用于帮助诊断中风的基于生物标记的方法和生物芯片的制作方法
【专利摘要】本发明提供了用于诊断怀疑遭受中风的患者的中风的基于生物标记的方法，以及还提供了用于区分缺血性中风和短暂性脑缺血发作的基于生物标记的方法。还描述了包括用于在本发明的方法中有用的生物标记的特定组合的探针的基质。
【专利说明】用于帮助诊断中风的基于生物标记的方法和生物芯片
【背景技术】
[0001] 中风是全球第三大致死原因，并且可被定义为由于脑部供血中断造成的快速发展 的脑功能损失。根据世界卫生组织统计，全球每年有1500万人遭受中风，其中500万人死亡 且还有500万人永久致残。高血压被估计是这1500万中风病例中的1270万病例的致病因 素。在英国，每年大约150000人遭受中风，并且每年中风造成大约53000例死亡。中风使 得仅英国经济就每年花费估计80亿英镑，并且中风患者占用了全部急救床位的大约20% 以及长期床位的25%。中风可被分类成三种子类型 ：
[0002] i)在脑部供血降低时发生缺血性中风（IS)，这造成脑部损伤。在血管变得堵塞 (通常经由血块）时发生缺血性中风。这一血块可在动脉粥样硬化斑块处局部形成（血栓 性中风），或者可由于血流中源自其他位置的游动颗粒或碎片而发生（栓塞性中风）。
[0003] ii)短暂性脑缺血发作（TIA)是在内部供血暂时降低时发生的'迷你中风'。如果 症状快速消退（在24小时内，个人恢复正常健康），则TIA被确诊；以及
[0004] iii)当血液在颅顶积聚时（通常是在弱化血管破裂时），溢血性中风（HS)发生。 溢血性中风可被分类成两个主要子类，即脑内（脑组织内）和蛛网膜下（脑表面周围及其 保护层之下）。
[0005] IS和TIA占所有中风病例的大约85%，而HS占15%。为了最小化中风后神经损 伤，中风患者被快速且准确地确诊以使得可以给予适当地治疗是关键的。例如，为了分解血 块，可以给予诸如组织纤维蛋白溶酶原激活剂（TPA)等溶栓治疗。然而，这样的治疗只在IS 中是被许可的而在HS中是有害的。TIA的性质不需要这样的治疗并且在这些情况下开出诸 如华法林和阿司匹林等血液稀释剂处方。
[0006] 当前，如果怀疑患有中风，则评估身体症状并且通常执行计算机断层（CT)扫描。 CT扫描具有用于标识HS患者的良好敏感性（大约90%敏感性）但具有用于标识IS和TIA 患者的很差敏感性（大约20%敏感性）。在实践中，对于TIA而言，由于其暂时的性质，最 小或没有组织损伤发生，因此CT扫描作为诊断技术是无效的。磁共振成像（MRI)具有用于 IS诊断的经改进的敏感性（上达大约80% )，但增加的时间要求、机器可访问性、以及高成 本限制了它被用于中风诊断。CT扫描来检测IS和TIA的很差敏感性意味着用于检测IS 和TIA的基于生物体液的诊断生物标记测试将会是帮助临床医生诊断中风子类型的无价 工具。基于生物体液的生物标记具有加快并提高中风诊断的准确性的潜力。
[0007] 已经提出了各种候选的生物标记来用于中风诊断和中风子类型描绘，并且现 有技术中存在这IS/TIA对HS区分的若干描述，例如EP1238284、W0 2010/086697、W0 2010/012834 以及 TO 2002/012892。
[0008] EP1419388公开了将IS与HS相区分以及将所有中风类型与非中风对照相区分的 数据。然而，迄今，无人发现在临床实践中的用途并且存在着对所有三个中风子类型的具有 用于启用准确诊断的高敏感性和特异性的生物标记的真实临床需求。
[0009] 此外，当前没有用于将IS与TIA区分开的生物标记。使用血液测试区分IS和TIA 会促进更有见识的临床决策，可能放弃不必要的昂贵且较不迅速的神经成像诊断，并且会 提高对可能需要溶栓治疗干预的患者的标识。
【发明内容】
[0010] 根据第一方面，本发明提供一种用于诊断怀疑患有中风的患者的中风的方法，包 括确定从该患者获得的体外样本中的至少两个生物标记的浓度，以及通过将每一生物标记 的浓度值与对应的对照值进行比较来确立生物标记的浓度的显著性，其中该至少两个生物 标记是从ICAM-1、L-选择素、P-选择素、VCAM-1、IL-6、sTNFRl、D-二聚体以及CRP中选择 的，并且其中这两个生物标记中的至少一个是从ICAM-1、L-选择素、P-选择素以及VCAM-1 中选择的。
[0011] 根据第二方面，本发明提供了一种基质，包括用于从ICAM-1、L-选择素、P-选择 素、VCAM-1、IL-6、sTNFRl、D-二聚体以及CRP中选择来用于根据本发明的第一方面的方 法的至少两个生物标记的探针，其中该基质包括用于ICAM-1、L-选择素、P-选择素以及 VCAM-1中的至少一个的探针。
[0012] 根据第三方面，本发明涉及将根据所述第二方面的基质用于根据所述第一方面的 诊断中风的方法中。
[0013] 根据第四方面，本发明提供了一种帮助诊断怀疑患有中风的患者的缺血性中风的 方法，包括：
[0014] i)确定在从患者获得的体外样本中VCAM-1和从h-FABP、IL-6以及CRP中选择的 一个或多个生物标记的浓度；以及
[0015] ii)通过将每一生物标记的浓度值与对应的对照值进行比较来确立生物标记的浓 度的显著性，其中对应的对照值是从获得自一个或多个短暂性脑缺血发作患者的体外样本 确定的对应生物标记的浓度值。这一方法可被用来区别性地诊断出缺血性中风和短暂性脑 缺血发作。
[0016] 根据第五方面，本发明提供了一种包括探针的基质，所述探针用于VCAM-1和从 h-FABP、IL-6以及CRP选择的至少一个其他生物标记来用于根据本发明的第三方面的方 法。
[0017] 根据第六方面，本发明涉及将根据所述第五方面的基质用于根据所述第四方面的 诊断中风的方法中。
【专利附图】
【附图说明】
[0018] 图1是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的VCAM-1的浓度的图 表；
[0019] 图2是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的ICAM-1的浓度的图 表；
[0020] 图3是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的E-选择素的浓度的 图表；
[0021] 图4是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的P-选择素的浓度的 图表；
[0022] 图5是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的L-选择素的浓度的 图表；
[0023] 图6是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的IL-6的浓度的图 表；
[0024] 图7是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的sTNFRl的浓度的图 表；
[0025] 图8是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的NGAL的浓度的图 表；
[0026] 图9是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的D-二聚体的浓度的 图表；
[0027] 图10是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的TM的浓度的图 表；
[0028] 图11是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的CRP的浓度的图 表；
[0029] 图12是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的h-FABP的浓度的 图表；
[0030] 图13是示出所有中风患者、每一中风子类型以及对照受验者的经稀释的CRP的浓 度的图表；
[0031] 图14是VCAM-1的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0032] 图15是ICAM-1的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0033] 图16是P-选择素的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0034] 图17是L-选择素的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0035] 图18是IL-6的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0036] 图19是sTNFRl的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0037] 图20是CRP的R0C曲线（所有中风对对照）；
[0038] 图21是NGAL的R0C曲线（所有中风对对照）；以及
[0039] 图22是D-二聚体的R0C曲线（所有中风对对照）。
【具体实施方式】
[0040] 本发明涉及可被用来快速诊断中风的基于生物标记的方法和生物芯片，并且还涉 及帮助区分三种中风子类型：。溢血性中风（HS)、缺血性中风（IS)以及短暂性脑缺血发作 (TIA)。
[0041] 除非另外指明，本文中对术语'中风'的所有引用涵盖了所有三种形式的中风。
[0042] 本文中对'怀疑患有中风的患者'或'患有中风'的引用包括怀疑当前遭受中风或 怀疑先前遭受过中风的患者。中风可以是最近事件，如发起了个人寻求临床帮助的过程的 事件。
[0043] 在本文中，术语"受验者"和"患者"可互换地使用并且指的是包括非灵长类（例 如，牛、猪、马、狗、猫、大鼠以及小鼠）和灵长类（例如，猴和人类）的哺乳动物。优选地，受 验者或患者是人类。
[0044] 如在本文中使用的，术语'生物标记'指的是从患者获得的生物样本中存在的分 子，其在所述样本中的浓度可指示病理状态。本文描述了已被发现（单独地或与其他诊断 方法相组合，或作为与其他生物标记相组合的补充性生物标记）有用于诊断中风和中风子 类型的各种生物标记。如在本文中使用的，术语'补充性生物标记'指的是可结合其他中风 生物标记来使用以支持诊断的生物标记。
[0045] 本领域中很好理解，生物标记正常或'背景'浓度可由于例如年龄、性别或人种/ 地理基因型而展现出微小的变化。结果，在本发明的方法中使用的临界值也可由于取决于 目标患者/人群的优化而稍微变化。
[0046] 从患者获得的生物样本优选地是血液、血清、或血浆样本。如本文中所使用的，术 语'体外'具有其在本领域中的普通意义，并且指的是已从患者的身体移除的样本。
[0047] 在从患者取得血液样本以供分析时，全部血液、血清或血浆被分析。对血液样本的 分析可以通过若干分析方法，如链接到预分离步骤的质谱分析（如色谱法）。优选的方法基 于免疫学检测。免疫学检测技术也容易地合并到便携式或手持式设备以供在临床环境之外 使用。诸如蛋白质印迹法（Western blot)或ELISA等定量免疫分析可被用来检测蛋白质 的量。一种优选的分析方法包括使用多分析物生物芯片，它使得能够同时检测并量化若干 蛋白质。2D凝胶电泳也是一种可被用于多分析物分析的技术。
[0048] 本发明的第一方面提供一种用于诊断怀疑患有中风的患者的中风的方法，包括确 定从该患者获得的体外样本中的至少两个生物标记的浓度，以及通过将每一生物标记的浓 度值与对应的对照值进行比较来确立生物标记的浓度的显著性，其中该至少两个生物标记 是从I CAM-1、L-选择素、P-选择素、VCAM-1、IL-6、sTNFR 1、D-二聚体以及CRP中选择的，并 且其中这两个生物标记中的至少一个是从ICAM-1、L-选择素、P-选择素以及VCAM-1中选 择的。
[0049] 优选地，该至少两个生物标记是从（i) ICAM-1或VCAM-1以及（ii)L-选择素或 P-选择素中选择的，并且更优选地，它们是ICAM-1和L-选择素。三个或更多生物标记的组 合也是优选的，因为它们示出了最高的敏感性和特异性。
[0050] 在优选实施例中，该方法还包括确定从IL-6、sTNFRl、D-二聚体以及CRP选择的一 个或多个生物标记的样本浓度。该方法还可包括确定h-FABP的样本浓度。
[0051] 为了避免疑惑，在本发明的这一方面的上下文中，'中风'指的是'所有中风'（即， 所有三种中风子类型）。
[0052] 优选的生物标记组合是在表1或表2中列出的那些。这些表提供了中风对对照的 不同生物标记组合的敏感性、特异性以及AUC数据。
[0053] 表 1
[0054]
【权利要求】
1. 一种用于诊断怀疑患有中风的患者的中风的方法，包括确定从所述患者获得的体 外样本中的至少两个生物标记的浓度，以及通过将每一生物标记的浓度值与对应的对照值 进行比较来确立所述生物标记的浓度的显著性，其中所述至少两个生物标记是从ICAM-1、 L-选择素、P-选择素、VCAM-1、IL-6、sTNFRl、D-二聚体以及CRP中选择的，并且其中所述 两个生物标记中的至少一个是从ICAM-1、L-选择素、P-选择素以及VCAM-1中选择的。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述至少两个生物标记是从（i)ICAM-l或 VCAM-1以及（ii)L-选择素或P-选择素选择的。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述至少两个生物标记是ICAM-1和 L-选择素。
4. 如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，还包括确定从IL-6、sTNFRl、D-二聚体 以及CRP选择的一个或多个生物标记的样本浓度。
5. 如任何前述权利要求所述的方法，其特征在于，还包括确定h-FABP的样本浓度。
6. 如任何前述权利要求所述的方法，其特征在于，所述患者和对照生物样本浓度值中 的每一个被输入到一个或多个统计算法以产生指示是否发生中风的输出值。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述统计算法包括逻辑回归方程。
8. 如任何前述权利要求所述的方法，其特征在于，两个或更多个生物标记的组合与表 1和2中列出的生物标记组合中的任一个相对应。
9. 如任何前述权利要求所述的方法，其特征在于，如果诊断出中风，则如权利要求16 到19中任一项所述的方法被执行以区别性地诊断出中风类型。
10. -种基质，包括用于从ICAM-UL-选择素、P-选择素、VCAM-l、IL-6、sTNFRl、D_: 聚体以及CRP中选择来用于权利要求1到9中的任一项的诊断患者中风的方法的至少两个 生物标记的探针，其中所述基质包括用于ICAM-UL-选择素、P-选择素以及VCAM-1中的至 少一个的探针。
11. 如权利要求10所述的基质，其特征在于，还包括用于h-FABP的探针。
12. 如权利要求10或11所述的基质，其特征在于，所述基质上固定有至少两个探针。
13. 如权利要求10到12中的任一项所述的基质，其特征在于，所述基质是生物芯片。
14. 一种基质在权利要求1到9中的任一项的诊断患者中风的方法中的用途，所述基质 包括用于从ICAM-1、L-选择素、P-选择素、VCAM-1、IL-6、sTNFRl、D-二聚体以及CRP中选 择的至少两个生物标记的探针，其中所述基质包括用于ICAM-1、L-选择素、P-选择素以及 VCAM-1中的至少一个的探针。
15. 如权利要求14所述的用途，其特征在于，所述基质还包括用于h-FABP的探针。
16. -种帮助诊断怀疑患有中风的患者的缺血性中风的方法，包括： i) 确定在从所述患者获得的体外样本中VCAM-1和从h-FABP、IL-6以及CRP中选择的 一个或多个生物标记的浓度；以及 ii) 通过将每一生物标记的浓度值与对应的对照值进行比较来确立生物标记的浓度的 显著性，其中对应的对照值是从获得自一个或多个短暂性脑缺血发作患者的体外样本确定 的对应生物标记的浓度值。
17. 如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法被用来区别性地诊断出缺血性 中风和短暂性脑缺血发作。
18. 如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述患者和对照生物样本浓度值中 的每一个被输入到一个或多个统计算法以产生指示是否发生缺血性中风的输出值。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述统计算法包括逻辑回归方程。
20. -种包括用于VCAM-1和从h-FABP、IL-6以及CRP选择的至少一个其他生物标记 来用于根据权利要求16到19中的任一项的帮助诊断患者的缺血性中风的方法的探针的基 质。
21. 如权利要求20所述的基质，其特征在于，所述基质上固定有所述探针。
22. 如权利要求20或21所述的基质，其特征在于，所述基质是生物芯片。
23. -种基质在根据权利要求16到19中的任一项的帮助诊断患者的缺血性中风的方 法中的用途，所述基质包括用于VCAM-1和从h-FABP、IL-6以及CRP选择的至少一个其他生 物标记的探针。 24. VCAM-1以及h-FABP、IL-6和CRP中的一个或多个作为缺血性中风的生物标记和/ 或作为缺血性中风和短暂性脑缺血发作之间的区分物的用途。
25. 如权利要求1-9和16-19中的任一项所述的方法，其特征在于，所述样本是血液、血 清或血浆样本。
【文档编号】G01N33/68GK104272112SQ201280068312
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2012年12月3日 优先权日:2011年12月2日
【发明者】J·莱蒙特, I·迈克耐尔, P·菲茨杰拉德 申请人:兰多士实验有限公司