专利名称：一种基于量子点的单病毒示踪方法
技术领域：
本发明涉及一种基于量子点的单病毒示踪方法，属于化学及生物医学领域。
背景技术：
病毒侵染宿主细胞的过程非常复杂，往往包含许多阶段、多种途径并涉及不同亚细胞结构。为了满足抗肿瘤药物的设计及基因治疗方面的发展，病毒侵染机制的研究非常重要。单病毒示踪技术是利用显微镜实时监控单个病毒或亚病毒结构在活细胞内的运动行为，研究病毒的侵染过程及病毒与亚细胞结构之间相互作用，进一步揭示未发现的生物机制的动态成像技术。近几年，单病毒示踪技术被广泛地应用于病毒侵染机制的研究领域， 成为监控病毒的侵染路径或病毒的组分与宿主细胞相互作用一个强有力的工具。但是，实现对病毒粒子的荧光标记成为进行单病毒示踪的首要条件。传统的荧光标记物存在易光漂、标记效率低等缺点，不能满足长时间、实时动态可视的示踪效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种可长时间、实时动态可视化的单病毒示
踪方法。为了实现长时间的单病毒示踪，本发明以量子点作为荧光标记物来标记病毒，利用带有在线培养装置的转盘式荧光共聚焦为成像仪器，通过两步法的标记策略，从而实现基于量子点的单病毒的长时间示踪。具体的技术方案包括如下步骤
1.利用生物素化的试剂盒，将病毒表面进行生物素化修饰； 2利用病毒与细胞表面受体结合的作用，将生物素化的病毒吸附到细胞表面；
3.利用链酶亲和素与生物素的相互作用，将链酶亲和素化的量子点标记到病毒表面；
4.利用带有在线培养装置的转盘式荧光共聚焦为成像仪器，对病毒在活细胞内的侵染行为进行监控。本发明利用一种简单高效的基于量子点的病毒标记策略，建立了一种基于量子点的长时间的单病毒示踪技术。量子点作为荧光标记物，具有独特又优越的光学性能，如消光系数大，量子产率高，激发光谱宽，发射光谱窄，亮度比传统的荧光染料高10-100倍，光稳定性比传统的荧光染料高100-1000倍等特点。该技术将成为各种病毒侵染机制的强有利工具。本发明可更广泛地应用于生物和医学科学等领域。
图1量子点标记病毒的流程示意图。图2在细胞表面量子点标记的病毒。(左图)细胞的微分干涉相差图片，(右图) 细胞表面量子点标记病毒的荧光照片。
图3 H9N2亚型禽流感病毒在活细胞的轨迹。图4 H9N2病毒的速度与时间的关系曲线，标尺20微米。
具体实施例方式
下面对量子点标记病毒的操作方法详细说明。1.将狗肾上皮细胞培养在共焦专用的培养小皿中，24h后可以用于实验。利用生物素化试剂Sulfo-NHS-LC-Biotin (Thermo),通过与H9N2禽流感病毒表面的氨基将生物素连接到病毒表面。具体操作如下取0.3mg生物素化试剂 Sulfo-NHS-LC-Biotin，加入到300 μ L (蛋白浓度为400 mg/ml)的纯化好的病毒溶液中， 室温摇床反应2h。多余的生物素化试剂利用NAP-5 (GE Healthcare)的脱盐柱除掉多余的生物素化试剂，获得体积为700 μ L标记好的病毒溶液。2.取100 μ L生物素化的病毒加入到细胞表面，4度孵育lOmin，用IX PBS缓冲溶液洗3次。3.再加入100 μ L浓度为InM的链霉亲和素化的量子点(SA_QDs，武汉珈源量子点有限公司)到细胞表面4度孵育lOmin，用PBS缓冲溶液洗3次。4.放在100X的共焦显微镜下进行观察，获得图2。5.用高斯滤波出去背景噪音。6.利用图像处理软件对单个病毒在每一帧运动位置进行获取，得到病毒的运动轨迹(图3)。将病毒每帧的运动速度与相对时间做曲线，得到图4。该技术可以有效地长时间的实现对病毒侵染机制的动态研究。
权利要求
1.一种基于量子点的单病毒示踪方法，其特征在于，包括如下步骤1)利用生物素化的试剂盒，将病毒表面进行生物素化修饰；2)利用病毒与细胞表面受体结合的作用，将生物素化的病毒吸附到细胞表面；3)利用链酶亲和素与生物素的相互作用，将链酶亲和素化的量子点标记到病毒表面；4)利用带有在线培养装置的转盘式荧光共聚焦为成像仪器，对病毒在活细胞内的侵染行为进行监控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的病毒为H9N2禽流感病毒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的细胞为狗肾上皮细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，对病毒表面进行生物素化修饰后，利用脱盐柱除掉多余的生物素化试剂。
全文摘要
本专利涉及一种基于量子点的单病毒示踪方法。该方法以量子点作为荧光标记物，通过生物素与链酶亲和素的相互作用，实现量子点对单个病毒的标记。通过实时动态的单颗粒成像技术，可以实现对单病毒侵染宿主细胞的侵染过程的全程示踪。该标记方法具有很高的标记效率，能够充分反映病毒在单个细胞内的群体动态侵染行为。结合量子点优异的光学性质，我们建立了一种多目标的，实时的，长时间的单分子示踪的方法，对全局地，高效地研究病毒侵染机制提供了强有力的工具。本发明可更广泛生物医学领域，用于研究囊膜及无囊膜病毒的侵染机制。
文档编号G01N33/58GK102445541SQ201110299128
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者刘书琳, 庞代文, 张志凌 申请人:武汉大学