡核苷酸-抗体缀合物与表面上的成簇的DNA序列的3’端退火。可选地，可在测定形式中的特定序列的构建和/或鉴定之后确定序列。可将抗体装载到流动池的表面上，与引物部分相偶联，并仅针对流动池上的DNA簇，因为DNA-抗体复合物将仅与延伸的DNA杂交。可选地，可将与和表面上的寡核苷酸互补的寡核苷酸偶联的抗体导入到流动池表面。在该方面，装载抗体遍及流动池的整个表面，因为DNA-抗体复合物将与平均分布遍及流动池的表面的寡核苷酸引物杂交。然后利用本文所描述的方法之一从这些DNA模板形成肽阵列。测序技术诸如由Illumina Genome Analyzer technology所提供的测序技术允 许从两端对DNA模板进行测序以生成读取序列的“双末端(paired end) ”配对。在Illuminatechnology的情况下,这解决了 a)通过测序一条链获得配对的一端的序列；然后b)通过测序反向互补链获得配对的另一端的序列。进行过程以生成并顺序地呈现用于测序的适当的链。因此，阵列还可利用第二(即，反向互补)链，仅通过选择与捕捉剂(即，在这些实例中，抗体)缀合的适当的序列来构建。本发明的阵列可应用多重连接事件以增加寡核苷酸模板的长度，并从而增加通过体外转录和翻译产生的肽的长度。这可通过使用限制酶消化和连接来实现，或优选地利用同与阵列缔合的寡核苷酸和待添加到阵列的寡核苷酸二者互补的引物使用夹板连接(splint ligation)来实现。例如，利用诸如关于添加包括非翻译区的寡核苷酸所描述的夹板连接可将区域添加到阵列上的全部构建体或构建体的亚组。在另一个实例中，具有两个或多个不同的序列的寡核苷酸的库可与具有对应的互补序列的夹板连接引物一起使用，允许将多个不同的可变的寡核苷酸添加到与基底缔合的寡核苷酸。这些方法还可任选地组合以产生具有包括恒定区域和可变区域的附加的区域的构建体。这些技术在产生包括用于探索的较长的蛋白的阵列中尤其有用。例如，许多蛋白具有仅在C-末端或N-末端的结构域中不同的多种可替代剪接的同种型，且本发明的阵列可具有在基底表面上直接合成的这些蛋白的可变区域和经由连接添加到这些寡核苷酸的共同结构域。在一个特定的实例中，存在产生的至少27种可替代地剪接的神经细胞黏附分子(NCAM)mRNA，且NCAM的3种主要的同种型仅在其胞质区中不同。在本发明的阵列上产生较长的寡核苷酸模板的能力可提供工具以更好地阐明不同形式的蛋白的活性和蛋白相互作用，并进而洞悉调控，例如，以用于治疗物开发。关于本发明的阵列，设想了具有某些恒定结构域例如N-末端、C-末端、活性结合位点、酶活性区域等的构建的区域的大量其他此类应用，本领域中的技术人员阅读本公开内容之后将变得清楚。由于这些构建体的稳定的性质，在某些测定系统中阵列还可应用两次或多次。肽与寡核苷酸经由亲和标记物-捕捉剂相互作用的结合是比在大多数暂时蛋白-蛋白相互作用中所见的更紧密的键，且从而可有效地移除用于探索阵列的许多蛋白和化合物以允许阵列用于其他探索。而且，通过除去构建体的所有杂交的部分可再生成阵列，有效地更新了用于构建肽阵列的初始阵列。可再次将单链寡核苷酸转化为双链寡核苷酸，且本发明的方法的其余步骤用于再生成包括肽的本发明的阵列。
引物延伸在多个方面，初始寡核苷酸是单链寡核苷酸，其在基底表面上合成并通过例如引物延伸被转化为双链分子。引物延伸可通过引物与单链寡核苷酸模板上的引物结合区域的杂交来起始，其中延伸后的结果是包括非翻译区、肽编码区域和编码亲和标记物的区域的双链模板。优选地，引物结合区域掺有亲和标记物序列和/或终止密码子序列，然而引物结合区域还可位于亲和标记物序列和终止密码子的3’。引物延伸过程通常应用与寡核苷酸模板互补的一种或多种引物，其在聚合酶和游离dNTP的存在下驱动相反链的合成。在这种方面，在寡核苷酸模板区域延伸后通常有聚合酶终止特征导入到DNA分子中。该特征可包括合成连接物，比如聚乙二醇(PEG)特征、不能被聚合酶利用的核苷酸类似物、被导入到模板区域上游的双链引物区域上的切口(例如，通过切口酶或尿嘧啶的降解)和类似的特征。多种引物/亲和标记物编码区域可用于单一构建体，其可允许在阵列的构建中与不同的亲和标记物-捕捉剂结合配对一起使用单一寡核苷酸。构建体还可具有远离基底表面的这种序列以协助捕捉剂的选择性连接。用于本发明的基底通常，本发明的基底是无孔的，尤其是当通过要求小体积的杂交反应分析单一分子的随机阵列时如此。适宜的基底包括由诸如玻璃、聚丙烯酰胺涂层玻璃、陶瓷、硅石、硅、石英、多种塑料和类似物的材料构成的基底。在一方面，基底是珠子。在另一方面，基底是平面表面。通常，对于常规使用，平面表面在从0. 02到20cm2的范围中或甚至更大。对基底尺寸的限制基于所用的检测方法和解析表面上不同的构建体和/或构建体的区域的能力(例如，在荧光标记物的情况下，光学解析的能力)。随着检测方法的持续改进，基底尺寸可增大和/或基底上的构建体的密度可增大。本发明的基底的形式包括基本上平面的表面，以及具有引入到基底表面的变化形式，例如，凹坑、孔、支座和类似物的基底。这种基底一般由具有刚性的或半刚性的表面的材料或所述材料的组所构成。在某些方面，期望地是阵列上的物理上分离的区域，所述阵列具有，例如，孔、凸起的区域、支座、蚀刻的孔或类似物。这种基底可以，例如，利用多层涂层技术或本领域中其他熟知的技术来产生。用于产生有型式的阵列的技术的实例包括热和/或电子束气相沉积、复制、转移或薄膜沉积；CVD-型工艺(LPCVD，PECVD等)；PVD_型工艺诸如喷镀，例如，DC磁控管喷镀；离子辅助沉积工艺和溶胶-凝胶工艺。任选地通过成键或分子黏附将基底的多层转移到底部上。在本发明的不同的方面，可使用连接物将阵列构建体连系到表面。可使用多种类型的连接物，且一般将根据构建体的类型(氨基酸、核苷酸等)、连接物的期望的性质(长度、柔性)和其他类似的性质来选择连接物。此类连接物可包括核苷酸、多肽、或适宜的合成材料。连接物结构优选地为由生物相容的聚合材料(例如，聚乙二醇)组成的烃基础聚合物。而且，连接物的选择取决于捕捉剂是否在构建体的连接物部分缔合构建体。在某些方面，表面固定的构建体包括直接与基底连系的可裂解连接物，其允许特定构建体与基底分离。在一些方面，对于所有的表面固定的构建体，可裂解连接物将是同样的或相同的。在其他方面，基底上的构建体的某些亚组将具有同样的可裂解连接物，其中该 可裂解连接物不同于同样的基底表面上其他亚组所用的可裂解连接物。这允许将某些构建体与基底分离，同时不分离其他构建体。
在某些方面，对于基底表面使用微流体密封垫系统以有效地隔离肽阵列上的每个特征以使得能够在阵列的合成和利用阵列进行分析的过程中控制扩散。这允许在阵列的一个或多个部分中更好地控制反应条件。例如，因为密封系统限制了扩散，体外转录和翻译可进行较长的时间段。而且，捕捉肽后，可进行洗涤和/或反应物交换步骤，使新反应诸如肽的共价键合能够发生。最后，由密封垫提供的密封系统允许在第二表面上捕捉肽。以这种方式，可从初始模板DNA阵列产生多个肽阵列，而不要求穿过膜的扩散，诸如He M Nat.Methods 5:175-177(2008)中所要求的。肽捕捉的结合配对大量结合配对可用于设计本发明的阵列中使用的亲和标记物和捕捉剂。这些包括，但不限于，链霉亲和素和短的链霉亲和素结合肽诸如StrepTag (Schmidt等人.，1996 ；Schmidt & Skerra, 1994 ;Skerra & Schmidt, 2000) > StrepTag II (Schmidt & Skerra,2007 ；Voss & Skerra, 1997)和 HPQ 基序(Giebel 等人 ，1995 ；Helms 等人 ，2007);寡聚组氨酸肽标记物和His6结合组(Crowe等人.,1994 ；Smith等人.,1988) ；FLAG肽标记物和His6肽组；生物素和链霉亲和素、生物素和亲和素、和抗体-抗原配对、以及类似的配对。肽结合配对的相互作用的强度可通过其结合配对的一部分对于结合配对的另外的成员上的给定结合位点或表位的“结合亲和力”来表征。例如，在免疫学的领域中，以其对于给定结合位点或表位的“结合亲和力”来表征抗体。每个抗体由特定的3维结构的氨基酸构成，抗体与称作表位或抗原的另一结构结合。结合伴侣对于组合物的选择性结合是简单的双分子、可逆反应，并非不同于抗体对其抗原的结合。例如，如果抗体由Ab代表，且抗原由Ag代表，可通过标准动力学理论来分析反应。假设一个单一结合位点，反应由如下的等式I所代表
权利要求
1.一种阵列，所述阵列包括 具有表面的基底； 在所述基底的所述表面上缔合的两个或多个单独的构建体，其中所述单独的构建体包括 编码感兴趣的肽的寡核苷酸；和 所述感兴趣的妝； 其中所述寡核苷酸与所述基底表面缔合，且所述肽与所述寡核苷酸缔合。
2.—种阵列，所述阵列包括 具有表面的基底； 在所述基底的表面上缔合的两个或多个单独的构建体，其中所述单独的构建体包括 包括编码感兴趣的肽的区域、编码亲和标记物的区域和非翻译区的寡核苷酸； 包括所述感兴趣的肽和亲和标记物的肽；和 与所述亲和标记物选择性地结合的捕捉剂； 其中所述寡核苷酸与所述基底表面缔合，且所述肽通过所述亲和标记物与所述捕捉剂的结合与所述寡核苷酸缔合。
3.如权利要求2所述的阵列，其中所述非翻译区包括转录起始位点和核糖体结合位点。
4.如权利要求2所述的阵列，其中所述捕捉剂与所述寡核苷酸缔合。
5.如权利要求2所述的阵列，其中所述寡核苷酸经由连接物与所述基底表面缔合。
6.如权利要求2所述的阵列，其中所述捕捉剂与所述连接物缔合。
7.如权利要求2所述的阵列，其中所述基底是平面支持体。
8.如权利要求2所述的阵列，其中所述基底是珠子。
9.如权利要求2所述的阵列，其中所述寡核苷酸是双链的。
10.如权利要求2所述的阵列，其中所述寡核苷酸还包括用于将所述捕捉剂导入所述寡核苷酸的区域。
11.如权利要求10所述的阵列，其中所述区域经由连接物分子与所述寡核苷酸缔合。
12.—种构建阵列的方法，所述方法包括以下的步骤 (a)提供包括两个或多个构建体的表面，所述构建体包括编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸区域； (b)将所述单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域； (c)将包括核糖体起始位点的非翻译区导入到所述双链寡核苷酸区域的5’端，其中所述非翻译区与具有和所述亲和标记物形成结合配对的能力的捕捉剂缔合；和 (d)使所述双链寡核苷酸区域进行转录和翻译事件以产生包括所述感兴趣的肽和所述亲和标记物的肽； 其中在步骤(d)中产生的蛋白在翻译后被所述构建体的所述捕捉剂捕捉，从而形成包括与编码所述肽的寡核苷酸缔合的所述肽的单独的构建体。
13.一种构建阵列的方法，所述方法包括以下的步骤 (a)提供包括表面的基底，在所述表面上缔合了两个或多个构建体，所述构建体包括编码感兴趣的肽和亲和标记物的单链寡核苷酸；(b)将第二通用寡核苷酸与所述构建体的所述寡核苷酸连接，其中所述通用寡核苷酸包括含核糖体结合位点的非翻译区； (C)将捕捉剂经由与所述第二寡核苷酸杂交与所述寡核苷酸连系； (d)将所述构建体的所述单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域；和 (e)使所述双链寡核苷酸进行转录和翻译事件以从所述双链寡核苷酸产生肽； 其中在步骤(e)中产生的蛋白被所述构建体的所述捕捉剂捕捉；且其中所得的阵列包括不连续的单元，所述不连续的单元包括与由核酸编码的所述肽缔合的所述核酸。
14.一种构建阵列的方法，所述方法包括以下的步骤 (a)提供包括两个或多个构建体的表面，所述构建体包括具有作为编码感兴趣的肽和 亲和标记物的序列的反向互补物的序列的单链寡核苷酸区域； (b)将所述单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域； (C)将包括核糖体起始位点的非翻译区导入到所述双链寡核苷酸区域的5’端，其中所述非翻译区与具有和所述亲和标记物形成结合配对的能力的捕捉剂缔合；和 (d)使所述双链寡核苷酸区域进行转录和翻译事件以产生包括所述感兴趣的肽和所述亲和标记物的肽； 其中在步骤(d)中产生的蛋白在翻译后被所述构建体的所述捕捉剂捕捉，从而形成包括与编码所述肽的寡核苷酸缔合的所述肽的单独的构建体。
15.一种构建阵列的方法，所述方法包括以下的步骤 (a)提供包括表面的基底，在所述表面上缔合了两个或多个构建体，所述构建体包括具有作为编码感兴趣的肽和亲和标记物的序列的反向互补物的序列的单链寡核苷酸； (b)将第二通用寡核苷酸与所述构建体的所述寡核苷酸连接，其中所述通用寡核苷酸包括含核糖体结合位点的非翻译区； (C)将捕捉剂经由与所述第二寡核苷酸杂交与所述寡核苷酸连系； (d)将所述构建体的所述单链寡核苷酸区域转化为双链寡核苷酸区域；和 (e)使所述双链寡核苷酸进行转录和翻译事件以从所述双链寡核苷酸产生肽； 其中在步骤(e)中产生的蛋白被所述构建体的所述捕捉剂捕捉；且其中所得的阵列包括不连续的单元，所述不连续的单元包括与由核酸编码的所述肽缔合的所述核酸。
16.—种鉴定与感兴趣的肽结合的剂的方法，所述方法包括 提供包括以下的阵列 具有表面的基底； 在所述基底的表面上缔合的两个或多个单独的构建体，其中所述 单独的构建体包括 (i)编码感兴趣的肽的寡核苷酸；和 (ii)所述感兴趣的妝； 其中所述寡核苷酸与所述基底表面缔合，且所述肽与所述寡核苷酸缔合； 使所述阵列暴露于剂；和 检测所述剂与所述感兴趣的肽的结合的存在或不存在。
17.如权利要求16所述的方法，其中在样品中提供所述剂，且其中与所述感兴趣的肽的结合的存在表明所述剂在样品中存在。
18.如权利要求16所述的方法，其中在样品中提供所述剂，且其中与所述感兴趣的肽的结合的不存在表明所述剂在样品中不存在。
19.一种鉴定与感兴趣的肽结合的剂的方法，所述方法包括 提供包括以下的阵列 具有表面的基底； 在所述基底的所述表面上缔合的两个或多个单独的构建体，其中所述单独的构建体包括 (i)寡核苷酸，所述寡核苷酸包括编码感兴趣的肽的区域、编码亲和标记物的区域和非翻译区； (ii)包括所述感兴趣的肽和亲和标记物的肽；和 (iii)与所述亲和标记物选择性地结合的捕捉剂； 其中所述寡核苷酸与所述基底表面缔合，且所述肽通过所述亲和标记物与所述捕捉剂的结合与所述寡核苷酸缔合； 使所述阵列暴露于剂；和 检测所述剂与所述感兴趣的肽的结合的存在或不存在。
20.如权利要求19所述的方法，其中在样品中提供所述剂，且其中与所述感兴趣的肽的结合的存在表明所述剂在样品中存在。
21.如权利要求19所述的方法，其中在样品中提供所述剂，且其中与所述感兴趣的肽的结合的不存在表明所述剂在样品中不存在。
22.一种用于构建阵列的方法，所述方法包括 a)在固体基底上合成一组已知序列的核酸序列； b)将一个或多个另外的核酸区域与所述固体基底上的所述核酸连系以提供所述基底上的延伸的核酸； c)利用所述延伸的核酸作为产生肽的模板进行体外转录和翻译；和 d)将所产生的肽连系到所述固体基底上的已知位置上。
23.如权利要求22所述的方法，其中将所述产生的肽与它们各自的核酸基底连系。
24.如权利要求22所述的方法，其中直接在所述固体基底上化学合成所述核酸。
25.如权利要求22所述的方法，其中步骤b)中所述的另外的核酸经由酶促连接来连系。
26.如权利要求22所述的方法，其中核酸的所述组包括所述基底上的至少1，000个核酸序列。
27.如权利要求26所述的方法，其中核酸的所述组包括所述基底上的至少5，000个核酸序列。
28.如权利要求27所述的方法，其中核酸的所述组包括所述基底上的至少10，000个核酸序列。
29.一种用于构建肽阵列的方法，所述方法包括 a)制造包括一组编码氨基酸序列的化学合成的寡核苷酸的核酸微阵列； b)将一个或多个另外的核酸区域与所述固体基底上的所述核酸连系以提供所述基底上的延伸的核酸；c)利用所述延伸的核酸作为用于产生肽的模板进行体外转录和翻译；和 d)将所产生的肽连 系到所述固体基底上。
30.如权利要求29所述的方法，其中将所述产生的肽与它们各自的核酸基底连系。
31.如权利要求29所述的方法，其中直接在所述固体基底上化学合成所述核酸。
32.如权利要求29所述的方法，其中步骤b)中的所述另外的核酸经由酶促连接而连系。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述微阵列包括至少1，000个核酸序列。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述微阵列包括至少5，000个核酸序列。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述微阵列包括至少10，000个核酸序列。
全文摘要
本发明提供阵列、构建阵列的方法和使用所述阵列的方法。本发明的阵列包括基底，所述基底具有任选地经由连接物分子在所述基底的表面上缔合的两个或多个不连续的构建体或不连续的构建体的组。所述构建体包括含编码感兴趣的肽的区域和亲和标记物和非翻译区的寡核苷酸、含感兴趣的肽和亲和标记物的融合肽以及与亲和标记物形成结合配对的捕捉剂。
文档编号G01N33/50GK102648294SQ201080055351
公开日2012年8月22日 申请日期2010年12月7日 优先权日2009年12月7日
发明者伊戈·A·科兹洛夫, 马克·S·奇 申请人:普罗格诺西斯生物科学公司