专利名称：一种检测植物中目标蛋白的方法及其专用spr生物传感器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测植物中目标蛋白的方法及其专用 SPR生物传感器。
背景技术：
随着转基因植物以及产品的安全性问题日益受到关注，建立准确、可靠、便捷的转基因检测技术和检测平台对转基因植物商品化的检测非常重要。表面等离子共振(Surface plasmon resonance, SPR)生物传感器是近年来国际上迅速发展的光学生物化学检测技术。 SPR生物传感器是将探针或配体固定于传感器芯片的金膜表面形成单分子层，当含有能与之作用的分析物的液体流经传感片表面时，分子间发生特异性结合并可引起传感片表面折射率的改变，通过检测SI^R信号改变而监测分子间的相互作用。SI^R生物传感器具有无需标记、灵敏准确、快速、能够实现在线连续以及高通量等检测特点，特别适合于生物分子之间相互作用，通过传感器芯片实时监测各类生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖和小分子信号物质之间相互作用的整个过程，并通过分析软件可以测定溶液中与固定相作用的物质的量。目前通过检测目标蛋白鉴定转基因植物的常用的方法是酶联免疫吸附法 (enzyme-linked immunosor-bent assay, ELISA)，ELISA 具备了醇反应的高灵敏度禾口抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速，费用低等特点。欧盟13个国家38个实验室用ELISA对转基因成分为2 %的RR大豆样品中的EPSPS进行检测，准确率高达99 %，检测限为0.35%。 但易出现本底过高的问题，缺乏标准化，且只能检测未加工产品，并且只能检测有限种类的转基因生物。Western blot是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，具有很高的灵敏性，但其操作较繁琐，费用较高，不适于快速、大量样品的检测。而SPR 检测在蛋白检测方面具有其独特的优势快速简便，实时检测，样品无需标记，高通量检测等优点，在转基因检测方面有相当大的发展潜力，目前通过sra方法检测转基因植物中是否含有目标蛋白的研究尚未见报道。例苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)毒蛋白基因是目前世界范围内使用最广泛的抗虫基因，Bt转基因抗虫棉在我国的栽植面积逐年增加，有数据显示，河北省今年栽植的棉花中90%为抗虫棉品种，然而抗虫棉可能会像其他的转基因作物一样带来一些问题，诸如昆虫抗虫性增强，天敌数量减少，基因漂流，生物多样性被破坏等等，因此，对Bt 转基因抗虫棉进行长期监测是非常必要的。据粗略统计，目前已经发现了 60群Bt杀虫晶体蛋白基因，根据它们杀虫范围和基因序列的同源性不同可粗分为六大类(CryI、CryII、CryIII、CryIV、CryV, Cyt)每一类中又可分为许多亚类，目前转入棉花的有CrylAc、CryIAb, CryIAc和CryIAb融合基因等几种对鳞翅目害虫有较强的抗性的Bt杀虫晶体蛋白基因。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种sra生物传感器在辅助检测生物目标蛋白中的应用。本发明提供了一种如下所述SPR生物传感器在辅助检测生物目标蛋白中的应用。所述生物为植物；所述目标蛋白为抗虫蛋白。所述植物为转入所述目标蛋白的编码基因的植物。所述抗虫蛋白为CrylAc蛋白。所述CrylAc蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。所述CrylAc蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。所述严格条件可为在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在68°C下杂交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。本发明的另一个目的是提供一种用于辅助检测待测生物中目标蛋白的sra生物传感器。本发明提供的一种用于辅助检测待测生物中目标蛋白的sra生物传感器，为将抗目标蛋白抗体以共价结合的方式偶联到传感芯片上，得到的sra生物传感器。所述抗目标蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；所述抗目标蛋白抗体具体为单克隆抗体；所述传感芯片为CM5芯片；所述目标蛋白为CrylAc蛋白；所述抗目标蛋白抗体为抗CrylAc蛋白的单克隆抗体；所述CrylAc蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述CrylAc蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。所述偶联包括如下步骤将所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体的溶液流经活化后的CM5芯片，使其与CM5芯片表面结合，得到SI3R生物传感器所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体的溶液为将抗CrylAc蛋白的单克隆抗体和pH 为4. 5、浓度为IOmM NaAc水溶液混合，得到的溶液，所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体在所述单克隆抗体的溶液中的浓度为50μ g/ml ；所述流经的流速为5 μ 1/min ；所述流经的时间为:3min。所述生物为植物，所述植物具体为棉花。上述应用为按照包括如下步骤的方法进行1)提取待测生物组织的总蛋白；2)将步骤1)得到的总蛋白采用包被有所述目标蛋白的抗体的SI^R生物传感器进行sra检测，以野生型植物作为对照，若所述待测生物与所述野生型植物的响应值的差值大于或等于40RU，则所述待测生物中含有目标蛋白，若所述待测生物与所述野生型植物的响应值的差值小于40RU，则所述待测生物中不含有目标蛋白。所述目标蛋白为CrylAc蛋白；所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体；所述抗体具体为CrylAc单抗。步骤1)中，所述提取方法包括如下步骤A、将待测生物的组织、提取液和PVPP混合，得到混合液；B、将步骤A得到的混合液离心，取上清液，得到总蛋白；每IL所述提取液为按照如下方法制备将8g NaCl、0. 2g KCl、1.44g Na2HPO4, 0. 24g KH2P04、0. 5ml Tween20和去离子水混合，得到提取液；步骤2)中，所述包被有所述目标蛋白的抗体的sra生物传感器按照如下方法制备将CrylAc单抗以共价结合的方式偶联到CM5芯片上，得到包被有所述目标蛋白的抗体的sra生物传感器。步骤1)的A中，所述提取液的pH为7. 4 ；所述混合时间为2小时；所述混合的温度为4°C ；所述待测生物的组织、提取液和PVPP的配比为Ig 4ml 0. Ig ；步骤1)的B中，所述离心速度为13000rpm，所述离心半径为82mm，所述离心温度为4°C，所述离心时间为20min ；步骤2)中，所述偶联的pH值为4.5 ；所述检测采用的进样流速为30 μ 1/min ；进样量为60 μ 1 ；进样种类为KINJECT ；所述检测温度为25°C ；所述生物为植物，所述植物具体为棉花；所述生物的组织为棉花的叶片；所述野生型植物为棉花DPM15。本发明的实验证明，本发明构建了包被CrylAc单抗的SI3R生物传感器，可以通过其来检测转基因棉花中是否含有CrylAc蛋白，其具有高灵敏度、高通量、自动化的优点，而且操作简单。
图1为CrylAc单抗偶联pH值的确定图2为CrylAc单抗偶联pH值的确定图3为棉花植物材料的培养图4为CrylAc基因的克隆和原核表达载体的构建图5为CrylAc-GST蛋白在五种宿主菌株中诱导表达情况分析图6为CrylAc-GST蛋白在BL21 (DE3)和Transetta (DE3)宿主菌株中诱导表达情况分析图7为CrylAc-GST蛋白在不同温度下的诱导表达情况分析图8为CrylAc-GST蛋白纯化过程SDS-PAGE分析图9为CrylAc-GST蛋白分子筛纯化色谱10为CrylAc-GST蛋白分子筛纯化后的SDS-PAGE分析图11为CrylAc-GST蛋白Weastern Blotting分析与试纸条检测图 12 为 CrylAc-GST 蛋白 SPR 检测图13为BSA蛋白SPR检测图14为棉花总蛋白提取SDS-PAGE分析图15为棉花总蛋白的SDS-PAGE分析图16为棉花总蛋白样品sra检测图17为棉花总蛋白试纸条检测
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、SI3R生物传感器的制备及验证将CrylAc单抗(Fitzgerald，10R-B122A。)偶联于芯片表面，通入待测样品，根据RU (响应值)的变化来确定样品中是否含有CrylAc蛋白，使用BIAcore 3000进行了相关的试验。CrylAc蛋白SI3R检测的原理使用基于表面等离子共振(SPR)原理设计的 BIAcore3000 (GE公司)来检测样品中是否含有Bt蛋白，选用的芯片为CM5芯片，其特点是在芯片表面覆盖了一层羧基化的葡聚糖，葡聚糖呈亲水性，具有非特异性结合低、高结合容量、易于进行共价结合、出色的化学稳定性等特点，是最常用的传感芯片。将CrylAc单抗以共价结合的方式偶联在羧基化处理的葡聚糖芯片表面作为配体(Iigand)，样品以恒定的流速和浓度流过芯片表面，如果待分析物(analyte)中的含有CrylAc蛋白，它将与偶联在芯片上的抗体互作，芯片表面物质的质量将发生改变，仪器记录下对应的响应值(RU)的改变；如果待分析物中没有CrylAc蛋白，仪器将不会有响应值的改变。一、sra生物传感器的制备1、CrylAc单抗偶联pH值的选择试验选用的是CM5芯片(GE公司，BR-1000-14)，在将CrylAc单抗偶联于芯片表面前，需进行最适PH值的筛选，具体操作如下将CrylAc单抗分别用pH = 5. 5，5. 0，4. 5，4. 0 的IOmM NaAc水溶液稀释至50 μ g/ml，分别进行结合分析，具体方法为CrylAc单抗用PBS 缓冲液(137mM NaCl,2. 7mM KClUOmM Na2HPO4,2mM KH2PO4,pH = 7. 4)溶解稀释至 lmg/ml， 取10 μ 1加入19(^1不同？!1值(pH值为4. 0、4. 5、5. 0、5. 5)的IOmM NaAc水溶液，每个pH 值的单抗溶液以20 μ 1/min的流速流经芯片表面，与芯片表面接触时间为120s，随即用PBS 缓冲液冲洗150s，再进下一个单抗溶液。结果如图1所示，pH = 4. 5时，CrylAc单抗结合到芯片上的量最大，响应值达到27566RU(响应值)，因此CrylAc单抗选用pH = 4. 5的IOmM NaAc进行稀释。2、CrylAc单抗的偶联偶联pH值确定后，下一步进行蛋白的偶联，偶联前需要活化芯片表面，试验采用 EDC/NHS活化(图2中的1)，活化完成后加入配体pH 4. 5的IOmM NaAc稀释的CrylAc单抗直至达到目标水平(图2中的2)，然后用乙醇胺封闭芯片表面多余的活化位点(图2中的3)。整个过程具体为以5 μ 1/min的流速注入按1 1 (ν/ν)混合的0. IM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和N-乙基-N' _( 二乙基-氨丙基)_碳二酰胺(EDC)活化液，活化芯片表面的葡聚糖，注入时间为7min ；取200 μ 1用pH = 4. 5的IOmM NaAc稀释得到浓度为50 μ g/ ml的CrylAc单抗，以5 μ 1/min的低流速流经芯片，与芯片表面活化的位点结合，直至达到预定的偶联水平；再用IM乙醇胺封闭芯片表面未结合抗体的活化位点，流速为5μ 1/min， 注入时间为7min。偶联的整个过程如图2所示，1为活化；2为配体偶联；3为封闭，可以看出，偶联水平约为8000RU(图2中的双向箭头所对应的纵坐标)，得到蛋白芯片。二、蛋白芯片的验证1、棉花植物材料的培养从孟山都公司购买野生型棉花DPM15种子和转基因棉花NuCOtn3;3B种子，温水(30°C左右)浸种他，在25°C下保温催芽12h，当种子露出白芽到芽长达种子长的1/2 时播入土中，在温室中25°C条件下培养一个月，得到野生型棉花DPM15和转基因棉花 Nucotn33B(见图 3)。2、CrylAc基因的克隆及原核表达载体的构建提取NuCOtn33B棉花叶片的基因组DNA，并以此为模板，用目标基因的特异性引物 BtFff和BtRV (表1)，采用高保真DNA聚合酶经过聚合酶链式反应(PCR)，扩增得到PCR产物，PCR扩增程序94°C for 3min，94°C for 30s，54°C for 30s, 72°C for45s,35 cycles ； 72°C for 5min ； 10°C for ever。结果如图 4 所示，得到 1780bp 片段。将该PCR产物送去测序，结果为该PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸， 与已报道的转CrylAc基因棉花中的CrylAc基因碱基序列(GenBank :Y09787)同源性达 96. 18 %。该PCR产物的基因即为CrylAc，其编码的蛋白为CrylAc (Bt蛋白的一种)，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。将PCR产物用限制性内切酶Bio I和Hind III酶切后回收片段，与经过同样酶切的原核表达载体PGEX-KG(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，MCV030)载体大片段连接，得到连接产物，转入大肠杆菌DH5 α中，得到转化子，提取转化子的质粒，该质粒为将序列表中序列1插入pGEX-KG的Bio I和Hind III酶切位点间得到的载体，将该质粒命名为 pGEX-KG-CrylAc。
表1为目标基因的特异性引物
权利要求
1.如下权利要求7-10中任一所述sra生物传感器在辅助检测生物中目标蛋白中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述生物为植物；所述目标蛋白为抗虫蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于 所述植物为转入所述目标蛋白的编码基因的植物。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于 所述抗虫蛋白为CrylAc蛋白。
5.根据权利要求1-4中任一所述的应用，其特征在于 所述CrylAc蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
6.根据权利要求1-5中任一所述的应用，其特征在于所述CrylAc蛋白的编码基因为如下1)或2)或3)所示的基因1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；3)与1)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
7.一种用于辅助检测待测生物中目标蛋白的sra生物传感器，为将抗目标蛋白抗体以共价结合的方式偶联到传感芯片上，得到SPR生物传感器。
8.根据权利要求7所述的生物传感器，其特征在于 所述抗目标蛋白抗体为单克隆抗体或多克隆抗体； 所述抗目标蛋白抗体具体为单克隆抗体；所述传感芯片为CM5芯片； 所述目标蛋白为CrylAc蛋白。
9.根据权利要求7或8所述的生物传感器，其特征在于 所述抗目标蛋白抗体为抗CrylAc蛋白的单克隆抗体； 所述CrylAc蛋白为如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
10.根据权利要求7-9中任一所述的生物传感器，其特征在于所述偶联包括如下步骤将所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体的溶液流经活化后的CM5 芯片，使其与cms芯片表面结合，得到sra生物传感器所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体的溶液为将抗CrylAc蛋白的单克隆抗体和pH为 4. 5、浓度为IOmM NaAc水溶液混合，得到的溶液，所述抗CrylAc蛋白的单克隆抗体在所述单克隆抗体的溶液中的浓度为50μ g/ml ； 所述流经的流速为5 μ 1/min ； 所述流经的时间为:3min ；所述生物为植物，所述植物具体为棉花。
全文摘要
本发明公开了一种检测植物中目标蛋白的方法及其专用SPR生物传感器。本发明提供的如下所述SPR生物传感器在辅助检测生物中是否含有目标蛋白中的应用。所述生物为植物，所述植物具体为棉花。所述目标蛋白为Cry1Ac蛋白；所述传感芯片为CM5芯片。本发明的实验证明，本发明构建了包被Cry1Ac单抗的SPR生物传感器，可以通过其来检测转基因棉花中是否含有Cry1Ac蛋白，其具有高灵敏度、高通量、自动化的优点，而且操作简单。
文档编号G01N33/68GK102156193SQ201110081230
公开日2011年8月17日 申请日期2011年3月31日 优先权日2011年3月31日
发明者何振艳, 徐文忠, 申红玲, 赵卓亚, 麻密 申请人:中国科学院植物研究所