专利名称：一种快速检测杜冷丁的胶体金检测试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种胶体金检测试剂盒以及制备工艺，具体涉及杜冷丁胶体金检测试剂盒以及制备工艺。
背景技术：
杜冷丁的学名叫哌替啶，又叫作唛啶、地美露，是人工合成的吗啡代用品，其盐酸盐为白色结晶状粉末，能溶于水和乙醇，一般制成针剂，主要用于疼痛、心源性哮喘、内脏绞痛等适应症。杜冷丁对人体的作用机理与吗啡相似，欣快、镇痛作用较吗啡小，但连续使用 1-2周便可产生依赖，一旦停止后则会产生相似于吗啡戒断后的戒断综合症，主要表现为精神萎靡不振、全身不适、流泪流涕、呕吐、腹泻、失眠，严重者也会产生虚脱。杜冷丁的滥用是我国当前所面临的毒品问题之一，已被列入国家麻醉药品予以严格管制。目前，杜冷丁的检测方法中运用最广泛的主要是气相色谱GC、高效液相色谱 HPLC、气相质谱GC/MS或GC/FID分析的方法，这些检测方法需要专业人员操作，且复杂费时，成本高，仅适用于杜冷丁的确认检测，却不能达到国内缉毒、查毒、禁毒行动所需的方便、快速、灵敏的要求。至今，国内尚没有涉及杜冷丁快速检测试剂的相关专利。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种既方便又快速的杜冷丁胶体金快速检测试剂盒及其制备方法。本发明的一方面，提供一种杜冷丁胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体的玻璃纤维垫片，免疫硝酸纤维素膜设有检测线(T线)和质控线(C线)，检测线上喷点有杜冷丁-载体复合物，质控线上喷点有羊抗鼠IgG。较佳的，所述胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。本发明的第二方面还提供了上述杜冷丁胶体金检测试剂盒的制备方法，包括下列步骤1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；2)采用步骤1制得的胶体金标记抗杜冷丁单克隆抗体获得免疫胶体金；3)采用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点杜冷丁 -载体复合物及羊抗鼠 IgG，制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤3制备的免疫胶体金纸片、步骤4制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂盒。步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为1 (8-9)，超声振荡2-3 分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与HAuCl4水溶液体积比1 (1. 9-2. 0)加入4. 0-4. 5 °C的0. 003-0. 004mol/L HAuCl4水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 5°C的抗坏血酸与PVP (聚乙烯醇吡咯烷酮) 的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为0546) 1，加入的 PVP与本步骤加入的HAuCl4的重量比为1 O. 0-2. 1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液。两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。步骤a)中，加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L。步骤a)中，超声震荡的频率为20-30KHZ。步骤b)中，抗坏血酸与PVP的混合水溶液的滴加速度为1-2滴/s。步骤b)中，所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为 0. 017-0. 019mol/L, PVP 的浓度为 0. 137-0. 139g/L。步骤b)中，搅拌反应约为50-70分钟。采用上述方法制得的胶体金清亮透明，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。步骤2、所述胶体金标记抗杜冷丁单克隆抗体可采用常规方法标记。具体的，步骤幻免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，获得OD54tl值为1. 2 2. 0的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸， 干燥，制得免疫胶体金纸片。较佳的，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% 1. OM Tris液、0. 2 0. 4w/ 乂％聚乙二醇20000、0. 15 0.血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶、0. 25 0. 35w/v%酪蛋白，和0. 02 0. 08w/V%叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 士 0. 05，余量为水。最优的，步骤I中喷金缓冲液配方为10v% 1.0M 1Tris液、0. 3w/v %聚乙二醇 20000,0. 2W/V%牛血清白蛋白，0. 2w/v%脱脂牛奶、0. 3w/v%酪蛋白，和0. 05w/v%叠氮化钠，用盐酸调节PH至8.5士0. 05，余量为水。较佳的，步骤II所述预处理液的组分包括0. 5 0. 8v% Tween-20，12 18w/v% 蔗糖，溶剂为水。最优的，步骤II中预处理液配方为0. 7% Tween-20，16w/v%蔗糖，余量为水。较佳的，步骤II中，用预处理液浸泡玻璃纤维纸时，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸^lmmX 220mm ；用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸时，每^lmmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。本发明中，为重量百分比，指体积百分比；指重量体积百分比，Iw/ 即为IOOml溶液中含lg。杜冷丁-载体复合物(如杜冷丁-牛血清白蛋白复合物)可市购或采用常规方法将杜冷丁与载体复合制得。本发明杜冷丁胶体金检测试剂盒的工作原理，即是利用高度特异的抗体-抗原特异结合反应及免疫膜层析技术，通过免疫竞争抑制法来定性检测人尿液中出现的杜冷丁。试剂盒内的检测试剂条是实现杜冷丁检测的关键，在试纸条检测区(T线)包被了杜冷丁-载体复合物。在试纸条的另一端固定有抗杜冷丁单克隆抗体-胶体金纸片。当尿液从加样孔加入，渗透到试剂条的加样垫上，被检样本首先与玻璃纤维膜上的胶体金标记的杜冷丁单克隆抗体结合，并通过毛细作用继续层析至试剂条硝酸纤维素膜，顺序通过硝酸纤维素膜上喷点了杜冷丁-载体复合物的检测区和喷点了 IgG的质控区。如果尿液中含有杜冷丁，它们将与杜冷丁-载体复合物竞争胶体金-抗杜冷丁抗体上有限的抗原结合位点，当杜冷丁浓度达到产品设计的阈值浓度以上时，它们将占据抗杜冷丁单克隆抗体上全部的抗原结合位点，这样就阻止了抗杜冷丁单克隆抗体-胶体金和检测区的杜冷丁 -复合物结合，检测区不能捕获到胶体金颗粒而无红色色带出现，检测结果呈阳性。如果尿液中没有杜冷丁或杜冷丁的浓度低于阈值浓度，则抗杜冷丁单克隆抗体-胶体金随同尿液运行至检测区，检测区捕获到胶体金颗粒而呈现红色色带，检测结果呈阴性。在试纸条上的质控区(C线)包被有羊抗鼠IgG，以指示试剂盒反应系统工作是否正常。质控线的出现与杜冷丁或其代谢物的存在无关。质控区色带的出现表明①样品加入量充足②样品在纸条上运行正常。本发明试剂盒的使用方法为1.将试剂盒放置在水平台面上。2.用加样吸管吸取尿样，然后滴3滴(约120ul)尿样到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品注意要使用不同的吸管。3.观察结果在滴加样品后3-8分钟判读结果。检测结果的判断方法阴性在结果观察窗口内出现两条色带，即检测线(T线)和质控线(C线)位置各出现一条红色线条，表示样品中无杜冷丁存在。阳性只在结果观察窗口的质控线(C线)位置出现一条红色线条，检测线(T线) 未出现任何线条，表示样品中有杜冷丁存在。无效质控线(C线)不出现。任何情况下，C线均应形成，表示加样和操作正确。 C线未出现表明测试结果是不确定的，应重做。本发明的有益效果(1)本发明在制备杜冷丁胶体金检测试剂盒时，采用了两步还原法制备胶体金分子，使得到的胶体金分子呈大小均一的约40nm球形颗粒，比之已公开的技术，虽然增加了一个操作步骤，但由于胶体金颗粒大小适中、整体均一，使其与单克隆抗体的结合效率更高、效果更稳定，这保证了标记步骤的可控性、降低了试剂盒的批间差异。(2)免疫胶体金纸片制备步骤中，通过采用合理配方的预处理液对玻璃纤维膜进行预处理并选配合适的喷金缓冲液，可保证免疫胶体金释放完全的基础上，有效减慢检测时免疫胶体金的释放层析，有利于抗原抗体充分反应结合，有效的提高了反应的灵敏度，同样的阈值下，还可降低免疫胶体金的用量，节约成本。(3)本发明制备的杜冷丁检测试剂盒，具有灵敏度高，可检出尿液中900ng/ml的杜冷丁 ；操作简单，检测结果肉眼可见，无需特殊实验仪器和专业技术人员；检测快速，5-8 分钟内可显示检测结果；而且检测结果费用低廉，储存和运输方便等优点。
图1 胶体金透射电镜2 杜冷丁胶体金检测试剂盒试剂条示意图1:滤样纸2:免疫胶体金纸3:免疫硝酸纤维素膜4:吸水纸5 检测线(T线)6 质控线(C线)
具体实施例方式以下结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例1杜冷丁胶体金检测试剂盒的制备试剂来源抗杜冷丁单克隆抗体、羊抗鼠IgG多克隆抗体、杜冷丁-牛血清白蛋白复合物 (KET-BSA)购自美国美迪生物技术有限公司(MAXMED LABORATORIES INC.)硝酸纤维素薄膜、玻璃纤维纸购自德国赛多利斯公司(SART0RIUS)试剂配制0. IM pH7. 6 的磷酸盐缓冲液分别称取 10. 2gNa2HP04, 3. 4gNaH2P04,加 900ml 纯化水溶解，用盐酸调节溶液PH值为7. 6，用纯化水定容至1000ml。10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液称取IOOgBSA用纯化水溶解并定容至1000ml。0. 1 % BSA的硼酸缓冲液称取硼砂9. 535g溶解于900ml纯化水中，用盐酸调pH 值至8. 6士0.05，定容至1000ml，即得0. IM硼酸盐缓冲液。称取IgBSA用0. IM硼酸盐缓冲液溶解并定容至1000ml，即为0. BSA的硼酸缓冲液。制备步骤1、胶体金的制备用柠檬酸钠-抗坏血酸两步还原法制备粒径40nm的胶体金a)第一次还原氯金酸溶液将6ml 0. 0164mol/L的HAuCl4水溶液加入200ml双蒸水中，加热煮沸30分钟，之后缓慢搅动并准确加入50ml 0.016mol/L柠檬酸三钠水溶液。 25KHZ超声振荡2分钟后冷却至室温，既制得约15nm粒径的胶体金原溶液。b)第二次还原氯金酸溶液取第一步制得的胶体金原核溶液^ml,并放置于4°C 水浴锅中稳定温度，随后加入50ml预冷为4. O0C的0. 0035mol/L HAuCl4水溶液并立即缓慢滴加250ml预冷为4. O0C的含0. 018mol/L的抗坏血酸与0. 138g/L PVP的混合水溶液，滴加速度为1-2滴/s，搅拌反应1小时，溶液呈透明的酒红色，既制得40nm粒径的胶体金溶液。制得的胶体金采用紫外分光光度计扫描有单一吸收峰，峰形窄，Xmax约为 525nm，采用透射电镜观察，如图1所示，粒径范围约为40nm，粒径尺寸均一，无凝集颗粒，基本未发现非球形粒子。2、免疫胶体金制备2. 1将抗杜冷丁单克隆抗体用0. IM pH7. 6的磷酸盐缓冲液稀释至浓度为1. Omg/ ml的抗体溶液。2. 2取500ml的胶体金溶液，往里加入1/10倍胶体金体积的0. 1ΜρΗ7. 6磷酸盐缓冲液混合3分钟。在快速搅拌下，再缓缓将稀释的抗杜冷丁单克隆抗体溶液-I加入其中。 室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。2. 3反应结束后，在上述反应液中快速加入IOml的10%的牛血清白蛋白(BSA)溶液。室温反应5分钟并不时缓缓搅拌。2. 4将制备好的免疫胶体金8000转/分钟离心20分钟，保留沉淀，并收集上清 12500转/分钟离心30分钟，弃上清。收集两次离心沉淀用含有0. 1 % BSA的硼酸缓冲液复溶到OD54tl在13-15之间。2. 5制得的纯化免疫胶体金为胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体。3、免疫胶体金纸制备分别采用方法1、2、3制备。方法1 3.1预处理液的制备准确称取7ml Tween-20，160g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。3.2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入IOOml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取3. Og聚乙二醇20000、2. Og牛血清白蛋白，2. Og脱脂牛奶，3. Og 酪蛋白溶液和0. 5g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤2制备的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1. 5，获得免疫胶体金溶液。3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。方法2:3.1预处理液的制备准确称取5ml Tween-20，180g蔗糖，加纯化水定容至 1000ml。3.2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入120ml 1. OM 1Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取2. Og聚乙二醇20000、1. 5g牛血清白蛋白，3. Og脱脂牛奶，2. 5g 酪蛋白溶液和0. Sg叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1. 5，获得免疫胶体金溶液。3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX 220mm，浸泡25min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。方法3 3.1预处理液的制备准确称取8ml Tween-20，120g蔗糖，加纯化水定容至
81000ml。3. 2喷金缓冲液的制备取800ml纯化水，往里加入80ml 1. OM Tris液，用盐酸调节pH至8. 5。准确称取4. Og聚乙二醇20000、2. 5g牛血清白蛋白，1. Og脱脂牛奶，3. 5g酪蛋白溶液和0. 2g叠氮化钠加入溶液中，充分溶解，混合均勻，加纯化水至总体积1000ml。3. 3用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，至溶液OD54tl值为1. 5，获得免疫胶体金溶液。3.4用预处理液浸泡玻璃纤维纸，每30ml预处理液浸泡玻璃纤维纸 ^lmmX 220mm，浸泡30min后，37 °C下干燥；再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，每 261mmX 220mm玻璃纤维纸上喷涂20ml免疫胶体金溶液，干燥，制得免疫胶体金纸片。4、免疫硝酸纤维素膜的制备4. 1将羊抗鼠IgG用磷酸盐缓冲液稀释成0. 5mg/ml，制得质控线(C线)溶液。4. 2将杜冷丁 -BSA复合物用磷酸盐缓冲液稀释至蛋白浓度为0. lmg/ml制得检测线(T线)溶液。4. 3用点膜机喷点C、T线溶液，制得免疫硝酸纤维素膜。每Im长硝酸纤维素膜各包被有Iml的C线和T线溶液，检测线和质控线的间距为5. 0mm。5、将滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁成宽度为4mm的试剂条(如图2所示)。6、将检测试剂条装入塑料盒内即得检测试剂盒。实施例2杜冷丁胶体金检测试剂盒的灵敏度实验检测方法1、取实施例1制得的杜冷丁胶体金检测试剂盒，将试剂盒放置在水平台面上。2、用加样吸管吸取样品，然后滴3滴(约120ul)样品到试剂盒的加样孔中。每检测一份不同的样品使用不同的吸管。3、观察结果在滴加样品后3-8分钟判读结果。检测样品配置杜冷丁浓度为450ng/ml、900ng/ml、1800ng/ml的质控参考品作为样品。检测结果
权利要求
1.一种杜冷丁胶体金检测试剂盒，包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体的玻璃纤维垫片，免疫硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，检测线上喷点有杜冷丁-载体复合物，质控线上喷点有羊抗鼠IgG。
2.如权利要求1所述杜冷丁胶体金检测试剂盒，其特征在于，所述胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体中，胶体金为粒径39-42nm的球形颗粒。
3.如权利要求1所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，包括下列步骤1)用两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金；2)采用步骤1制得的胶体金标记抗杜冷丁单克隆抗体获得免疫胶体金；3)采用喷金缓冲液稀释步骤幻的免疫胶体金获得免疫胶体金溶液，用免疫胶体金溶液喷涂经预处理的玻璃纤维垫片，制得免疫胶体金纸片；4)在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上分别喷点杜冷丁-载体复合物及羊抗鼠IgG， 制得免疫硝酸纤维素膜；5)将滤样纸、步骤幻制备的免疫胶体金纸片、步骤4)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在胶板上，切裁制得检测试剂条；最后将检测试剂条装入塑料盒制得检测试剂品.ο
4.如权利要求3所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤1)所述两步还原法制备平均粒径为39-42nm的胶体金具体包括下列步骤a)第一次还原氯金酸溶液制备浓度为0. 0004-0. 0005mol/L的HAuCl4水溶液，加热煮沸20-30分钟，之后边搅拌边加入柠檬酸三钠水溶液，HAuCl4与柠檬酸三钠的摩尔比为1 (8-9)，超声振荡2-3分钟后冷却至室温，既制得14 16nm粒径的胶体金原溶液；b)第二次还原氯金酸溶液将第一步制得的胶体金原溶液放置于4. 0-4. 5°C恒温冰浴中稳定温度，随后按胶体金原溶液与 HAuCIjK溶液体积比 1 (1. 9-2. 0)加入 4. 0-4. 5°C 的 0. 003-0· 004mol/L HAuCl4 水溶液，随后立即边搅拌边滴加4. 0-4. 5°C的抗坏血酸与PVP的混合水溶液，加入的抗坏血酸与本步骤加入的HAuCl4的摩尔比为(25- ) 1，加入的PVP与本步骤加入的HAuCl4W 重量比为1 0.0-2.1)，反应中保持温度恒定，搅拌至反应完全，溶液呈透明的酒红色，既制得39-42nm粒径的胶体金溶液；两步还原法中，配置各种水溶液均采用双蒸水。
5.如权利要求4所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤a)中， 加入柠檬酸三钠水溶液的浓度为0. 01-0. 02mol/L，超声震荡的频率为20-30KHZ。
6.如权利要求4所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤b)中， 所述抗坏血酸与PVP的混合双蒸水水溶液中，抗坏血酸的浓度为0. 017-0. 019mol/L,PVP的浓度为 0. 137-0. 139g/L。
7.如权利要求3所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤3)免疫胶体金纸片的制备包括下列步骤I.用喷金缓冲液稀释步骤2、的免疫胶体金，获得0D540值为1. 2 2. 0的免疫胶体金溶液；II.用预处理液浸泡玻璃纤维纸，干燥后，再用免疫胶体金溶液喷涂玻璃纤维纸，干燥， 制得免疫胶体金纸片。
8.如权利要求7所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤I所述喷金缓冲液的组分为8 12v% 1. OM Tris液、0. 2 0. 4胃八％聚乙二醇20000、0. 15 0. 25 八％牛血清白蛋白，0. 1 0. 3w/v%脱脂牛奶、0. 25 0. 35w/v%酪蛋白，和0. 02 0. 0彻八％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8. 5 士 0. 05，余量为水。
9.如权利要求7所述杜冷丁胶体金检测试剂盒本的制备方法，其特征在于，步骤II所述预处理液的组分包括0. 5 0. 8v% Tween-20,12 18w/v%蔗糖，溶剂为水。
全文摘要
本发明提供了一种快速检测杜冷丁的胶体金检测试剂盒及其制备。本发明的试剂盒包括试剂条，试剂条从加样端开始依次为滤样纸、免疫胶体金纸片、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，其中，所述免疫胶体金纸片为包被有胶体金标记的抗杜冷丁单克隆抗体的玻璃纤维垫片，免疫硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，检测线上喷点有杜冷丁-载体复合物，质控线上喷点有羊抗鼠IgG。本发明还进一步提供了上述杜冷丁的胶体金检测试剂盒的制备方法。采用本发明的试剂盒检测杜冷丁，灵敏度高、操作简单、快速，且检测结果费用低廉，储存和运输方便。
文档编号G01N33/531GK102520181SQ20111045800
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者张国华 申请人:上海凯创生物技术有限公司