专利名称：一种用于检测克伦特罗的电化学修饰电极及检测装置的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分析化学和检测领域，更具体地，本实用新型涉及一种用于克伦特罗的电化学修饰电极及检测装置。
背景技术：
克伦特罗(CLB)于1964年在美国首次合成，是一种肾上腺激素受体激动药，它的化学式为a-[(叔丁氨基)甲基]-4-氨基3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，是瘦肉精的主要成分，又名咳哮素、氨哮素。克伦特罗具有药用价值，可用于治疗哮喘病，临床医学上主要用于扩张支气管、增加肺通气量。克伦特罗也具有蛋白同化作用，在动物体内能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，可以减少脂肪的生成提高瘦肉率。因而，不法商户将其加入到饲料或饮水中使禽畜肌肉比例提高，造成该药在动物体内蓄积，尤其是在肝脏组织中的浓度最高。残留的克伦特罗通过食物链被人类食用后会出现头晕、心悸等中毒症状，因此，滥用瘦肉精已成为重大的食品安全问题。·中国政府严禁在食品生产中使用克伦特罗，从2002年12月起，农业部的第235号公告修订了《动物性食品中兽药最高残留限量》，规定克伦特罗在所有动物性食品中不得检出。我国不断加大打击力度，但目前滥用情况仍非常严重。造成克伦特罗屡禁不止的原因一方面是利益驱使；另一方面是现在检测克伦特罗的方法、仪器还不完善。为了避免此类事故的再次发生，食品中克伦特罗的快速、准确检测成为当前高度重视和亟待解决的问题。检测克伦特罗残留常用的传统方法有气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)、酶标记免疫吸附测定法(ELISA)、毛细管电泳法(CE)等。我国目前已将HPLC法作为检测盐酸克伦特罗的确证性方法，其具有灵敏度高，假阳性率低等特点。但是色谱法在实际应用中受到一定的限制，主要是因为此法具有前处理过程烦琐、检测时间长，需贵重仪器等缺点。ELISA法是检测盐酸克伦特罗较高效的免疫分析法，但其假阳性率较高，CE法在分析样品过程中同样也存着一些亟待解决的问题，缺乏合适的检测器和检测时间较长是制约该法应用的主要瓶颈。电化学免疫传感器是利用抗原抗体结合的高度特异性，将免疫分析同电化学检测技术融为一体的化学传感器，由于其仪器设备简单、制作方便且成本低廉等优点而在食品安全、生命科学及临床医学等领域得到广泛应用。但是在检测灵敏度上还有待进一步提高。因此，本领域迫切需要一种新型的、高灵敏度、快速方便检测克伦特罗的检测电极及检测装置。
发明内容为了快速灵敏地检测克伦特罗，本实用新型提供了一种用于快速检测克伦特罗的电化学修饰电极。本实用新型还提供了一种检测克伦特罗的电化学检测装置。本实用新型提供了一种用于快速检测克伦特罗的电化学修饰电极，所述电化学修饰电极包括基底电极；设置于基底电极外表面的多壁碳纳米管(MWCNTs);设置于多壁碳纳米管外表面的EDC-NHS交联剂层；设置于EDC-NHS交联剂外表面的克伦特罗单克隆抗体层(anti-CLB);以及设置于克伦特罗单克隆抗体外表面的BSA封闭剂层。本实用新型还提供了一种用于快速检测克伦特罗的电化学检测装置，所述检测装置为电解池，所述电解池包括工作电极，对电极，参比电极，设置在电解池顶部的支架，所述支架用于放置所述对电极和参比电极；以及设置在电解池底部的电解液。所述工作电极即为所述电化学修饰电极，其包括了新型材料银-氧化石墨烯-克伦特罗纳米复合物材料(Ag-GO-CLB)，并采用了 anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极。所述电化 学修饰电极包括基底电极；设置于基底电极外表面的多壁碳纳米管(MWCNTs);设置于多壁碳纳米管外表面的EDC-NHS交联剂层；设置于EDC-NHS交联剂外表面的克伦特罗单克隆抗体层(anti-CLB);以及设置于克伦特罗单克隆抗体外表面的BSA封闭剂层。 在本实用新型中，所述的基底电极是玻碳电极。在本实用新型中，所述的对电极是钼电极。在本实用新型中，所述的参比电极是Ag/AgCl参比电极。在本实用新型中，所述的电解液为I. 0 M KCl溶液。本实用新型的有益效果在于本实用新型利用anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极对克伦特罗进行直接电化学检测时，在一定的浓度范围内，克伦特罗的浓度与银纳米粒子的氧化峰电流值的减小量具有线性相关性，检测线性范围为0. 01-10. 0 ng/mL，检测限达到6.8 pg/mL。anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极制备简单、响应速度快。本实用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极还具有良好的选择性，当克伦特罗的浓度为0.1 mg mL时，相同浓度的莱克多巴胺、多巴酚丁胺、沙丁胺醇对克伦特罗的检测基本无影响。本实用新型电极的制备和检测操作简单方便，使用仪器价格便宜，成本低廉。电极材料无污染，不会造成环境污染，符合人们对与环保的要求。
图I是本实用新型电化学修饰电极的剖面结构示意图。图2是本实用新型电化学修饰电极的构成示意图。图3本实用新型电化学修饰电极所用的纳米复合材料Ag-GO-CLB的制备过程。图4是本实用新型检测装置的结构示意图。图5表示anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极检测克伦特罗的工作曲线，横坐标为克伦特罗的对数浓度，纵坐标为电流响应的减小值。内插图为anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极在不同克伦特罗浓度下的DPV响应，横坐标为电位，纵坐标为电流响应大小。图6是本实用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极的特异性检测结果柱状图，横坐标为不同的分析底液，纵坐标为电流响应大小。
具体实施方式
以下对本实用新型的各方面进行详述。本发明的以下实施例并不是对本发明的限制。因此，在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以权利要求书为保护范围。如图I-图2、图4所示，I-基底电极(玻碳电极)，2_多壁碳纳米管，3-EDC-NHS交联剂层，4-克伦特罗单克隆抗体层，5 - BSA层，6-工作电极(电化学修饰电极)，7-对电极，8-Ag/AgCl参比电极，9-检测池容器，10-电解液，11-电极支架。如图I-图2所示，在玻碳电极I表面修饰一层多壁碳纳米管2，通过EDC-NHS双功能团交联试剂3将克伦特罗单克隆抗体4固定在基底电极I表面，形成稳定的anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极6。利用循环伏 安、示差脉冲伏安、紫外吸收光谱、透射电镜可以对修饰电极6的电化学行为及物理性状等进行了表征。碳纳米管能提高电极的有效表面积，并加速电子的传递。因此，本实用新型用多壁碳纳米管2，选用多壁碳纳米管2 (MWCNTs)滴涂于玻碳电极I表面进行修饰。本实用新型中，氧化石墨烯是一种单层化的二维碳材料，表面含有大量的含氧基团，这些基团使其表面带负电荷，电荷之间的静电斥力可以使其稳定地分散在水相体系中，并且可利用双功能团交联试剂使其与带氨基的有机小分子克伦特罗发生化学反应。本实用新型首次公开了 Ag-GO-CLB纳米复合材料的制备方法，如图3所示。首先参照Hmnmers法通过氧化石墨粉合成氧化石墨烯。再利用硼氢化钠原位还原硝酸银合成了 Ag-GO纳米材料，最后通过EDC-NHS的交联作用制备了新型的Ag-GO-CLB纳米复合材料。将此复合材料应用于化学修饰电极，通过对银纳米粒子的电化学信号检测，实现了对克伦特罗的快速检测。Ag-GO-CLB纳米复合材料用于和自由CLB与抗体发生竞争性免疫反应。如图2所示，本实用新型电化学修饰电极的制备过程如下 I)玻碳电极I的预处理对基体电极I (玻碳电极)依次用0. 3和0. 05 um Al2O3粉末、清洁干净的麂皮上反复抛光至镜面后，水下冲洗，依次经0.2 mo I/L HCl溶液、0. 2 mo I/L NaOH溶液、乙醇、二次去离子水超声洗涤5min，电极I晾干后备用。2)多壁碳纳米管2 (MWCNTs)的修饰修饰前预先将碳纳米管羧基化，取IOML羧基化的碳纳米管DMF溶液，滴涂于处理后的GCE电极I表面，于室温反应lh，形成多壁碳纳米管2，用二次去离子水冲洗后在红外灯下烘干。3) anti-CLB 的修饰将上述修饰电极置于0.8 M EDC和0. IM NHS混合液中活化30min，用二次去离子水和PBS缓冲液冲洗后在红外灯下烘干。取2 ML 0. 75 mg/mL anti-CLB滴涂于电极表面，于37° C反应2 h，形成克伦特罗单克隆抗体层4。最后用1.0% BSA反应0.5 h，以涂覆的BSA层5封闭非特异性结合位点。得到的电化学修饰电极6用二次去离子水冲洗后于4° C保存待用。本实用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极的结构，如图I所示，基底电极为玻碳电极I，涂覆于玻碳电极I表面的是多壁碳纳米管2，最外层是克伦特罗单克隆抗体层4。本实用新型中，将MWCNTs和antiCLB依次修饰到基底电极I的表面，提高了电极的有效表面积，并加速电子的传递。以本实用新型这种结构的修饰电极作为工作电极检测样品中的克伦特罗，具有极其优异的检出效果。利用本实用新型电化学修饰电极检测克伦特罗，是基于如下原理检测是在0. lmol/L KCl溶液中进行的，溶液中的标记抗原Ag-GO-CLB和游离抗原竞争反应固定浓度的抗体，溶液中的自由抗原由于其位阻较小，更容易与抗体发生免疫反应，因此检测到标记抗原上的峰电流就会减小。因此可以通过峰电流的减小量间接地检测克伦特罗的含量。如图4所示，用于检测克伦特罗的检测装置包括工作电极6，即本实用新型用于检测克伦特罗的电化学修饰电极；对电极7，和参比电极8，设置在电解池7顶部的电极支架11 ;以及设置在电解池9底部的电解液10。在电极支架11上分布有工作电极6、对电极7和参比电极9。在电解池9中还含有电解液10，成分为10 mL 1.0 mo I/L KCl溶液。各电极的下端侵入到电解液中，上端分别与CHI660C电化学工作站(由上海辰华仪器公司提供)相连。利用本实用新型，具体检测方法为工作电极6为anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极，对电极7为钼丝，参比电极8为Ag/AgCl电极(饱和KCl)。取2ML Ag-GO-CLB与一定浓度的自由CLB混合共10ML，滴涂于修饰电极anti-CLB/MWCNTs/GCE表面，于37° C反应lh，将三电极置于10 mL 1.0 mo I/L KCl电解液中，实验采用示差脉冲伏安法(DPV)，电位扫描·范围从-0. 1-+0.3V，记录氧化峰处的峰电流。根据克伦特罗浓度与氧化峰电流减小量之间的线性关系，可以对克伦特罗进行定量检测。每次使用后，用二次蒸馏水将电极冲洗干净。·检测结果在上述条件下，利用DPV对不同克伦特罗浓度下银纳米粒子的氧化峰电流进行了检测，峰电流减小量(Ai)与克伦特罗的浓度对数值(Igc)成正比，图5为所制备的anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极在不同克伦特罗浓度下的DPV响应和工作曲线。从工作曲线可以得知，anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极对克伦特罗的检测范围为0. 01-10. 0 ng/mL，并且遵循以下方程式Ai = I. 1691gc+3. 39，线性相关系数为0. 9881，检测限达到6. 8pg/mL (信噪比=3:1)。anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极的特异性检测特异性检测方法采用三电极体系，工作电极采用anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极，对电极为钼丝，参比电极为Ag/AgCl电极(饱和KCl)，Ag-G0-CLB分别与0. I mg/ml CLB,
0.I mg/ml 莱克多巴胺(RAC),0. I mg/ml 多巴酹丁胺(D0B),0. I mg/ml 沙丁胺醇(SAL),以及混合液构成测试底液。实验采用差分脉冲伏安法(DPV)，电位扫描范围从-0. 1-+0. 3v,记录峰电流。每次使用后，用二次蒸馏水将电极冲洗干净。特异性检测结果anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极对克伦特罗具备特异性检测特性，检测结果如图6所示。经检测，利用anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极，其结构类似物及可能干扰物莱克多巴胺、多巴酚丁胺、沙丁胺醇对克伦特罗的检测基本无影响。对实际样品中克伦特罗进行检测使用标准加入法在猪尿样品中外加不同量的CLB标准品，分别使用本实用新型anti-CLB/MWCNTs/GCE修饰电极、ELISA和LC-MS法检测其浓度。比较修饰电极和ELISA、LC-MS法检测样品的结果，结果见以下表I。
权利要求1.一种用于检测克伦特罗的电化学修饰电极，其特征在于，所述电化学修饰电极包括 基底电极(I); 设置于基底电极(I)外表面的多壁碳纳米管(2)； 设置于多壁碳纳米管(2)外表面的EDC-NHS交联剂层(3)； 设置于EDC-NHS交联剂(3)外表面的克伦特罗单克隆抗体层(4)；以及 设置于克伦特罗单克隆抗体(4)外表面的BSA封闭剂层(5)。
2.一种用于检测克伦特罗的检测装置，其特征在于，所述检测装置为电解池(9);所述 电解池(9)包括 工作电极(6)，所述工作电极(6)是如权利要求I所述的电化学修饰电极； 对电极(7)； 參比电极(8)； 设置在电解池(9)顶部的支架(11)，所述支架(11)用于放置所述对电极(7)和參比电极(8);以及 设置在电解池(9 )底部的电解液(10 )。
3.如权利要求2所述的检测装置，其特征在于，所述工作电极(6)包括Ag-GO-CLB纳米复合材料层。
4.如权利要求2所述的检测装置，其特征在于，所述对电极(7)是钼电扱。
5.如权利要求2所述的检测装置，其特征在于，所述參比电极(8)是Ag/AgCl參比电扱。
专利摘要本实用新型公开了一种用于快速检测克伦特罗的修饰电极，包括基底电极；设置于基底电极外表面的多壁碳纳米管；设置于多壁碳纳米管外表面的EDC-NHS交联剂层；设置于EDC-NHS交联剂外表面的克伦特罗单克隆抗体层；以及设置于克伦特罗单克隆抗体外表面的BSA封闭剂层。本实用新型还公开了以所述修饰电极作为工作电极的检测装置。本实用新型修饰电极灵敏度高，选择性好，可用于检测克伦特罗，且采用环保材料，不会造成污染。
文档编号G01N27/26GK202649164SQ201220170238
公开日2013年1月2日 申请日期2012年4月20日 优先权日2012年4月20日
发明者白静, 赖彦君, 肖飞, 张苧丹, 鲜跃仲, 金利通 申请人:华东师范大学