专利名称：一种动物狂犬病中和抗体elisa检测试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体地，涉及一种用间接酶联免疫吸附方法(ELISA)检测动物狂犬病中和抗体的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)感染引起的人畜共患的急性高度致死性传染病，广泛流行于世界各地，据世界卫生组织(WHO)最新的不完全统计资料报道，全世界每年约有5. 5万人死于狂犬病，我国每年的死亡人数位列世界第二位，且最近几年死亡人数居高不下。而正是狂犬病病毒在动物之间的传播流行直接导致了人狂犬病的流行，预防人得狂犬病，首先应当控制和消灭动物得狂犬病，即消灭传染源。因此要从根本上预防狂犬病的发生，控制和消灭狂犬病必须对犬和野生动物实行全面的综合预防措施。研究表明狂犬病的控制，最积极有效的措施就是加强犬的免疫。疫苗接种后，并不是所有动物都会产生免疫反应，产生抗狂犬病毒抗体。只有经过检测，产生了达到保护水平的狂犬病毒抗体的动物才能确保不发生狂犬病。评价狂犬病疫苗的免疫效果，主要以免疫后出现抗狂犬病毒抗体为指标，尤其抗体出现的时间、水平和持续时间更为重要。因此应该在接种疫苗后一个月，进行狂犬病毒抗体检测，如果不能产生保护性狂犬病毒抗体，就应该重新或加强免疫，确保免疫效果。WHO狂犬病专家委员会推荐小鼠中和实验(MNT)和快速荧光灶抑制实验(RFFIT)作为检测狂犬病毒(RV)中和抗体的两项基本方法，并为其它方法的基准和参考。但是，无论是MNT法还是RFFIT法，分别需要21d 和2d以上的实验观察时间，需要组织细胞培养和昂贵的荧光显微镜来配合使用，进行试验结果的判断。荧光抗体病毒中和试验(FAVN)操作繁琐，对操作者操作技能要求高，且存在生物安全和人为判断误差的问题。ELISA是一种基于抗原抗体特异性反应的检测方法，其优点是敏感、特异、安全、操作简单快速，在很多疾病的临床诊断与流行病学调查等方面得到了广泛的应用，适用于大批量标本的检测，是较为理想的病原或抗体检测方法。ELISA检测方法对包被抗原的纯度要求较高，现有技术中纯化狂犬病毒的方法主要有离子交换层析纯化法、凝胶(分子筛)层析纯化法等，其不足之处是抗原纯度较低，且操作复杂，不利于保持生物大分子活性和节约成本，因此寻找一种经济、简便、高效纯化狂犬病病毒的方法成为制备检测狂犬病中和抗体 ELISA试剂盒的迫切需要。法国Synbiotics公司生产的狂犬病抗体检测试剂盒是世界动物卫生组织(OIE) 唯一推荐的ELISA检测试剂盒，但该试剂盒价格昂贵，为8800元人民币，导致检测成本高不利于推广使用。开发一种可以快速准确，成本较低的ELISA检测方法测定狂犬病中和抗体具有重要的实际应用价值，且对于构建动物防疫监测体系和保障公共卫生安全意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供检测动物狂犬病中和抗体间接ELISA检测试剂盒及其应用。
本发明试剂盒酶标板的包被抗原为狂犬病病毒全病毒颗粒，该抗原是采用微载体悬浮培养的狂犬病毒收获液经过超滤、澄清、灭活、线性蔗糖梯度区带离心纯化后得到的。本发明使用的狂犬病病毒为狂犬病毒固定毒(CTN-1株)，在Vero细胞上培养、扩增，经超滤、澄清、线性蔗糖梯度区带离心浓缩提取，包括以下步骤1)微载体上Vero细胞长成单层后，按0. 03 0. 3感染复数的比例接种狂犬病毒， 在温度32 36°C、转速20 80r/min、pH 7. 20 7. 80、溶氧20% 70%、添加0. 05% 5%牛血清白蛋白的199培养基的条件下培养，培养4-6日后开始收获上清液至细胞完全脱落为止；2)将病毒收获液用0. 1 0.45 μ m滤芯过滤澄清后，用100KD 300KD膜包，超滤浓缩；3)向狂犬病毒浓缩液中加入β-丙内酯，在2 8°C条件下灭活，37°C水解；4)狂犬病毒灭活液用线性蔗糖梯度进行区带离心，4°C，20000 50000r/min ；离心1 5小时，离心后泵入60%蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒离心液用截留分子量为100KD 300KD膜包超滤浓缩，PBS溶液透析脱糖，得到狂犬病毒纯化液。本发明试剂盒还包括酶标二抗、样品稀释液、标准血清、阳性血清、阴性血清、显色剂、终止液和洗涤液。本发明使用的酶标抗体为辣根过氧化物酶记羊抗犬IgG抗体；标准血清的制备是将狂犬病病毒灭活抗原三针免疫程序接种比格犬，当血清效价高于6. 0IU/ml时，1周后采血分离血清，56°C灭活30分钟；本发明试剂盒所用的阳性血清为狂犬病病毒CTN-I株灭活抗原免疫犬后获得的血清，测定血清狂犬病毒抗体水平；所述阴性血清为未感染狂犬病病毒且未免疫过狂犬病疫苗的健康犬血清。当标记酶为辣根过氧化物酶时，本发明试剂盒所用的显色剂由底物A液和底物B 液组成，底物A液含有柠檬酸钠、双氧水等，底物B液为TMB ；终止液为2mol/L硫酸溶液；所述洗涤液为含有的Tween-20的PBS缓冲液。一种制备本发明试剂盒的方法，包括1)狂犬病病毒灭活后，用线性蔗糖梯度区带离心纯化，纯化的狂犬病全病毒颗粒与包被缓冲液配成合适浓度，包被酶标板；2)辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG，获得酶标二抗；3)狂犬病抗体检测阴阳性对照血清的制备，按常规方法制备狂犬病抗体检测阴性对照血清、狂犬病抗体检测阳性对照血清和狂犬病抗体标准血清；4)配制试剂，按配方配制封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、终止液；5)试剂盒组装，将纯化的狂犬病全病毒颗粒包被的酶标板、酶标二抗、狂犬病抗体检测阴阳性对照血清、标准血清及封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、终止液按试剂盒配制定量分装。其中步骤1)所述的纯化狂犬病全病毒的包被浓度为2 μ g/ml。本发明还提供了该试剂盒在检测动物狂犬病病毒中和抗体中的应用。采用狂犬病毒全病毒颗粒包被酶标板，以中和抗体效价分别为0.04IU/ml， 0. 02IU/ml，0. 01IU/ml，0. 005IU/ml，0. 0025IU/ml，0. 00125IU/ml,0. 000625IU/ml 的血清作为标准，使用标准血清和待检血清分别与包被抗原反应后，加入辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG抗体，反应结束显色后根据OD值和标准血清中和抗体效价，计算待检血清的中和抗体效价，从而定量确定动物的狂犬病疫苗免疫水平。本发明提供的试剂盒利用辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG抗体、标准血清和包被抗原，能够简单快速准确定量的检测犬血清中的狂犬病中和抗体。经各项标准验证，该试剂盒表现为具有良好的特异性，较高的敏感性，较好的重复性和稳定性，其中对阴性血清检测符合率为100%，对目标动物的其他常见疾病血清抗体不具有交叉反应。敏感性的灵敏度最低检出限量为0. 0625IU/ml，试剂盒检测的重复性好，变异系数CV为2. 74%，37°C放置14 天和2 8°C放置390天后，试剂盒敏感性和特异性检测结果均符合试剂盒质量标准，能准确快速地检测狂犬病抗体水平，避免假阴性结果的出现，且由于纯化方法先进，所以成本相对于其他检测方法降低很多，适用于大批量标本的检测。本发明对狂犬病病毒使用线性蔗糖梯度区带离心纯化方法，其中杂蛋白Vero细胞宿主蛋白残留量比其他厂家的显著降低约3000ng/ml左右，说明此方法纯化的抗原纯度高于其他方法。本发明试剂盒与世界卫生组织唯一推荐的ELISA检测试剂盒(法国Synbiotics公司)进行对比试验，结果说明两个试剂盒的检测结果无明显差异，但本发明试剂盒的成本比后者低一半左右。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。MEM培养基、水解乳蛋白为GIBCO公司产品，新生牛血清为兰州民海生物公司产品，199培养基为SIGMA公司产品，胰蛋白酶为DIFCO公司产品，谷氨酰胺为^witrogen公司产品，微载体Cytodexl为Amersham公司产品，培养瓶为Corning/Greiner公司产品， 100KD 300KD膜包为Pall公司产品。实施例1试剂盒的制备包被抗原的制备和包被采用微载体悬浮培养技术，进行Vero细胞培养，待细胞长成单层，按照一定比例接种狂犬病毒CTN-I株病毒，购自中国药品生物制品检定所，进行培养和收获病毒液。线性蔗糖梯度区带离心浓缩提取纯化病毒液包括以下步骤1)微载体上Vero细胞长成单层后，按0. 03感染复数(Μ. 0. I)的比例接种狂犬病毒，在温度33 °C、转速40r/min、pH 7. 6、溶氧50 %、添加0. 05 %牛血清白蛋白的199培养基为培养基条件下培养，培养4-6日后开始收获上清液至细胞完全脱落为止；2)将病毒收获液用0. 45 μ m滤芯过滤澄清后，用300KD膜包超滤浓缩；3)向狂犬病毒浓缩液中加入β-丙内酯，在4°C条件下灭活，37°C水解；4)狂犬病毒灭活液用线性蔗糖梯度进行区带离心，4°C，25000r/min ；离心2. 5小时，离心后泵入蔗糖顶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒离心液用截留分子量为 100KD膜包超滤浓缩，PBS溶液透析脱糖，得到狂犬病毒纯化液。包被时用包被稀释液将病毒稀释成总蛋白浓度为2 μ g/ml，每孔IOOul加入96孔酶标板，4 °C过夜。1.酶标板的封闭和保存上述包被的酶标板取出后，用PBST(含0. 05% Tween20的0.01mol/L、pH 7. 4PBS)洗涤3次，甩干。每孔加入封闭液(蔗糖0. 05g/ml Jroclin-300 0.1%, BSA 0.028/1111，卩85)200111，371孵育2小时。用PBST洗涤2次，风干。采用铝箔袋
真空封口，4°C保存。2.阳性血清的制备狂犬病毒中和抗体为阴性的3只比格犬，人工免疫狂犬病毒灭活抗原，采用两针免疫程序(0天，14天)接种比格犬，每次1头份/只，疫苗接种后21天试血，血清效价高于2. 0IU/ml时，于疫苗接种后28天采血分离血清。将犬血清混合后56°C 灭活30min，制备狂犬病毒阳性血清作为试剂盒中阳性血清。3.阴性血清的制备上述阴性比格犬，在免疫前采血，分离血清。4.标准血清的制备使用狂犬病毒中和抗体为阴性的4只比格犬，人工免疫狂犬病毒灭活抗原，采用三针免疫程序(O天，14天，60天)接种比格犬，每次1头份/只，疫苗接种后67天试血，血清效价高于6.0IU/ml时，于疫苗接种后74天采血分离血清。将犬血清混合后56°C灭活30min，制备狂犬病毒抗体标准血清作为试剂盒中标准血清。5.洗涤液(20XPBST)的配制使用去离子水配制，各组分终浓度至NaCl 0. 16g/ ml, KH2PO4 0. 004g/ml、KCl 0. 004g/ml、Na2HPO4. 12H20 0. 058g/ml,调 pH 值至 7· 4，力口 Tween-20至终浓度为1%，121°C高压30分钟。使用时，用去离子水稀释20倍即可。6.样品稀释液使用PBS溶解配制，各组分终浓度至甘露醇0. 05g/ml、蔗糖0. 05g/ ml, NaCl 0. 00875g/ml、BSA 0. 01g/ml、Proclin-300 0.1%。7.酶标二抗稀释液使用PBS溶解配制，各组分终浓度至酶稳定剂0.001g/ml、 Proclin-300 0. 1 %、Tween-20 0. 05%, BSA 0.01g/ml。8.羊抗犬IgG酶标抗体羊抗犬IgG酶标抗体购自Sigma公司，或用常规方法制备 HRP标记的羊抗犬IgG。使用酶标二抗稀释液进行稀释，定量分装，使用时进行1 100稀释。9.底物A液、底物B液购自KPL公司，底物液A液含有柠檬酸钠、双氧水，底物B 液为TMB，将A、B液直接分装，使用时A、B液等体积混合后立即使用。10.终止液将浓硫酸使用去离子水稀释至终浓度2mol/L。11.试剂盒的组装及保存将上述制备好的酶标板、阳性血清、阴性血清、标准血清、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、羊抗犬IgG酶标抗体、底物A液、底物B液、终止液按试剂盒配制定量分装。真空包装铝箔塑料袋定做。说明说一份。试剂盒保存在2 8V。实施例2血清中狂犬病中和抗体效价的测定程序用0.5ml样品稀释液复溶阳性血清和阴性血清，并10倍系列稀释至1 100。用0. 5ml样品稀释液复溶标准血清，按照下述稀释方法得到标准曲线，先将标准血清稀释至0.4IU/ml，再进行1 10稀释至0.04IU/ml，在此基础上进行2倍稀释，即得到下述梯度标准血清0. 04IU/ml,0. 02IU/ml,0. 01IU/ml,0. 005IU/ml,0. 0025IU/ml, 0. 00125IU/ml，0. 000625IU/ml。将待检血清10倍系列稀释至1 100。将稀释好的不同梯度效价的标准血清、阴性血清、阳性血清和待检样品加入板孔内，IOOul/孔，2孔重复。37°C恒温培养箱内孵育30分钟。用去离子水将浓缩洗涤液进行 20倍稀释备用，弃掉板孔内液体，加洗涤液200ul/孔，洗涤5次。用酶标抗体稀释液按照1 100稀释酶标抗体，IOOul/孔。37°C恒温培养箱内孵育60分钟。弃掉孔内液体，加洗涤液200ul/孔，洗涤5次。底物A、B液等体积混合，每孔加IOOul。37°C恒温培养箱内避光孵育20min。加入终止液50ul。在酶标仪上450nm测量OD值。计算标准血清的平均OD值，然后计算标准血清(从4IU至0. 0625IU/ml，不考虑其 1 100稀释)的平均OD值的对数值(In)。以标准血清滴度的对数值(In)为X轴，以标准血清平均OD值的对数值(In)为Y轴，汇出标准血清的标准曲线。建立标准血清滴度对数(In)和标准血清平均OD值对数(In)的线性回归曲线，数学公式为ln (狂犬病毒抗体的滴度(EU/ml)) = aX In (OD)+b，则狂犬病毒抗体滴度(EU/ml) = e(aXln(0D)+b)血清中抗体滴度彡0. 06EU/ml，说明血清中狂犬病毒IgG抗体检测为阳性，血清中抗体滴度< 0. 06EU/ml，说明血清中狂犬病毒抗体检测为阴性。血清抗体滴度彡0. 6EU/ml，说明血清抗体达到保护水平。。实施例3本发明试剂盒质量标准的制定及特性评价1.灵敏度将OIE狂犬病阳性血清(6. 7IU/ml)用样品稀释液稀释至0. 4IU/ml， 再进行10倍稀释至0. 04IU/ml后，再2倍倍比稀释，取0. 04,0. 02,0. 01,0. 005,0. 0025、 0. 00125,0. 000625,0. 0003125,0. 00015625IU/ml效价的血清，同时设置阴性对照，每个稀
释度重复2孔，按照试剂盒操作步骤进行，得到高于阴性对照血清OD值对应的血清抗体滴度即为试剂盒的狂犬病毒抗体最低检出限量，结果见表1。表1倍比稀释后OIE狂犬病阳性血清试剂盒检测结果
权利要求
1.一种检测动物狂犬病病毒中和抗体的酶联免疫吸附试剂盒，其特征在于，酶标板包被原为狂犬病毒经线性蔗糖梯度区带离心纯化得到的狂犬病全病毒颗粒。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的线性蔗糖梯度区带离心纯化狂犬病病毒的方法，其步骤为1)微载体上Vero细胞长成单层后，按0.03 0. 3感染复数的比例接种狂犬病毒，在温度 32 36°C、转速 20 80r/min、pH 7. 20 7. 80、溶氧 20% 70%、添加 0. 05% 5% 牛血清白蛋白的199培养基的条件下培养，培养4 6日后开始收获上清液至细胞完全脱落为止；2)将病毒收获液用0.1 0. 45 μ m滤芯过滤澄清后，用100KD 300KD膜包超滤浓缩；3)向狂犬病毒浓缩液中加入β-丙内酯，在2 8°C条件下灭活，37°C水解；4)狂犬病毒灭活液用线性蔗糖梯度进行区带离心，4°C，20000 50000r/min；离心 1 5小时，离心后泵入60%蔗糖溶液，收集狂犬病毒富集峰，得到的狂犬病毒离心液用截留分子量为100KD 300KD膜包超滤浓缩，PBS溶液透析脱糖，得到狂犬病毒纯化液。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括酶标二抗、样品稀释液、标准血清、阳性血清、阴性血清、显色剂、终止液和洗涤液。
4.如权利要求1 3任一所述的试剂盒，其特征在于，所用的狂犬病病毒来自狂犬病毒固定毒CTN-I株。
5.如权利要求1 3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标二抗为酶标羊抗犬 IgG ；所述酶标羊抗犬抗体的标记酶为辣根过氧化物酶。
6.如权利要求1 3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述标准血清，其制备包括将狂犬病病毒灭活抗原三针免疫程序接种比格犬，当血清效价高于6. 0IU/ml时，1周后采血分离血清，56°C灭活30min获得；所述阳性血清为狂犬病病毒灭活抗原免疫犬后获得的血清，测定血清狂犬病毒抗体水平；所述阴性血清为未感染狂犬病病毒且未免疫过狂犬病疫苗的健康犬血清。
7.如权利要求1 3任一所述的试剂盒，其特征在于，当标记酶为辣根过氧化物酶时， 所述显色剂由底物A液和底物B液组成，底物液A液含有柠檬酸钠、双氧水，底物B液为TMB ； 所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述洗涤液为含有1 %的Tween-20的PBS缓冲液。
8.一种制备权利要求1 7任一所述试剂盒的方法，其特征在于制备方法包括1)狂犬病病毒灭活后，用线性蔗糖梯度区带离心纯化，纯化的狂犬病全病毒颗粒与包被缓冲液配成合适浓度，包被酶标板；2)辣根过氧化物酶标记羊抗犬IgG，获得酶标二抗；3)狂犬病抗体检测阴阳性对照血清的制备，按常规方法制备狂犬病抗体检测阴性对照血清、狂犬病抗体检测阳性对照血清和狂犬病抗体标准血清；4)配制试剂，按配方配制封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、 终止液；5)试剂盒组装，将纯化的狂犬病全病毒颗粒包被的酶标板、酶标二抗、狂犬病抗体检测阴阳性对照血清、标准血清及封闭液、洗涤液、样品稀释液、酶标二抗稀释液、底物显色液、 终止液按试剂盒配制定量分装。
9.如权利要求8所述的方法，其中步骤1)所述的纯化狂犬病全病毒的包被浓度为`2 μ g/ml0
10.权利要求1 7任一项所述的试剂盒在检测动物狂犬病病毒中和抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开一种动物狂犬病中和抗体间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒的酶标板包被了用线性蔗糖梯度区带离心法纯化的狂犬病病毒全病毒颗粒，此包被抗原纯度高，可检测包括狂犬病病毒糖蛋白、核蛋白等蛋白产生的抗体，研究发现本发明的试剂盒特异性达到100％，灵敏度最低检出量为0.0625IU/ml，变异系数CV(重复性)为2.74％，稳定性良好。该试剂盒操作简单，成本低，适合推广使用。
文档编号G01N33/531GK102520169SQ201110388138
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月29日 优先权日2011年11月29日
发明者岳雷, 张振山, 李淑芬, 王海霞, 陈静 申请人:唐山怡安生物工程有限公司