专利名称：酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法
酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法技术领域
本发明属于生物传感领域，特别是涉及新型氨基酸离子液体改性的介孔碳复合材料固载酪氨酸酶的电化学传感器检测水体环境中酚类化合物的方法。
背景技术：
酚类化合物是环境中广泛存在的一类有机污染物，主要来自炼焦、医药、化工等工业排放及农药降解。饮用水源中的酚类化合物在加氯消毒的水处理工艺中可生成毒性更大、具有“三致”效应的氯酚等，从而威胁饮用水安全。
随着人们对水体环境安全及身体健康的日益关注，迫切需要快速判断地表水及饮用水源的安全状况。酚类化合物作为水体环境中的一类重要有机污染物，对人类和动植物有潜在的危害。为了预防酚类污染物的危害，发展用于环境(特别是饮用水、地表水和废水)中酚类污染物快速、灵敏、可靠、可重复使用的检测方法显得尤为重要。目前对环境中酚类污染物的筛查检测通常利用色谱和光谱等方法完成。然而这些仪器通常集中在某些远离现场的实验室，不仅仪器价格昂贵，而且通常需要专业的操作人员和复杂的样品预处理以及萃取步骤，很难满足水环境中酚类快速现场检测的要求。
本发明所使用的酶电化学传感器结合了酶和电化学的优点，总体来说，包括以下几个方面的优势1)、选择性好，酶分子对底物选择专一性强，具有非常高的特异性识别能力；2)、电化学响应快，灵敏度高；3)、成本低廉，可重复使用；4)、设备便携容易微型化，适合大批量样品的现场检测。
酪氨酸酶是一种具有生物催化活性的蛋白质，在生物体外容易失去活性，因此目前许多酪氨酸酶传感器普遍存在一个问题是操作和存储稳定性不够高。
本发明使用对酶分子生物相容性较好的固定基底(氨基酸离子液体改性的介孔碳复合材料)来提供一个有利的微环境以保持其生物活性和稳定性。介孔碳复合材料改善了单纯的介孔碳材料水相分散性差的问题，提高了实验操作的重现性。介孔碳材料的空间限制效应，能够防止酶分子的去折叠失活，提高了酶的长期稳定性和生物催化活性。同时氨基酸离子液体具有很好的生物相容性，为固载的酪氨酸酶分子提供了更加友好的微环境； 酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子运输，利于电化学换能，提高传感器的灵敏度；介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供转移的通道， 提高传感器的响应速度。此外，本发明使用的氨基酸离子液体对含苯环(通过η电子)和羟基(通过氢键)的酚类污染物具有较强的相互作用，可以通过富集效应进一步提高检测的灵敏度。
本发明提供了一种简易、快速而灵敏的水体环境中酚类化合物的检测方法，不仅提高了酪氨酸酶的存储稳定性，还具有更高的灵敏度和更低的检测限。仪器设备选择性好， 小型廉价，检测通量大，样品不需要前处理，适合水体样品的现场快速检测。酪氨酸酶传感器直接应用于水体环境样品的现场快速检测，达到经济、灵敏、准确和大批量检测的目的。发明内容
本发明的目的是提供一种基于三电极系统的酶电化学生物传感器及应用其检测水体环境中酚类化合物的方法，是能够用于现场筛查检测环境污染物、尤其是水体中酚类化合物的生物传感器检测方法。
本发明要解决的技术问题是提高酪氨酸酶电化学传感器的长期稳定性，并且提供一种应用于水体中酚类污染物筛查的基于酪氨酸酶电化学传感器的检测方法，应用其对酚类污染物检测。此检测方法应具有灵敏度高，检测限低，长期稳定性好，步骤简单，结果准确可靠，适合大批量样品现场检测的特点。
酪氨酸酶传感器检测酚类污染物的原理酪氨酸酶能够利用分子氧催化单酚(或多酚)生成相应的邻苯酚和邻苯醌，而邻苯醌又可以在电极表面通过电化学催化还原生成相应的邻苯酚形成信号循环放大。通过记录酪氨酸电化学传感器与酚类污染物作用前后的电信号变化可以判断目标分析物是否存在及其总量。对于单一的目标分析物，该酶基传感器的信号变化强度与目标分析物的浓度在一定范围内线性相关。对于水、土壤、食品、空气、 烟道气等复杂的目标样品，该酶基传感器能够快速筛查目标样品中是否含有酚类化合物。
本发明将酪氨酸酶分子诱陷到IOnm孔径的亲水介孔碳复合材料的介孔中。在液相中，亲水性的室温离子液体(BMM[Ala])与疏水性介孔碳材料混匀振荡半小时得到表面亲水改性的介孔碳离子液体复合材料。亲水性离子液体(BMIM[Ala)在液相中对介孔碳表面进行可控的 亲水改性，使离子液体在介孔碳表面形成近“单层”或多层的修饰，解决了介孔碳在水相中分散性差的问题；并且IOnm直径的介孔碳材料提供了“纳米笼”微环境(“空间限制效应”)固定酪氨酸酶分子(6. 5nmX9. 8nmX5. 5nm),空间限制效应能够防止酶分子去折叠失活，提高了酶在体外的长期稳定性和生物活性。同时酶分子与导电基底之间由于距离较近而减少了长程电子运输，利于电化学换能；介孔碳多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供通过的通道，提高传感器的响应速度和灵敏度。此外，本发明使用的亲水性离子液体(BMIM[Ala)对含苯环(通过π电子)和羟基(通过氢键)的酚类污染物具有较强的相互作用，可以通过富集效应进一步提高检测的灵敏度。
本发明检测的水体中酚类污染物通过电化学检测前后信号的变化，检测分析水体环境中酚类污染物的浓度。目标分析物为实际水体样品时，可以通过电化学分析检测确定样品中是否含有酚类污染物及其对应总浓度。
酪氨酸电化学传感器的制备与样品的检测过程可以分为以下四个步骤
I)介孔碳材料与室温离子液体(BMM[Ala])在室温下超声震荡30分钟。
2)将酪氨酸酶加入到离子液体修饰介孔碳材料的液相溶液中，4°C低温振荡一小时。
3)成膜能力和粘着力极好的生物相容性壳聚糖加入到酶分子和介孔碳形成的超分子组装体溶液中，取4μ L的上述溶液滴加到打磨处理干净的玻碳电极表面。
4)将待检测的酚类污染物水溶液滴加到检测缓冲溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号。
本发明使用电流信号升高的强度检测分析酚类化合物浓度Ia为修饰后玻碳电极在空白缓冲溶液中扫描的电流，即背景溶液扫描的电流；ib为酚类污染物溶液滴加到检测缓冲溶液后扫描的电流为酚类污染物溶液处理前后电流信号变化量。电流信号变化公式如下
w = Ib-Ia
所述的离子液体在水相中对介孔碳表面进行可控的亲水改性，使离子液体在介孔碳表面形成近“单层”或多层的修饰；酪氨酸酶被诱陷到离子液体亲水改性的介孔碳材料中，利用介孔的“空间限制”效应，防止酶分子的去折叠失活；氨基酸离子液体中的氨基酸为酪氨酸酶分子提供了更加友好的微环境，提高了酪氨酸酶分子的长期稳定性。
本发明采用一种高灵敏度、高选择性、低检测限、可靠便携、具有长期的操作和存储稳定性的酪氨酸酶生物传感器，进行水体环境中酚类化合物的检测。
相对于现有技术，本发明具有如下优点
I、步骤简单，稳定性好，结果准确可靠。酪氨酸电化学传感器对水体环境样品中酚类污染物的检测不需要复杂的样品预处理，简化了操作步骤；亲水性氨基酸离子液体改性的介孔碳材料作为固定基底，介孔碳提供了一个“纳米笼”微环境(空间限制效应)防止酶分子的去折叠失活，亲水性氨基酸离子液体的生物相容性特征为酶分子提供了更加友好的微环境，极大提高了酶分子的长期稳定性和生物催化活性。
2、灵敏度高，检测限低。酶分子与导电基底之间由于距离近从而缩短了电子传输距离，利于电化学换能；介孔碳材料多孔的网络骨架结构还可以为酶反应的底物和产物提供通畅的通道，提高传感器的响应速度和灵敏度；此外生物相容性室温离子液体对含苯环 (通过η电子)和羟基(通过氢键)的酚类化合物具有非常强的相互作用，可以通过富集效应进一步提闻检测的灵敏度。
3、便捷容易微型化、快速高通量筛查酚类污染物。检测设备由一个微型化的电化学工作站、一个三电极体系以及一个检测池组成，设备简单，易于携带，适合野外现场检测。 可以用来检测实际水体样品中是否含有酚类污染物。
图I为本发明方法中酪氨酸酶电化学传感器组装过程示意图。
图2A)为本发明合成的IOnm直径的二氧化硅球透射电镜(TEM)图，B)为IOnm孔径的介孔碳TEM图。
图3A)为IOnm介孔碳的扫描电镜(SEM)图，B)为氨基酸离子液体改性修饰的介孔碳复合材料的SEM图。
图4为本发明方法实施例I中监测酪氨酸酶与玻碳电极组装过程，图中a为未修饰的玻碳电极在50mmol L-1 PBS缓冲溶液中的循环伏安(CV)曲线,b酪氨酸酶修饰的玻碳电极的CV曲线。
图5A)为酪氨酸酶修饰电极在PBS溶液中不同扫速下扫描曲线，自上到下为100、 90、80、70、60、50、40、30、20、10mV/s ；B)为扫描速度与电信号线性相关曲线。
图6A)为本发明方法实施例2的儿茶酚、苯酚和壬基酚浓度与电信号关系的曲线； B)为浓度与电流信号线性相关曲线。
具体实施方式
本发明所述的生物传感器检测装置包括工作电极、辅助电极、参比电极、检测池和电化学工作站；具体操作步骤将亲水性离子液体(例如，I- 丁基-3-甲基咪唑丙氨酸， BMIMtAla])加入介孔碳溶液中，振荡半小时，得到新型的介孔碳和亲水性离子液体的复合材料；将酪氨酸酶加入到介孔碳和亲水性离子液体的复合材料溶液中，振荡一小时，滴加到工作电极表面得到固载酪氨酸酶的工作电极；将固载酪氨酸酶的工作电极、辅助电极和参比电极插入到盛有磷酸缓冲液的检测池中，在搅拌的条件下加入酚类化合物的单一标准品，即产生了相应的电流响应信号。与现有的检测酚类污染物的生物传感器相比，该方法主要优点是1.灵敏度高，介孔碳离子液体复合材料大大提高了工作电极的导电性，增大了响应电流；2.选择性好，酪氨酸酶对酚类化合物等底物有很好的选择性；3.性能稳定，酶分子与介孔碳孔径大小相匹配，空间限制效应防止酶分子四级结构改变而失活；生物相容性离子液体对介孔碳改性，提高了酶的活性及长期稳定性；4.仪器设备小型廉价，检测通量大，样品前处理简单，适合现场快速筛查检测。此方法不但可以对苯酚等单一酚类样品进行定量检测，而且可以快速筛查实际样品中是否含有酚类化合物，并对实际样品中酚类化合物总量进行评估。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下是部分本发明实施例中所用的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。
红外光谱所用仪器为傅立叶变换红外光谱仪(Spectrum GX, Perkin-Elmer, USA)。红外光谱测量条件光源为紫外和可见灯，扫描范围为^OlOOOcnT1。电化学检测所用仪器为上海辰华电化学工作站CHI440，三电极体系。酪氨酸酶(菌菇)购于 Sigma-aldrich (China)。
实施例I.酪氨酸酶电化学生物传感器组装
玻碳电极组装步骤
I)直径为O. 3cm的玻碳电极用粒径分别为I μ m、O. 3 μ m、O. 05 μ m的三氧化二铝粉末抛光，然后在去离子水中超声清洗3次，每次2分钟。放入2mmo I L—1的铁氰化钾溶液中在-O. 1-0. 6V之间扫描循环伏安曲线。该曲线氧化还原峰电位差小于75mV,说明玻碳电极表面的铁氰化钾反应属于完全可逆反应，电极表面没有杂质。
2)酪氨酸酶介孔碳材料的超分子自组装体的构建。利用溶胶-凝胶法制备的单分散硅胶球作为硬模板，以聚苯乙烯为碳源，经氮气气氛下的高温催化碳化，去除模板等步骤后，获得一定孔径的有序介孔碳。具体合成步骤=IOOmL的三颈烧瓶中加入O. 0292g L-Iys, 27. SmL去离子水以及4mL的正硅酸乙酯，体系在70°C下磁力搅拌反应12小时，于80°C缓慢蒸干溶剂得到IOnm纳米硅球。在石英研钵中研细上述硅球，然后向硅球中加入3mL O. 024g mL—1的Ni (NO3)2 · 6H20的乙醇水溶液(Vill V水=1:1)，最终使Ni与Si的摩尔比为 I 34。然后将浸溃过Ni (NO3)2 ·6Η20的SiO2模板在80°C烘箱中干燥后在红外压片机上压成后Imm的薄片(压力6Mpa)。向IOmL新鲜蒸懼的苯乙烯单体中滴加O. 05mL浓硫酸,使苯乙烯初步聚合；取Ig浸溃Ni (NO3)2的SiO2模板于25mL坩埚中，加入5mL初步聚合的苯乙烯，160°C预碳化24h，然后将Si02/C的复合物移入管式炉中，高纯氮气保护下升温至850°C 热解3h，升温速率5°C /min。热解结束后将复合物冷却至室温，在20% HF溶液中搅拌12h 除去SiO2，过滤、洗涤后干燥，得到孔径为IOnm的介孔碳。通过调整正硅酸乙酯的浓度和反应时间，可以得到不同粒径的硅球。以不同粒径的硅球为模板，最终制得不同粒径的介孔碳。将合成的介孔碳材料加入到等体积的相同质量浓度的BMIM[Ala]的水溶液中，超声震荡30分钟，利用含咪唑阳离子的氨基酸离子液体与介孔碳之间固有的强相互作用(包括咪唑阳离子与介孔碳电子间的强相互作用、氢键、亲疏水、静电作用等)，在液相中对介孔碳表面进行可控的亲水改性，使其在介孔碳表面形成近单层或多层修饰，可以获得离子液体功能化的介孔碳复合材料。20 μ L O. 8mg ι Γ1水溶性的改性有序介孔碳溶液中加入10 μ L酪氨酸酶溶液(IOmg低温振荡I小时，通过液相自组装将酶分子诱陷到介孔碳的介孔中形成超分子自组装体(O. 4mg ml/1介孔碳、O. 4mg mL_1BMIM[Ala]以及5mg ml/1酪氨酸酶)。
3) 10 μ L成膜能力和粘着力极好的生物相容性壳聚糖(6mg ml/1)加入到30 μ L超分子自组装体中辅助固载，4yL上述溶液加入到玻碳电极表面，室温下(25°C)干燥2小时，得到均一性薄膜。
4)将修饰后的玻碳电极放入50mmo I Γ1 PBS溶液中搅拌15分钟，去除表面吸附力弱的酶分子，在50mmo I Γ1 PBS溶液中以 10、20、30、40、50、60、70、80、90、IOOmV s-1 十个不同的扫速扫描，得出扫描速度与信号强度成线性相关，此反应属于电极表面控制反应。
5)将氨基酸离子液体修饰介孔碳复合材料固定的酪氨酸酶电极与介孔碳固定的酪氨酸酶电极放入磷酸缓冲溶液中进行电化学循环伏安扫描，得到循环伏安曲线a和b ;放置3周以后,在50mmol L—1 PBS中对介孔碳复合材料固定的酪氨酸酶电极与介孔碳固定的酪氨酸酶电极进行电化学循环伏安扫描，得到循环伏安曲线c和d ;分别计算两根修饰电极的循环伏安曲线峰电流的下降百分比(a_c/a*100%和b_d/b*100% )，得到介孔碳复合材料固定的酪氨酸酶电极在放置三周后仅仅下降了 2%，然而介孔碳固定的酪氨酸酶电极在放置三周后峰电流下降了 11%。说明了氨基酸离子液体改善了介孔碳材料的生物相容性， 提高了酪氨酸酶分子的长期稳定性。
实施例2.酪氨酸酶电化学生物传感器检测儿茶酚、苯酚及壬基酚的标准溶液
分别将儿茶酚、苯酚和壬基酚溶于乙腈溶液中，配成Immol Γ1的标准溶液。
采用上海辰华电化学工作站(Chi 440B)在-O. IV恒电位条件下扫描电流与时间的曲线，以40s为间隔向8mL 50mmol L—1磷酸缓冲溶液中滴加4μ L lmmol L—1的儿茶酚标准溶液，得到电流信号与时间之间的相关曲线。将酪氨酸酶电化学传感器在空白检测溶液 (50mmol L—1磷酸缓冲液)中扫描记录的响应信号记为Ia，将儿茶酚标准溶液加入空白检测溶液中得到的响应信号记录为Ib;以儿茶酚浓度(c)为横坐标，其对应产生的电流信号强度(Ib-Ia)为纵坐标，绘制出儿茶酚浓度与电流信号强度的线性相关曲线；从图6中可以看出，随着儿茶酚浓度的升高，电流信号逐步增强，信号变化强度与儿茶酚的浓度成线性相关。
儿茶酚作为酪氨酸酶的天然底物，在氧气存在情况下，酪氨酸酶催化儿茶酚生成相应的醌类化合物，而醌类化合物又可以在电极表面通过电化学催化还原生成儿茶酚，形成信号循环放大。随着儿茶酚浓度的升高，电流信号逐步增强，电流信号的增加量与儿茶酚的浓度在一定范围内线性相关。苯酚和壬基酚采用与儿茶酚相同的实验检测过程进行检测。结果显示酪氨酸酶电化学生物传感器对苯酚和壬基酚产生了比天然底物(儿茶酚)弱的电流信号。随着苯酚和壬基酚浓度的升高，电流信号强度逐步增加。酪氨酸酶电化学生物传感器对儿茶酚、苯酚和壬基酚等酚类污染物都可以产生明显的电化学响应信号变化，因此可以用来检测样品中是否含有儿茶酚、苯酚、壬基酚等酚类污染物。通过检测酪氨酸酶电化学传感器的电流上升量(Ib-Ia)来确定检测样品中是否含有酚类化合物；当电流上升量(Ib-Ia)大于O. 13微安时(三倍信噪比)被认为含有酚类化合物；当电流上升量(Ib-Ia) 小于O. 13时，被认为不含有酚类化合物；将电流上升量(Ib-Ia)带入绘制的苯酚线性相关曲线(图6)中，通过对比可以得到检测样品中总的酚类化合物的浓度相对于苯酚的浓度。
实施例3.酪氨酸酶电化学生物传感器潜在干扰物的检测
将下列化合物溶于乙腈中，配成IOOmmol Γ1的溶液，用酪氨酸酶电化学生物传感器记录电信号变化；检测化合物分别为酒石酸、柠檬酸钠、草酸钠、尿素、乙酸乙酯、碳酸二乙酯以及葡萄糖等。上述化合物的检测过程与儿茶酚检测过程相同。
乙酸乙酯等化合物不是酪氨酸酶的特异性底物，产生的电流信号变化强度(W)小于O. 13微安(三倍信噪比)，即没有检出。儿茶酚等酚类化合物作为酪氨酸酶的反应底物， 引起了酪氨酸酶电化学生物传感器的电化学响应信号变化量远远大于O. 13微安，即明显检出；因此可以使用酪氨酸酶电化学传感器检测环境中存在的酚类污染物；并且可以通过电化学信号变化强度的大小，来检测分析待测溶液中酚类污染物的浓度。
酪氨酸酶电化学生物传感器能够明显的区别干扰物和酚类化合物的响应信号，因此可以用来检测分析大批量的环境样品。酪氨酸酶电化学生物传感器不但可以实现对单一酚类样品的定量检测，而且可以实现对复杂样品的快速检测以及总的酚类化合物的含量检测分析，此外该传感器检测方法还具有色谱方法所不具备的一些优势(例如，快速、便携、 廉价、不需要复杂样品的预处理和萃取步骤等)。酪氨酸酶电化学生物传感器为环境中酚类污染物的快速现场检测分析提供了一个有力的支持。
权利要求
1.酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法，其基于三电极系统，该方法包括以下步骤a).有序介孔碳材料的制备取l-5g直径为5-50nm的纳米硅球(SiO2)，随后向SiO2中加入3mL0. 024g mL—1的 Ni (NO3)2 · 6H20的乙醇水溶液(V [醇:V水=I : I);浸溃过Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2在烘箱中干燥，然后将干燥后的SiO2在压片机上压成薄片；向IOmL苯乙烯单体中加入150 μ L浓硫酸(质量浓度98% )酸化处理10-30分钟；将 IOmL酸化后的苯乙烯滴加至Ij l_5g浸溃过Ni (NO3)2 · 6H20的SiO2薄片上，120-200°C下反应，然后将苯乙烯和SiO2的复合物移入管式炉中，在高纯惰性气体(氮气或氩气等气体)保护下升温至750-950°C热解2-5h ;将热解产物加入质量浓度为15-30% HF溶液中搅拌去除 SiO2模板，过滤得到孔径为5-50nm的介孔碳；b).有序介孔碳的表面改性和功能化将O. 2-0. 8mg介孔碳材料加入到ImL O. 56mg mL—1亲水性离子液体中超声振荡；利用含咪唑阳离子的亲水离子液体与介孔碳之间固有的强相互作用，使离子液体在介孔碳表面形成近单层或多层修饰，可以获得亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料；c).酶生物传感器的构建在亲水性离子液体功能化的介孔碳复合材料溶液中加入等体积的2. 5-20mg ml/1的酶溶液，4°C低温振荡O. 5-3小时，通过介孔材料的虹吸作用将酶分子诱陷到介孔碳的介孔中形成超分子自组装体，然后取3-10 μ L的超分子自组装体溶液滴加到电极表面，得到酶修饰电极；d).将c)中所述的酶修饰电极作为工作电极放入空白检测溶液(SOmmoir1磷酸缓冲液)中，进行电化学扫描并记录响应信号Ia，将酚类化合物作为目标分析物加入到空白检测溶液中，进行电化学扫描并记录响应信号Ib ;随着加入酚类目标物浓度的升高，酶生物传感器产生的电流信号逐渐增强，并且在O.5-10 μ mo I I/1范围内线性相关；以酚类目标分析物浓度(c)为横坐标，其对应产生的电流信号强度(Ib-Ia)为纵坐标，绘制出酚类目标物浓度与电流信号强度的线性相关曲线；e).将含有酚类化合物的检测样品加入到c)中所述的酶修饰电极的空白检测溶液中， 进行电化学扫描并记录响应信号Ib，并将其产生的电流上升量(Ib-Ia)带入线性相关曲线中就可以评估出检测样品中酚类化合物的浓度。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于所采用的电化学装置的参比电极为银/氯化银电极，对电极为钼丝电极，工作电极是玻碳电极、金电极、钼电极或碳糊电极，优选玻碳电极。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述的酶为反应底物为酚类化合物的酶，为酪氨酸酶或漆酶，优选酪氨酸酶；步骤I. d)所述的目标分析物酚类化合物包括儿茶酚、苯酚、壬基酚和双酚A中的一种或多种。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于5-50nm直径的纳米硅球的制备过程将O. 2mmoL赖氨酸和4mL正硅酸乙酯加入30mL水溶液中，在50-901温度范围内磁力搅拌反应；反应完成后，80-100 0C缓慢蒸干溶剂，即得到5-50nm直径的纳米硅球。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(a)所述的介孔碳孔径大小为550nm， 优选10nm。
6.如权利要求I)所述的方法，其特征在于步骤(b)所述的超分子组装体中的介孔碳疏水内表面由生物相容性亲水离子液体修饰；所述的亲水性离子液体阳离子通常是咪唑基团，阴离子基团通常是四氟硼或者氨基酸等，优选I-丁基-3-甲基咪唑丙氨酸离子液体(BMM[Ala])。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于所述的检测样品通过酶电化学传感器检测的电流上升量(Ib-Ia)来确定检测样品中是否含有酚类化合物；当电流上升量(Ib-Ia)大于O. 13微安时(三倍信噪比)被认为含有酚类化合物；当电流上升量(Ib-Ia)小于O. 13时，被认为不含有酚类化合物；将电流上升量 (Ib-Ia)带入Id)中绘制的酚类目标物线性相关曲线，通过对比可以得到检测样品中酚类化合物的浓度。
8.如权利要求I所述的方法，其特征在于将步骤c)中所述形成超分子自组装体进行如下操作，10 μ L 6mg mL-1壳聚糖加入到30 μ L超分子自组装体中辅助固载，然后取 3-10 μ L的超分子自组装体溶液滴加到电极表面，得到酶修饰电极。
全文摘要
本发明涉及酶电化学生物传感器检测水体环境中酚类化合物的方法。所述生物传感器检测装置包括工作电极、辅助电极、参比电极、检测池和电化学工作站；具体操作步骤将亲水性离子液体(例如，1-丁基-3-甲基咪唑丙氨酸，BMIM[Ala])加入介孔碳溶液中，振荡半小时，得到新型的介孔碳和亲水性离子液体的复合材料；将酪氨酸酶加入到介孔碳和亲水性离子液体的复合材料溶液中，振荡一小时，滴加到工作电极表面得到固载酪氨酸酶的工作电极；将固载酪氨酸酶的工作电极、辅助电极和参比电极插入到盛有磷酸缓冲液的检测池中，在搅拌的条件下加入酚类化合物的单一标准品，即产生了相应的电流响应信号。
文档编号G01N27/327GK102928488SQ201110377608
公开日2013年2月13日 申请日期2011年11月24日 优先权日2011年11月24日
发明者吴立冬, 卢宪波, 苏凡, 陈吉平 申请人:中国科学院大连化学物理研究所