专利名称：TORCH五项IgM抗体检测试剂盒及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种病原微生物的检测试剂，特别涉及ー种TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒及其制备方法。该试剂盒用于检测样本中TORCH五项，即弓形虫(T0X)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)的IgG类的抗体。
背景技术：
TORCH指可导致先天性宫内感染及围产期感染，从而引起围产儿畸形的ー组病原微生物的英文名称缩写，其中T (Toxopasma)是弓形虫，R(Rubella. Virus)是风疫病毒，C (Cytomegalo. Virus)是巨细胞病毒，H(Herpes. Virus)即是单纯疱疫 I/II 型。TORCH 这组微生物感染有着共同的特征，均可造成母婴感染。孕妇由于内分泌改变和免疫力下降易发生原发感染，而既往感染的孕妇体内潜在的病毒也容易被激活而发生复发感染。孕妇发生TORCH感染时，病毒可通过胎盘或产道传播感染胎儿，引起早产、流产、死胎或畸胎等，以及引起新生儿多个系统、多个器官的损害，造成不同程度的智力障碍等症状。TORCH的感染与优生优育有重要而密切的关系。弓形虫(TOX):孕早期弓形虫感染引起的胎儿畸形主要包括脑积水、小脑畸形、脉络膜视网膜炎及脑钙化。血行感染可引起胎儿多器官坏死性损害，如肝脾肿大、心肌炎及血小板减少症等。风疹病毒(RV):主要通过呼吸道传播，孕妇感染后能使胎儿致畸，病毒通过胎盘感染胎儿形成先天性感染，称为先天性风疹综合症(CRS)，主要是先天性白内障、先天性心脏病和神经性耳聋，20周后感染者几乎无影响。风疹感染发生在孕期越早，胎儿的致畸也越严重。巨细胞病毒(CMV):感染后能引起宫内胎儿生长迟缓、小头形、脑炎、视网膜脉膜炎、黄疸、肝脾肿大、溶血性贫血等，新生儿死亡率较高，围产期母乳排毒所致的CMV感染率为 63%。单纯疱疹病毒(HSV I/II型)通常潜伏在神经节，妊娠时母体的生理变化使HSV活化，孕早期感染能破坏胚芽面导致流产，孕中晩期虽少发畸胎，但可引起胎儿和新生儿发病。因此，为減少病残儿的出生率及提高出生人口素质，临床工作者应进一歩加强对孕妇的宣传教育，积极做好TORCH感染的血清学筛查以便及早发现不良妊娠并及时处理；对新生儿也应常规开展TORCH检测，了解新生儿TORCH感染情況，以便早干预、早治疗。TORCH感染的筛查对优生优育具有重要现实意义。TORCH五项中IgG类抗体为TORCH既往感染或感染期的重要指标；IgM为早期感染指标，胎盘中特异性IgM的检测是诊断胎儿宫内感染的可靠依据；而TORCH五项中IgG抗体和IgM抗体的联合检测，是判断TORCH早期感染或既往感染的重要方法。我国常用ELISA酶联免疫技术或金标快速检测技术分别检测TOCRH五项IgM或IgG类抗体，但该方法的检测结果易受到类风湿因子等方面的干扰，缺乏精确度。免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为ー抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。其原理是经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。目前应用条带免疫印迹技术联合检测TOCRH五项IgM或IgG类抗体的方法未见报道，本发明经过研究，用条带免疫印迹法測定TOCRH五项IgM或IgG类抗体，精确度高，灵敏度高，操作简单，无干扰，价格便宜。
发明内容
本发明提供ー种高灵敏度、高特异性、质量稳定，操作方面，价格便宜并能满足TORCH五项IgM类抗体检测试剂盒的制备方法。本发明的TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒,包含以下试剂I)包被有TORCH五项IgM类抗体的总裂解抗原的检测试剂条，2)样本稀释液，3)标记有辣根过氧化酶的酶工作液，4)显色剂 A，5)显色剂 B，6) 20倍浓缩洗液。其中I)所述检测试剂条，所用材料包括载体板,如PVC等材质类载体板,硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜，弓形虫(TOX)裂解抗原、风疹病毒(RV)裂解抗原、巨细胞病毒(CMV)裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)裂解抗原、抗人IgM等TORCH原料配制成包被液制成的5条包被线。其中所述检测试剂条的制备方法包括以0. OlM pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液作为包被稀释液，将弓形虫裂解抗原、风疹病毒裂解抗原、巨细胞病毒裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒裂解抗原、抗人IgM稀释到0. 5-5mg/ml，然后在硝酸纤维素膜或PVDF膜上依次划线包被将包被膜冻干或晾干，然后粘贴在PVC材质类载体板上制成包被膜，然后切成3-5mm宽的检测试剂条，包被划线速度l-2ul/cm。其制备方法包括I)包被原料选择选择合适浓度和效价的IgG类弓形虫(TOX)裂解抗原和特异性重组抗原、风疹病毒(RV)裂解抗原和特异性重组抗原、巨细胞病毒(CMV)裂解抗原和特异性重组抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)裂解抗原和特异性重组抗原、人IgG抗体等原料。2)包被膜制备以0. OlM pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)作为包被稀释液，将5项TORCH包被原料稀释成合适的工作浓度，然后在硝酸纤维素膜(NC膜)或PVDF膜上依次划线包被质控检测线(C线)抗人IgM、检测线弓形虫(TOX)裂解抗原、风疹病毒(RV)裂解抗原、巨细胞病毒(CMV)裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)裂解抗原共5条包被线，将包被膜冻干或晾干，然后粘贴在PVC等材质类载体板上制成包被膜，然后切成3-5_宽的检测试剂条，即制备成检测试剂条。祥见附图1:所述包被液工作浓度可为0. 5_5mg/ml，包被划线速度l-2ul/cm。其中2)所述的样本稀释液其配方组成如下
磷酸ニ氢钠0.59g
磷酸氢ニ钠5.8g
氯化钠9.00g
硫柳汞钠0.2g
BSA0.05-2g
纯化水加至IOOOml调pH 值为 7. 2-7. 4其中3)所述的酶工作液配方组成如下选择特异性的抗 抗人IgM (如抗人IgM特异性片段ii链)的单克隆抗体,用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)，制成原酶，ELISA效价> 1:5000。配制酶工作液稀释液
磷酸ニ氢钠0.59g
磷酸氢ニ钠5.8g
氯化钠9.00g
硫柳汞钠0.2g
BSA0.05-2g
酶稳定剂0.5-2%
纯化水加至IOOOml调pH 值为 7. 2-7. 4配制酶工作液将原酶用酶工作液稀释液稀释至合适的浓度即得酶工作液。如终浓度浓度为1:2000 1:4000 (v:v)的酶工作液。其中4)所述显色剂A的配方组成如下柠檬酸5. OOgNa2HP04 12H2017.45gH202 (30%)Iml纯化水加至IOOOml
其中5)所述显色剂B的配方组成如下柠檬酸5. OOgNa2HP04 12H2017.45gTMB 2HCL0. 80g纯化水加至IOOOml其中6)所述20倍浓缩洗液的配方组成如下磷酸ニ氢钠11. 8g磷酸氢ニ钠116g氯化钠170g纯化水加至IOOOml以上试剂按照比例盛装，选择检测1-3次的用量，各试剂可分别盛装，再一同包装在同一包装盒内，低温保存，使用时根据说明书中描述的方法进行操作即可。有关试剂的用量以一人1-3次的用量为宜。本发明还包括，本发明的TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒使用方法该使用方法包括以下步骤I)将TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒从2_8°C冰箱取出，平衡
至室温。2 )将20倍浓缩洗液稀释成I倍洗液备用。3)取出TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂条，放入反应槽中，加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。4)将样本用样本稀释液1:5(Tl: 100稀释，加入1. 5ml稀释后样本，并编号，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床孵育30-60min，弃去样本稀释液。5)加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-25°C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。6)加入1. 5ml酶工作液，室温条件下(18-25°C)，用摇摆摇床孵育30_60min，弃去
酶工作液。7)加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-25°C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。8)分别加入Iml显色剂A和显色剂B,用摇摆摇床孵育10-20min,弃去显色液。9)用纯化水或蒸馏水洗涤膜3次，判断結果。将膜晾干后，结果可长期保存。10)结果判断A)只有质控检测线(C线)显色，TORCH检测为阴性；B)质控检测线(C线)显色、TORCH (T0X、RV、CMV、HSV)任意一项裂解抗原显色，则表明该项目IgM类抗体检测阳性。C)质控检测线(C线 )不显色，该次检测无效。本发明可以检测的样本包括，人的全血、血清、血浆、脑脊液等。本发明的检测方法，经过实验发现，2_8°C条件下有效期为I年。用于全血、血清、血浆、脑脊液等样本中TORCH五项IgM类抗体的联合检测。该方法样本需求量小，不需要特殊设备，肉眼观察结果，简便快速、特异性好、灵敏度高，且成本低，易于广泛推广。且配合专利发明TORCH五项IgG抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒同时使用可区分TORCH五项的既往感染和近期感染，为TORCH检测提供有力依据。
图1 :T0RCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒检测试剂条图例
具体实施例方式以下通过实施例进ー步说明本发明，主要在于帮助阅读者更好的理解本发明，不作为对本发明的限制。实施例1，1、检测试剂条的制备如图1显示T0RCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒中检测试剂条由PVC载体板，PVDF膜，弓形虫(TOX)裂解抗原、风疹病毒(RV)裂解抗原、巨细胞病毒(CMV)裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)裂解抗原、抗人IgM等TORCH原料配制成包被液制成的9条包被线组成。以0. OlM pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS溶液)作为包被稀释液，将5项TORCH包被原料稀释成合适的工作浓度，然后在PVDF膜上依次划线包被质控检测线(C线)抗人I gM、检测线弓形虫(TOX ) I gM类裂解抗原、风疹病毒(RV ) I gM类裂解抗原、巨细胞病毒(CMV )IgM类裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒(HSV-1/II)IgM类裂解抗原共5条包被线，将包被膜晾干，然后粘贴在PVC等材质类载体板上制成包被膜，然后切成4_宽的检测试剂条，即制备成检测试剂条。祥见附图1:所述包被液工作浓度可为1 . 5mg/ml,包被划线速度l_2ul/cm。2、样本稀释液制备
磷酸ニ氢钠0.59g
磷酸氢ニ钠5.8g
氯化钠9.00g
硫柳汞钠0.2g
BSA0.5g
纯化水加至IOOOml调pH 值为 7. 2-7. 43、酶工作液制备选择特异性的抗抗人IgM (如抗人IgM特异性片段ii链)的单克隆抗体,用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶(HRP)，制成原酶，ELISA效价> 1:5000。配制酶工作液稀释液磷酸ニ氢钠0.59g
磷酸氢ニ钠5.8g
氯化钠9.00g
硫柳汞钠0.2g
BSA0.5g
酶稳定剂1%
纯化水加至IOOOml调pH 值为 7. 2-7. 4配制酶工作液将原酶用酶工作液稀释液稀释至1:3000浓度即得酶工作液。4、20倍浓缩洗液配制磷酸ニ氢钠11. 8g磷酸氢ニ钠116g氯化钠170g纯化水加至IOOOml5、显色剂A配制柠檬酸5. OOgNa2HP04 12H2017.45gH202 (30%)Iml纯化水加至IOOOml6、显色剂B配制柠檬酸5. OOgNa2HP04 12H2017.45gTMB 2HCL0. 80g纯化水加至IOOOml7、TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒制备将TORCH检测试剂条、样本稀释液、酶工作液、20倍浓缩洗液、显色剂A、显色剂B按使用比例组装成试剂盒即得成品试剂盒。实施例2 1、TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒使用方法1)将TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒从2_8°C冰箱取出，平衡
至室温。2 )将20倍浓缩洗液1:20倍稀释成I倍洗液备用。3)取出TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂条，放入反应槽中，加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。4)将样本用样本稀释液1:5(Tl: 100稀释，加入1. 5ml稀释后样本，并编号，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床孵育30min，弃去样本稀释液。5)加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。
6)加入1. 5ml酶工作液，室温条件下(18-25°c)，用摇摆摇床孵育60min，弃去酶エ作液。7)加入1. 5ml I倍洗液，室温条件下(18-250C )，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min。8)分别加入Iml显色剂A和显色剂B,用摇摆摇床孵育IOmin,弃去显色液。9)用纯化水或蒸馏水洗涤膜3次，判断結果。将膜晾干后，结果可长期保存。2、结果判断I)只有质控检测线(C线)显色，TORCH检测为阴性；2)质控检测线(C线)显色、TORCH (TOX、RV、CMV、HSV)任意ー项IgM裂解抗原显色，则表明该项目IgM类抗体检测阳性。3)质控检测线(C线)不显色，该次检测无效。3、TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒与TORCH五项的单项酶联免疫(ELISA)检测试剂盒同时检测各项临床样本50例，结果阳性符合率100%，阴性符合率100%，且溶血、脂血、黄疸等样本对结果无影响。4、用TORCH五项IgM抗体(条带免疫印迹法)检测试剂盒平行检测同一样本10次，
显色结果均一。
权利要求
1.一种TORCH五项IgM抗体检测试剂盒，包含以下试剂 1)包被有TORCH五项IgM类抗体的总裂解抗原的检测试剂条， 2)样本稀释液， 3)标记有辣根过氧化酶的酶工作液， 4)显色剂A， 5)显色剂B， 6)20倍浓缩洗液。
2.根据权利要求1的检测试剂盒，其中所述检测试剂条，所用材料包括载体板，硝酸纤维素膜或PVDF膜，弓形虫裂解抗原、风疹病毒裂解抗原、巨细胞病毒裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒裂解抗原、抗人IgM。
3.根据权利要求1的检测试剂盒，其中所述检测试剂条的制备方法包括 以O. OlM pH7. 2-7. 4的磷酸盐缓冲液作为包被稀释液，将弓形虫裂解抗原、风疹病毒裂解抗原、巨细胞病毒裂解抗原、单纯性疱疹I型和2型病毒裂解抗原、抗人IgM稀释到·O.5-5mg/ml，然后在硝酸纤维素膜或PVDF膜上依次划线包被将包被膜冻干或晾干，然后粘贴在PVC材质类载体板上制成包被膜，然后切成3-5mm宽的检测试剂条，包被划线速度l-2ul/cm。
4.根据权利要求1的检测试剂盒,其中2)所述的样本稀释液其配方组成如下磷酸二氢钠O Wg 磷酸氢二钠5.8g氯化钠9.00g 硫柳莱钠0.2gBSA0.05-2g纯化水加至IOOOml调 pH 值为 7. 2-7.4。
5.根据权利要求1的检测试剂盒，其中3)所述的酶工作液配方组成如下 选择特异性的抗人IgM的单克隆抗体，用过碘酸钠法标记辣根过氧化物酶，制成原酶，ELISA 效价≥ 1:5000， 配制酶工作液稀释液磷酸二氢钠0.59g 磷酸氢二钠5.8g 氯化钠9.00g 硫柳莱纳0.2g BSA0.05-2g 酶稳定剂0.5-2%纯化水加至IOOOml 调PH值为7. 2-7. 4 将原酶用酶工作液稀释液稀释至合适的浓度即得酶工作液。
6.根据权利要求1的检测试剂盒， 其中4)所述显色剂A的配方组成如下 朽1檬酸5. OOg Na2HP04 · 12H2017.45g H202 (30%)Iml 纯化水加至IOOOml 其中5)所述显色剂B的配方组成如下 朽1檬酸5. OOg Na2HP04 · 12H2017.45g TMB · 2HCLO. 80g 纯化水加至1000ml。
7.根据权利要求1的检测试剂盒，其中6)所述20倍浓缩洗液的配方组成如下 磷酸二氢钠11. 8g 磷酸氢二钠116g 氯化钠170g 纯化水加至1000ml。
8.根据权利要求1的检测试剂盒，各试剂按照适当的比例盛装，选择检测1-3次的用量，各试剂可分别盛装，再一同包装在同一包装盒内。
9.权利要求1的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤 1)将TORCH五项IgM抗体检测试剂盒从2-8°C冰箱取出，平衡至室温， 2)将20倍浓缩洗液稀释成I倍洗液备用， 3)取出TORCH五项IgM抗体检测试剂条，放入反应槽中，加入1.5ml I倍洗液，室温条件下，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min， 4)将样本用样本稀释液1:5(Tl:100稀释，加入1. 5ml稀释后样本，并编号，室温条件下，用摇摆摇床孵育30-60min，弃去样本稀释液， 5)加入1.5ml I倍洗液,室温条件下，用摇摆摇床洗膜3次,每次5min, 6)加入1.5ml酶工作液，室温条件下，用摇摆摇床孵育30-60min，弃去酶工作液， 7)加入1.5ml I倍洗液，室温条件下，用摇摆摇床洗膜3次，每次5min，8)分别加入Iml显色剂A和显色剂B,用摇摆摇床孵育10-20min,弃去显色液， 9)用纯化水或蒸馏水洗涤膜3次，判断结果。将膜晾干后，结果可长期保存， 10)结果判断: A)只有质控检测线显色，TORCH检测为阴性， B)质控检测线显色、TORCH任意一项裂解抗原显色，则表明该项目IgM类抗体检测阳性， C)质控检测线不显色，该次检测无效。
10.根据权利要求1的检测试剂盒,可以检测的样本包括,人的全血、血清、血浆、脑脊液。
全文摘要
本发明涉及一种病原微生物的检测试剂，特别涉及一种TORCH五项IgM抗体检测试剂盒及其制备，该试剂盒用于检测样本中TORCH五项，即弓形虫(TOX)、风疹病毒(RV)、巨细胞病毒(CMV)和单纯性疱疹1型和2型病毒(HSV-I/II)的IgG类的抗体。
文档编号G01N33/544GK103033612SQ20121054665
公开日2013年4月10日 申请日期2012年12月15日 优先权日2012年12月15日
发明者李艳召, 戈军, 曹建荣, 张誌 申请人:北京金豪制药股份有限公司