专利名称：二氟硼类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内氢离子中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种荧光探针，特别涉及一种二氟硼类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内氢离子中的应用，属于检测技术领域。
背景技术：
细胞和细胞器的许多重要生理过程等都与pH值密切相关(Fuh M R S, Burgess L W，Hirschfeld T，Analyst，1987，112，1159-1163 ；Khramt sov V V，Grigor Ev I A， Foster M A，Cell Mol. Biol. 2000，46，1361-1374)。在正常的生理条件下，细胞外液中 H+ 的浓度约为40nmol · L-1 (pH = 7. 40)。氢离子浓度作为一个重要的新陈代谢参数，对许多细胞过程中起到关键的调节作用，比如细胞生长，钙离子调节，酶活性，信号传导，细胞内吞作用，化学向性及其他的细胞过程等(H. Izumi, T. Torigoe, H. Ishiguchi, Cancer Treat. Rev. 2003，29，541-549 ;Μ· Chesler, Physiol. Rev.，2003，83，1183-1221 ;Α· Μ· Paradiso, R.Y.Tsien, Τ. Ε. Machen, Nature，1987，325，447-450 ;Ι· Yuli and A. Oplatka, Science， 1987，235，340-342)。许多报道认为一些疾病如癌症，肾衰竭，肺病等与细胞质或者酸性细胞器内的 pH 异常有关(S. H. Hansen, K. Sandvig, B. V. Deurs, J. Cell Biol. 1993，121， 61-72 ;Μ· Schindler, S. Grabski, E. Hoff, Biochem. 1996, 35, 2811-2817 ；J. M. Holopainen, J. Saarikoski, P. K. J. Kinnunen, Eur· J. Biochem.，2001，268，5851-5856)。因此 pH 值的精确测量对化学生物学研究十分重要。目前，可用于监测pH的方法主要有玻璃电极法、核磁法、紫外吸收法及荧光光谱法。利用荧光法设计对PH有灵敏响应的荧光探针，由于其非破坏性、高的灵敏度和专一性， 以及广泛可用的荧光染料，在测定PH时比其他方法更具优越性。荧光探针通过与质子的结合对荧光进行调控，荧光共聚焦成像技术能够描绘出活体细胞内氢离子的时空分布特性。 pH荧光探针可分为两类第一类包括普通使用的荧光素、蒽等的衍生物。这类探针的酸、碱形式中只有一种显示强荧光，因此，与PH对应的荧光变化取决于酸或碱形式的浓度。第二类探针的酸、碱形式具有不同的吸收或(和)发射带，随PH变化，发射或(和)激发波长会发生移动，可以用不同波长下的荧光比率来测定氢离子浓度。另外，有些荧光探针本身随 PH变化荧光寿命发生变化以此来检测氢离子浓度。根据荧光pH探针的工作范围不同，荧光探针又可分为两类一类是用于检测细胞质内pH(6. 8-7. 4) (K. M. Sun, C. K. McLaughlin, D. R. Lantero, J. Am. Chem. Soc. 2007,129,1894-1895 ；M. S. Briggs, D. D. Burns, Μ. E. Cooper, Chem. Commun. 2000, 2323-2324；J. A. Thomas,R. N. Buchsbaum, A. Zimniak a,Biochem. 1979， 18,2210-2218 ；A. H. Lee, I. F. Tannock, Cancer Res. 1998，58，1901-1908);另一类是用于检测酸性官(4. 5-6. O)如溶酶体、内涵体等的探针(H. -J. Lin, P. Herman, J. S. Kang, Anal. Biochem. 2001,294,118-125 ；F.Galindo, M. I. Burguete, L. Vigara, Angew. Chem. Int. Ed. 2005，44，6504-6508)。目前，用于pH检测的荧光探针主要有花菁类探针、罗丹明类探针、荧光素类、BODIPY类探针、基于荧光染料蒽的FG-H系列探针和具有5-芳基-2-吡啶基氧氮杂茂类双光子探针等。这些探针根据荧光染料母体的不同而各具特点。花菁类PH探针发射波长在近红外区，不易被生物介质基质吸收，对组织损伤小且穿透力强，但是花菁的斯托克斯位移小，容易发生自猝灭和光漂白。其他类型的探针也有不足之处，如BODIPY类、 5-芳基-2-吡啶基氧氮杂茂类探针和罗丹明探针水溶性不好，而且激发发射波长多处于可见光区，从而限制了它们在生物体内的应用。现有的氟硼类染料荧光探针结构多为与B与N相连(如申请号为 200510046876. 0,201010166304. 7,200710010109. 3 的中国专利)，探针的 stokes 位移只在 20 50nm (参见J. Org. Chem. 2005，70，4152-4157)，合成步骤繁琐，不易纯化(参见J. Org. Chem. 2005，70，4152-4157)，且多用来检测锌离子、汞离子、镉离子等金属离子，探针的荧光强度随着PH的增大而降低(参见J. Org. Chem. 2005，70，4152-4157)，探针的pka值在
7.50 9. 30之间，pH响应范围明显偏小。
发明内容
本发明的目的在于克服目前pH检测荧光探针的不足，提供一类二氟硼类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内氢离子中的应用，该类荧光探针结构新颖、灵敏度、 选择性好、光稳定性好。本发明采取的技术方案为二氟硼类染料荧光探针，其结构式如下
权利要求
1.二氟硼类染料荧光探针，其结构式如下
2.权利要求I所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，化合物Ι、Π、ΙΙΙ、 IV的合成步骤为(1)取原料二甲基二氟硼、取代单体，将两者溶解于乙腈中形成混合溶液，用三乙胺调节混合溶液至碱性，然后在40°C _60°C加热回流5-24小时；(2)将上述回流后的混合物室温下冷却，在45°C_50°C减压浓缩30-60分钟去掉部分溶剂；(3)加氯仿将浓缩后混合物溶解，然后加入乙醚将产品反向析出，重复2-3次，得到探针纯品。
3.根据权利要求2所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，步骤(I)中取代单体为4-醛基苯酚、2-醛基吡嗪、N-醛基哌嗪或2-醛基吡啶。
4.根据权利要求2所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，二甲基二氟硼与取代单体物质的量比为I : 2 4。
5.根据权利要求2所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，二甲基二氟硼，乙腈与三乙胺的用量比例为I. 2 3. O : 20 30 : 2 6，g : mL : g ;氯仿、浓缩后混合物与乙醚的体积比为2 6 2 4 20 30。
6.权利要求I所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，化合物V的合成步骤如下(1)取原料二甲基二氟硼和二氧化硒加入到两口烧瓶中，加热到50 70°C，搅拌回流反应8 16h ；(2)反应液冷至室温后，将生成的紫红色Se沉淀用砂芯漏斗抽滤除去，用二氯甲烷洗涤Se沉淀上附着的生成物，得到棕红色溶液；(3)将得到的棕色溶液抽真空旋干，得到醛基化二氟硼；(4)在氩气气氛下，将醛基化二氟硼，邻氨基苯硫酚和苯加入到烧瓶中，60 80°C搅拌回流反应8 16h，反应液冷至室温后，蒸除苯，用氯仿溶解产物，加入石油醚重结晶2 3 次得探针。
7.根据权利要求6所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，所述的二甲基二氟硼和二氧化硒的质量比为I. 4 2. 6 2. O 4.0。
8.根据权利要求6所述的二氟硼类染料荧光探针的合成方法，其特征是，所述的醛基化二氟硼、邻氨基苯硫酚和苯的用量比例O. 16 O. 3 O. 20 O. 40 10 20，g : g : mLo
9.权利要求I所述的二氟硼类染料荧光探针在检测细胞内氢离子中的应用。
全文摘要
本发明涉及一类二氟硼类染料荧光探针、其合成方法及其在检测细胞内氢离子中的应用，该类荧光探针具有二氟硼母体结构，在惰性气体保护下，二甲基二氟硼与取代单体通过甲基与醛基反应，或者醛基化二甲基二氟硼与取代单体通过醛基与氨基发生缩合反应制得探针分子，最后经过重结晶得到探针纯品。本发明荧光探针结构新颖、灵敏度、选择性好、光稳定性好。
文档编号G01N21/64GK102603782SQ201210026579
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月7日 优先权日2012年2月7日
发明者唐波, 孙娟, 王春霞, 王栩, 齐文学 申请人:山东师范大学