专利名称：具有可控样品大小的测定装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及诊断测定领域，更具体地涉及侧向流测定，其中待测分析物存在于生物或非生物样品中。
背景技术：
诊断测定对于许多疾病的诊断、治疗和控制而言是普遍的且重要的。多年来已经开发了不同类型的诊断测定以便简化临床样品中的各种分析物的检测，所述临床样品诸如血液、血清、血浆、尿、唾液、组织活组织检查样品、粪便、痰、皮肤或咽喉拭子、以及组织样品或加工过的组织样品。在容易使用和生产低廉的同时，这些测定经常预期会产生快速的且可靠的结果。可以理解的是，难以在一个和同一个测定中满足所有这些要求。在实践中，许多测定受限于它们的速度。另一个重要的参数是灵敏度。测定技术的新近进展已经产生越来越灵敏的试验，所述试验允许检测痕量的分析物以及在尽可能早的时间检测样品中的疾病指示物。
一种常见类型的一次性测定装置包括:用于接收液体样品的区或区域、缀合区(也称作试剂区)和反应区(也称作检测区)。这些测定装置通常称作侧向流试验条。它们采用多孔材料(例如，硝酸纤维素)，所述多孔材料限定能够支持毛细管流的流体流动路径。实例包括在美国专利号5，559，041,5, 714，389,5, 120，643和6，228，660 (它们以引用方式全文并入本文)中所示的那些。
样品添加区经常由多孔的材料组成，所述材料能够吸附样品，并且当需要分离血细胞时也可有效地捕集红血细胞。这类材料的实例是纤维材料(诸如纸、羊毛状物、凝胶或组织)，其包含例如纤维素、毛料、玻璃纤维、石棉、合成纤维、聚合物或它们的混合物。
另一类测定装置是具有用于诱导毛细管流的突出物的无孔测定装置。这类测定装置的实例包括在 PCT 国际公开号 WO 2003/103835、W02005/089082、WO 2005/118139 和 W2006/137785(它们以引用方式全文并入本文)中公开的开放式侧向流装置。
一种已知的无孔测定装置显示在图1中。测定装置I具有至少一个样品添加区2、试剂区3、至少一个检测区4和至少一个芯吸区5。所述各区形成流动路径，样品通过所述流动路径从所述样品添加区流至所述芯吸区。还包括:在检测区4中的捕获元件(诸如抗体)，所述捕获元件能够结合分析物并任选地沉积在所述装置上(诸如通过包被)；和也能够参与反应的标记的缀合物材料，所述反应将实现分析物浓度的测定，所述缀合物材料沉积在所述装置上的试剂区中，其中所述标记的缀合物材料携带标记，所述标记用于在检测区中进行检测。所述缀合物材料随着样品流过试剂区而溶解，从而形成溶解的标记的缀合物材料和样品的缀合物羽流，所述缀合物羽流向下游流至检测区。随着所述缀合物羽流流入检测区中，所述缀合的材料将被捕获元件捕获，诸如通过缀合的材料和分析物的复合物(如在“夹心”测定中)或直接地捕获(如在“竞争性”测定中)。未结合的溶解的缀合物材料将被清扫经过检测区进入至少一个芯吸区5。在图1中也显示了突出物或微柱7。
一种仪器，诸如在美国专利公开号US20060289787A1和US20070231883A1和美国专利号7，416，700和6，139，800 (它们以引用方式全文并入本文)中公开的仪器，能够检测所述检测区中的结合的缀合材料。常见的标记包括可以被仪器检测出的荧光染料，所述仪器会激发所述荧光染料并包含能够检测所述荧光染料的检测器。
图1所示的这种典型测定装置的样品大小通常是在200 U I的规模。这样的样品大小需要医学专业人员(诸如刺络医师)采集静脉血。存在日益增加的对侧向流装置的需求，所述侧向流装置能够与显著更小的样品大小一起工作，以适应从所谓的“手指针刺”采血可得到的血液量，后者经常是在25 Ul或更小的规模。这样的少量样品是用刺血针刺破指尖以后一滴血的血量。家用血糖仪通常使用以这种方式得到的一滴血来提供血液中的葡萄糖水平。这种更小的样品大小不需要医学专业人员来采血，并且会使提供分析样品的患者感到更舒适。
为了减小所需的样品大小，减小侧向流测定装置的尺寸以适应更小的样品大小。但是，已经发现，减小样品大小和所述装置的尺寸会在检测区中提供不足的缀合物，并因此提供更少的仪器可读取的信号(在有些情况下，信号降低多达5倍)和较差的灵敏度。据信检测区中不足的缀合物是由于减小的样品大小和所述装置中的样品的低效利用以及其它条件。减小尺寸的另一个缺点是，检测区的宽度也将减小，这再一次提供更少的可供仪器读取的信号。并且，已经发现，更小的装置具有减少的流出时间和缀合物材料接触时间，从而导致样品中的分析物和缀合物材料之间更少的结合。
仍然需要更小样品体积的测定装置，其可以适应越来越小的样品大小且可以适应各种样品(诸如全血)，并且可以提供具有所需的灵敏度和特异性的结果。发明内容
本发明涉及这样一种测定装置。根据主题发明的更小样品装置的一个优点是，使用“中断洗液”来控制样品体积的能力。在它的最广概念中，所述中断洗液可以是任意流体。流体包括试剂流体(含有试剂的流体)，一种优选的中断流体是冲洗流体。以预定的填充体积将中断冲洗流体加到芯片装置上，所述芯片装置控制样品体积以及用于洗涤检测通道和填充剩余的芯片体积。
因此，本发明的一个方面涉及一种测定装置，所述测定装置包括:液体样品添加区；含有试剂材料的试剂区，其位于所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通；与所述试剂区流体连通的检测区，具有与其结合的捕获元件；和与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力。在所述装置中，所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径。所述装置还包括沿着流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通的试剂添加区，所述试剂添加区位于所述样品添加区的下游且位于所述检测区的上游。根据主题发明的方法，将“中断洗液”添加在该试剂添加区(在它的最广概念中，流体添加区)处。
本发明的另一个方面因而涉及一种控制测定装置中的样品大小的方法，所述方法包括:提供液体样品添加区；提供含有试剂材料的试剂区，其位于样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通；提供与所述试剂区流体连通的检测区；和提供与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力。所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径。所述方法还包括提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通，其位于所述样品添加区的下游且位于所述检测区的上游。所述方法还包括:给所述样品添加区添加样品，其中所述样品移动穿过所述流体流动路径；和给所述试剂添加区添加试剂，其中所述试剂中断穿过所述流体流动路径的样品流，从而控制在所述流体流动路径内的样品大小。优选地，添加的试剂是冲洗流体。
本发明的另一个方面涉及为了检测一种或更多种目标分析物而对液体样品进行测定的方法，所述方法包括:提供液体样品添加区；提供含有试剂材料的试剂区，其位于样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通；提供与所述试剂区流体连通的检测区；提供与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径；并且还提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通，其位于所述样品添加区的下游并位于所述检测区的上游。所述方法还包括:将含有目标分析物的液体样品添加到所述样品添加区上；通过毛细管作用，使所述样品移动进入所述试剂区，其中所述样品溶解所述试剂材料；通过毛细管作用，使所述样品与溶解在其中的试剂材料一起从所述试剂区流入所述检测区，其中通过读取产生的信号，在所述检测区中检测所述目标分析物；和使所述样品和任何未结合的材料流入所述芯吸区中。所述方法还包括:给所述试剂添加区添加试剂，其中所述试剂中断穿过所述流体流动路径的样品流，从而控制在所述流体流动路径内的样品大小。优选地,添加的试剂是冲洗流体。
本领域技术人员通过详细考虑下面的优选实施方案，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。
图1显示了一种已知的测定装置。
图2显示了根据本发明的一个实施方案的测定装置的示意图。
图3显示了根据本发明的另一个实施方案的测定装置的示意图。
图4显示了根据本发明的测定装置包装件的分层构造的分解图。
图5显示了在根据本发明的一个实施方案的测定装置上的全血的平均流动时间，其中将不同的表面活性剂沉积在所述样品添加区中。
图6显示了使用全血用中断洗液方案得到的卡马西平的剂量响应曲线与用血浆得到的结果的对比。
图7显示了使用全血用中断洗液方案得到的苯巴比妥的剂量响应曲线与用血浆得到的结果的对比。
图8显示了含有不同NTproBNP水平的全血的平均流动时间，其中在根据本发明的一个实施方案的测定装置上进行后续冲洗。
图9显示了荧光应答的平均峰面积相对于每个试验样品的NTproBNP浓度的关系，以及用全血样品得到的剂量响应曲线与类似NTproBNP浓度的血清样品的对比，其中在根据本发明的一个实施方案的测定装置上进行后续冲洗。
图10和11显示了使用NTproBNP作为分析物时不同的测定装置设计的灵敏度。
图12是使用全血样品和洗液时降钙素原浓度相对于平均峰面积的图。
图13是使用全血样品时降钙素原浓度相对于平均峰面积的图。
具体实施方式
在本说明书和随附权利要求书中使用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指明。
在整个说明书和权利要求书中，与数值结合使用的术语“约”是指本领域技术人员熟悉和接受的准确度的范围。所述范围优选地是±10%。
术语“样品”在本文中是指一定体积的液体、溶液或混悬液，意图定性地或定量地确定它的任一种性质，诸如组分是否存在、组分的浓度等。在本发明范围内的典型样品是人或动物体液，诸如血液、血浆、血清、淋巴液、尿、唾液、精液、羊水、胃液、痰(phlegm，sputum)、粘液、泪水、粪便等。其它类型的样品源自人或动物组织样品，其中所述组织样品已被加工成液体、溶液或混悬液，以显示特定组织组分用于检查。本发明的实施方案适用于所有身体样品，但是优选地适用于全血、尿或痰的样品。
在其它情况下，所述样品可以与食品检验、食品检验、生物威胁或生物危害检验等有关。这仅仅是可以用于本发明中的样品的少量实例。
在本发明中，基于样品的侧向流和存在于样品中的组分与试剂(其存在于装置中或在操作过程中加入装置中)的相互作用以及这种相互作用的检测(定性地或定量地)的测定，可以用于任何目的，诸如诊断目的。这样的试验经常称作侧向流测定。
诊断测定的实例包括但不限于:测定不同障碍(例如慢性代谢障碍)特有的分析物(也称作标志物)，诸如血糖、血酮、尿葡萄糖(糖尿病)、血液胆固醇(动脉粥样硬化、月巴胖等)；其它特定疾病(例如急性疾病)的标志物，诸如冠状动脉梗塞标志物(例如肌钙蛋白-T、NT-pix)BNP)、甲状腺功能的标志物(例如测定促甲状腺激素(TSH))、病毒感染的标志物(侧向流免疫测定用于检测特定病毒抗体的用途)；等等。
另一个重要领域是伴侣诊断领域，其中将治疗剂(诸如药物)施用给需要此类药物的个体。然后进行适当的测定以确定适当的标志物水平，从而确定所述药物是否具有其预期效应。可替换地，本发明的测定装置可在施用治疗剂之前使用以确定所述药剂是否将帮助有需要的个体。
另一个重要领域是药物试验领域，以用于容易地且快速地检测药物和指示药物滥用的药物代谢物；诸如测定特定药物和在尿样品中的药物代谢物(例如THC)等。
术语“分析物”用作术语“标志物”的同义词，并且意图包括定量地或定性地测量的任何化学或生物学物质，并且可包括小分子、蛋白、抗体、DNA、RNA、核酸、病毒组分或完整的病毒、细菌组分或完整的细菌、细胞组分或完整的细胞和它们的复合物和衍生物。
在本说明书、实施例和权利要求书的范围内，术语“区”、“区域”和“部位”用于定义在基质上的流体流动路径的部件，无论是在现有技术装置中，还是在根据本发明的一个实施方案的装置中。
术语“反应”用于定义这样的任何反应:其发生在样品组分和在基质表面上或内部的至少一种或多种试剂之间，或发生在存在于样品中的两种或更多种组分之间。术语“反应”特别地用于定义发生在分析物和试剂之间的反应，所述反应作为所述分析物的定性或定量测定的一部分。
术语“基质”是指这样的载体或基体:向其添加样品，在其表面上或在其内部进行测定，或在该处发生分析物和试剂之间的反应。
本发明涉及一种侧向流测定装置，其用于确定至少一种分析物的存在或量。图2和3显示了根据本发明的这种装置的优选实施方案的示意图。所述测定装置10具有:至少一个样品添加区20、至少一个试剂区30、至少一个检测区40和至少一个芯吸区50。所述各区形成流动路径，样品通过所述流动路径从所述样品添加区流至所述芯吸区。所述测定装置还包括至少一个试剂添加区35，其优选地位于所述试剂区和所述检测区之间。
所述测定装置的部件(即，所述装置的物理结构，不论是否是与所述装置的其它部件分离的部件)可以由共聚物、掺合物、层压材料、镀金属箔、镀金属膜或金属制成。可替换地，装置部件可以由沉积在下述材料之一上的共聚物、掺合物、层压材料、镀金属箔、镀金属膜或金属制成:多元烯烃、聚酯、含有苯乙烯的聚合物、聚碳酸酯、丙烯酸聚合物、含氯聚合物、缩醛同聚物和共聚物、纤维质和它们的酯、硝酸纤维素、含氟聚合物、聚酰胺、聚酰亚胺、聚甲基甲基丙烯酸酯、含硫聚合物、聚氨酯、含硅聚合物、玻璃和陶瓷材料。可替换地，装置部件用塑料、弹性体、胶乳、硅片或金属制成；所述弹性体可包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、硅弹性体或胶乳。可替换地，装置部件可以由胶乳、聚苯乙烯胶乳或疏水聚合物制成；所述疏水聚合物可包括聚丙烯、聚乙烯或聚酯。可替换地，装置部件可包括特氟隆 、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或聚碳酸酯。可替换地，装置部件由能够浮雕、碾磨或注射模塑的塑料制成，或从铜、银和金膜(其上面可以吸附不同的长链烷烃硫醇)的表面制成。能够碾磨或注射模塑的塑料的结构可包括聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚丙烯酸酯。在一个特别优选的实施方案中，所述测定装置由环烯烃聚合物(诸如以名称Zeonor 销售的那些)注射模塑而成。优选的注射模塑技术参见美国专利号6，372，542,6, 733，682,6, 811，736、6，884，370和6，733，682，它们以引用方式全文并入本文。
所述流动路径可包括开放式或封闭式路径、槽和毛细管。优选地，所述流动路径包括具有邻接突出物的侧向流路径，所述突出物具有使得毛细管流持续穿过流动路径的大小、形状和彼此间距。在一个实施方案中，所述流动路径是在基质内的通道中，所述通道具有底表面和侧壁。在该实施方案中，所述突出物从所述通道的底表面伸出。所述侧壁可以促成或不促成液体的毛细管作用。如果所述侧壁不促成液体的毛细管作用，那么可以在最外侧突出物和侧壁之间提供间隙以保持液体被包含在由所述突出物限定的流动路径中。图1显不了关出物7。
在一个实施方案中，所述流动路径是至少部分地开放的。在另一个实施方案中，所述流动路径是完全开放的。“开放”是指在毛细管距离处没有盖或罩。因而，盖(如果存在的话，作为流动路径的物理保护)不会促成在流动路径中的毛细管流。开放式侧向流路径参见例如下述 PCT 国际公开号 WO 2003/103835、WO 2005/089082、WO 2005/118139、WO 2006/137785和WO 2007/149042，它们以引用方式全文并入本文。所述突出物具有高度(H)、直径(D)和突出物之间的一个或多个距离(tl，t2)，从而在所述区中实现流体(诸如血浆，优选地人血浆)的侧向毛细管流。这些尺寸参见美国专利公开号2006/0285996，它以引用方式全文并入本文。除了优化上述高度、直径和突出物之间的一个或多个距离以外，所述突出物可以具有所需的化学、生物学或物理学官能团，例如通过修饰所述突出物的表面。在一个实施方案中，所述突出物具有:在约15至约150iim、优选约30至约IOOiim区间内的高度，约10至约160 u m、优选约40至约100 u m的直径，和彼此相距约3至约200 u m、优选约5至约50 ii m或约10至约50 ii m的突出物之间的一个或多个距离。所述流动通道可以具有:约5至约500mm、优选约10至约IOOmm的长度，约0.3至约10mm、优选约0.3至约3mm、优选约0.5至约1.5mm和优选约0.5至约1.2mm的宽度。
尽管大部分检测将发生在所述流体流动路径的检测区部分中，但检测也可能发生在所述装置的其它部分中。例如，非侵入性的、非反应性的样品完整性测量可以发生在所述样品区和所述试剂区或试剂添加区之间，优选地在过滤元件(如果存在的话)之后。其它测量可包括空白读数，双部分反应序列的一个部分用于测量血红蛋白和糖化的血红蛋白，用于测定HbAlc等。
所述液体样品区(也称作液体样品添加区)接收来自样品分配器(诸如移液器)的样品。所述样品通常沉积在所述区的顶面上。所述样品添加区能够将液体样品从所述样品的放置点运输至所述试剂区，其中穿过任选的过滤器和试剂添加区，优选地穿过毛细管流。毛细管流诱导结构可包括多孔材料，诸如硝酸纤维素，或优选地通过突出物，诸如微柱，如图1所示。在可以使用手指针刺体积的血液的那些装置中，所述样品可以从手指直接触取，或通过诸如描述在题目为 “Controlling Fluid Flow Through An Assay Device”的共同未决的申请(美国临时申请号61/588，772，2012年I月20日提交，代理人案卷号⑶S5112USPSP ;第一发明人James Kanaley,以引用方式全文并入本文)中的毛细管移液器。
过滤材料(图4)可以沉积在所述样品添加区中，以过滤来自样品的微粒，或过滤来自血液的红血细胞，使得血浆可以更远地移动穿过所述装置。
试剂区位于所述样品添加区和所述检测区之间。所述试剂区可包括集成在分析元件中的试剂，并且通常是在反应中有用的试剂(结合配偶体，诸如用于免疫测定的抗体或抗原、用于酶测定的基质、用于分子诊断测定的探针)，或者是辅助材料，诸如稳定化集成的试剂的材料、抑制干扰反应的材料等。一般而言，在反应中有用的试剂之一携带下面讨论的可检测信号。在有些情况下，所述试剂可以与分析物直接地或者通过一系列反应进行反应以形成可检测信号，例如但不限于使用光谱法可检测的分子，诸如有色分子或荧光分子。在维持相同试剂宽度的同时，通过沉积在所述装置中的试剂的长度可以调节所述试剂区中的试剂的量。在维持长度的同时，通过改变宽度也可以调节所述试剂的量。通过同时改变宽度和长度可进一步调节所述试剂的量。在一个优选的实施方案中，所述试剂区包括缀合物材料。术语缀合物是指携带检测元件和结合配偶体的任意部分。
检测元件是在它的物理分布或/和发送的信号的强度方面可检测出的试剂，例如但不限于发光分子(例如荧光剂、发磷光剂、化学发光剂、生物发光剂等)、有色分子、反应后产生颜色的分子、酶、放射性同位素、表现出特异性结合的配体等。检测元件(也称作标记)优选地选自:生色团、荧光团、放射性标记和酶。从提供多种用于标记抗体、蛋白质和核酸的染料的商业供应商可以获得合适的标记。例如，存在实际上跨越整个可见光谱和红外光谱的突光团。合适的突光或磷光标记包括例如但不限于突光素、Cy3、Cy5等。合适的化学发光标记是例如但不限于鲁米诺(Iuminol)、cyalume等。
类似地，放射性标记可商购获得，或者可合成检测元件，使其结合有放射性标记。合适的放射性标记为例如但不限于放射性的碘和磷；例如125I和32P。
合适的酶标记为例如但不限于辣根过氧化物酶、P -半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶等。
在下述情况下，2种标记是“可辨别的”:它们可以单独地检测，优选地同时定量，并且彼此没有显著的妨碍、干扰或淬灭。可使用两种或更多种标记，例如，当检测多种分析物或标志物时。
结合配偶体是可以形成复合物的材料，所述复合物可用于确定分析物的存在或量。例如，在“夹心”测定中，在缀合物中的结合配偶体可以形成包括分析物和缀合物的复合物，并且所述复合物可进一步结合集成在检测区中的其它配偶体(也称作捕获元件)。在竞争性免疫测定中，分析物将会干扰缀合物中的结合配偶体与集成在检测区中的其它结合配偶体(也称作捕获元件)的结合。在缀合物中包含的实例结合配偶体包括:抗体、抗原、分析物或分析物模仿物、蛋白等。
试剂添加区位于所述流体流动路径中，在所述试剂区之前或之后，并且在所述检测区之前。所述试剂添加区35显示在图3中。在它的最广概念中，所述试剂添加区是流体添加区。这样的流体可以是试剂流体，优选地是冲洗流体。所述试剂添加区可以允许从装置外面添加试剂。更具体地，使用所述试剂添加区添加中断试剂，所述中断试剂可用于将存在于所述流体流动路径中的样品和其它未结合的组分冲洗进入所述芯吸区中。在一个优选的实施方案中，所述试剂添加区35位于所述试剂区30之后(参见图3)。
来自所述试剂区的试剂羽流应当尽可能宽以覆盖尽可能多的检测区宽度。一种用于增加试剂羽流宽度的方法参见:题目为“Assay Device Having Multiple ReagentCells”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，738，2012年I月20日提交，代理人案卷号CDS5104USPSP ;第一发明人:Zhong Ding)，它以引用方式全文并入本文。总之，在试剂区中的多个具有试剂材料的区域(在下文中称作“试剂池”)与用于将多个试剂池产生的多个流动流重组为一个流动流的元件一起，在所述流动流离开所述试剂区并进入所述检测区的同时产生更理想地混合的、更宽的试剂羽流。
检测区位于所述液体样品区和所述试剂区的下游并且与所述样品添加区流体连通。所述检测区可包括突出物，诸如上述那些。也如上面指出的，这些突出物优选地集成地模铸(诸如注射模塑或浮雕)在基质中，所述基质由光学塑料材料诸如Zeonor制成。就常规尺寸装置而言，在所述检测区中的流动通道的宽度通常是在2_的规模，但是，一些更小体积的装置，诸如在上面和在题目为“Lower Volume Assay Device Having IncreasedSensitivity”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，758，2012年I月20日提交，代理人案卷号⑶S511IUSPSP ;第一发明人:Phil Hosimer,以引用方式全文并入本文)中描述的那些，明显地更狭窄,例如，1.5mm或更小。
所述检测区是读取任何可检测信号的区域。在一个优选的实施方案中，捕获元件与所述检测区中的突出物相连。所述捕获元件可包括如上所述的缀合物或含有缀合物的复合物的结合配偶体。例如，如果分析物是特定蛋白，那么所述缀合物可以是抗体，所述抗体将特异性地结合联接至检测元件(诸如荧光探针)上的该蛋白。所述捕获元件则可以是也特异性地结合该蛋白的另一种抗体。在另一个实施例中，如果标志物或分析物是DNAjP么所述捕获分子可以是但不限于合成的寡核苷酸、其类似物或特定抗体。其它合适的捕获元件包括:对待测分析物特异性的抗体、抗体片段、适体和核酸序列。合适的捕获元件的一个非限制性实例是携带抗生物素蛋白官能团的分子，其可以结合含有生物素官能团的缀合物。
所述检测区可包括多个检测区。所述多个检测区可用于包括一种或更多种标志物的测定。在多个检测区的情况下，所述捕获元件可包括多个捕获元件，诸如第一捕获元件和第二捕获元件。
所述缀合物可以被预沉积在所述测定装置上，诸如通过包被在所述试剂区中。类似地，所述捕获元件可以被预沉积在所述测定装置上，预沉积在所述检测区上。优选地，所述检测和捕获元件都分别被预沉积在所述测定装置上、所述试剂区上和检测区上。
在样品已经递送至样品区后，它将遇到试剂区。在所述样品已经流过所述试剂区和任选的试剂添加区并与它们相互作用以后，在流体流中将含有所述样品和试剂羽流。所述试剂羽流可含有:在所述反应区中已经溶解的任何试剂材料，或在所述试剂添加区中添加的那些材料。所述试剂羽流可包括具有检测元件和结合配偶体的缀合物；在这种情况下，它经常称作缀合物羽流。
芯吸区位于所述检测区的下游并与所述检测区流体连通。所述芯吸区是这样的测定装置区域:其具有接收流动路径中的液体样品和任意其它材料(例如，未结合的试剂、冲洗流体等)的能力。所述芯吸区会提供毛细管力，以继续移动所述液体样品穿过所述检测区并离开。所述芯吸区可包括多孔材料诸如硝酸纤维素，或者可以是无孔结构诸如本文所述的突出物。所述芯吸区还可包括非毛细管流体驱动装置，诸如使用蒸发加热或泵。用于根据本发明的测定装置中的芯吸区的其它细节可以参见美国专利公开号US2005/0042766和US 2006/0239859，它们二者通过引用以它们的整体并入本文。芯吸区也参见题目为“Controlling Fluid Flow Through An Assay Device” 的共同未决的专利申请(美国临时申请号61/588，772，2012年I月20日提交，代理人案卷号CDS5112USPSP ;第一发明人:James Kanaley),该专利以引用方式全文并入本文。
优选地，包括所述样品添加区、所述检测区和所述芯吸区在内的整个流动路径包括突出物，所述突出物相对于基质基本上竖直，并且具有能够在所述流动路径中建立样品的侧向流的高度、直径和倒易间距。
在任一上述实施方案中，所述装置优选地为一次性的测定装置。所述测定装置可被包含在外壳中以便于操作和保护。如果所述测定装置被包含在这样的外壳中，所述外壳将优选地包括用于给所述测定装置添加样品的孔。
本发明的测定装置可以与用于读取在本发明测定装置上进行的测定结果的装置(读数器)一起使用。所述读数器包括:用于读取由检测元件发射或反射的信号的装置诸如光检测器，和用于计算所述信号和显示结果的装置诸如微处理器，所述微处理器可被包括在集成式读数器内或在单独的计算机上。合适的读数器参见例如美国专利公开号2007/0231883和美国专利号7，416，700，它们二者以引用方式全文并入本文。
另一个实施方案是读取在测定装置上进行的测定结果的装置，其中所述装置包括检测器，所述检测器能够读取从存在于所述测定装置的规定位置上的至少一个检测元件发射或反射的信号。在上述实施方案中的任一个中，读数优选地选自颜色、荧光、放射性或酶活性的检测和/或定量。
本发明的另一个方面涉及为了检测一种或更多种目标分析物而对液体样品进行测定的方法。含有所述目标分析物的液体样品沉积在所述测定装置的样品添加区上，诸如穿过所述装置的外壳中的孔；或者就手指针刺采血而言，通过使手指直接触到所述样品添加区上再离开。所述样品通过毛细管作用移动穿过任选的过滤器，并进入试剂区，在这里它溶解试剂材料。在一个优选的实施方案中，就夹心型测定而言，使样品与检测元件直接地或间接地(诸如通过抗体)反应。随着样品流入检测区，所述具有溶解的试剂羽流的样品流出所述试剂区。
接着，所述样品通过毛细管作用移动进入检测区中。在所述检测区中，产生代表分析物或对照物的信号。在一个优选的实施方案中，在所述检测区中捕获所述样品或一种或多种具有检测元件的试剂，诸如通过在所述检测区的表面上的抗体，并生成代表分析物或对照物的存在或浓度的信号。然后使用如上所述的读数器或检测仪器读取在所述检测区中生成的信号以确定分析物或对照物的存在或浓度。所述样品从所述检测区移出并进入芯吸区。所述读数器可以在所述样品已经移动穿过所述检测区之后立即地或在短时间内读取所述信号。并且，在样品穿过测定装置以后，可进行一次或更多次冲洗以将任何未结合的试剂(诸如检测元件)冲离所述检测区。
根据本发明的一个实施方案的方法、测定装置和读数器具有许多优点。“中断洗液”概念可以与诸如在下述文献中描述的各种测定装置一起使用:题目为“Low VolumeAssay Device Having Increased Sensitivity”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，758，代理人案卷号 CDS5111USPSP ;第一发明人=Phil Hosimer)，题目为 “AssayDevice Having Multiple Reagent Cells”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，738,代理人案卷号⑶S5104USPSP ;第一发明人:Zhong Ding),题目为“Assay Device HavingUniform Flow Around Corners”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，745,代理人案卷号 CDS5110USPSP ;第一发明人:James Kanaley),题目为 “Controlling FluidFlow Through An Assay Device”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，772,代理人案卷号 CDS5112USPSP,第一发明人:James Kanaley)，和题目为 “Assay DeviceHaving Multiplexing”的共同未决申请(美国临时申请号61/588，779,代理人案卷号CDS5113USPSP ;第一发明人:Sue Danielson)，都于2012年I月20日提交，并且以引用方式全文并入本文。
根据主题发明的测定装置可以如图4所示进行包装。包装100包括测定执行必需的所有功能元件，诸如:顶盖120、过滤器130、亲水带140、测定装置(芯片)150和底盖160。
应当理解，本发明不限于本文所示的具体实施方案。提供下面的实施例用于例证目的，并且无意限制本发明的范围，因为本发明的范围仅受随附权利要求及其等同方案限制。
实施例
实施例1
使用由Zeonor(Zeon,日本)制成的塑料基质芯片，其具有在表面上的氧化葡聚糖，所述氧化葡聚糖用于通过希夫碱偶联而共价地固定化蛋白。就NTproBNP芯片而言,放置荧光标记的抗-NT-proBNP单克隆抗体，并干燥，以建立试剂区。放置抗-NT-proBNP单克隆抗体，并干燥，以建立检测区。将少量Triton X-45沉积在所述装置上以增加样品的润湿性以实现更好的毛细管流。将样品加入所述装置的样品区，微柱阵列的毛细管作用分配所述样品穿过流动通道进入芯吸区。典型的测定时间是约10分钟。在原型线照射的荧光扫描仪中，记录所述检测区中的荧光标记的复合物的信号强度。就卡马西平芯片而言，通过使卡马西平半抗原和荧光标记与牛血清白蛋白(BSA)共价地连接，制备卡马西平检测试剂。通过使苯巴比妥半抗原和荧光标记与BSA共价地连接，制备苯巴比妥检测试剂。放置单克隆卡马西平和苯巴比妥抗体，并干燥，以建立所述检测区。将不同水平的NTproBNP、卡马西平和苯巴比妥掺入人血清中，以产生数据。实验使用减小体积的芯片设计(诸如图2所示)和减小体积的减小台面面积的芯片设计(诸如图3所示)。
在本发明的第一实施方案中，将得自手指针刺样品的全血直接地施加于试验装置上的过滤器上，以使红血细胞与血浆分离。所述血浆从所述过滤器流至在微柱样品区内的毛细管间隙，通过毛细管流前进至流体流动路径的末端。过滤膜与所述样品区的微柱表面的接触对于血浆从所述膜流动而言是重要的。在发生接触的情况下，在所述微柱结构内的毛细管力会从所述膜芯吸血浆，以建立血浆流。
在现有技术芯片设计中，将200uL全血施加于过滤器，尽管测定仅需要约35uL血浆。总样品利用效率仅为17.5%。
本发明意图与在减小体积的芯片设计和减小体积的减小台面面积的芯片设计上的仅25uL全血一起使用。为了获得测定所需的9uL血浆，25uL全血样品(具有45%血细胞比容)的过滤效率必须是至少36%。
在所述装置的另一个实施方案中，可将全血直接地施加于微柱表面上，无需使用过滤膜将血浆与红血细胞分离。由于全血的粘度显著大于血清或血浆，在微柱间隙内的流动阻力也显著更大，这会导致非常缓慢的流动或流动阻滞。并且，由于患者之间的血细胞比容差异较大，全血的粘度可以宽泛地变化。为了实现全血在微柱间隙内的连贯流动，需要减小流动阻力或增加毛细管力的方法。
在该实施方案中，如下促进全血在微柱间隙内的流动:在减小体积的芯片设计和减小体积的减小台面面积的芯片设计的样品添加区中或附近，加入小体积(IuL或更少)的溶液，所述溶液含有非溶血性的、非离子的、良好润湿的表面活性剂。加入该预湿溶液以后，立即将10-15 y L全血直接加入样品添加区。含有表面活性剂的溶液起降低表面张力的作用，并防止红血细胞在流体锋线处聚集。在微柱结构内的毛细管力推动全血流穿过试剂(缀合物)区，向下到达检测(反应)通道，并进入芯吸区。
在检测(反应)通道上面添加亲水带会增加微柱间隙内的毛细管力，并用于进一步改善全血在芯片中的流动。在全血存在下，发生检测缀合物和捕获免疫材料与靶分析物的反应。但是，由于红血细胞会干扰检测缀合物的光学测量，因此在进行读取之前必须除去它们。这通过在最后读取之前添加冲洗步骤来实现。
根据主题发明的方法使用中断洗液来控制样品体积以及从检测区(通道)除去红血细胞和其它干扰物。如下控制样品体积:在血液样品已经填充芯吸区至预定水平时，加入冲洗流体。由于所述微柱结构被设计成以均匀方式逐行填充，可以手工地或通过仪器监测流动，以确定样品已经填充芯片至目标体积的时刻。当达到目标样品体积时，在图2(对于减小体积的芯片设计)或图3 (对于根据主题发明的减小体积的减小台面面积芯片设计)所示的检测通道的上游位置处，将冲洗流体加入微柱通道。
施加10-15ii L的冲洗流体微滴，以建立圆顶形微滴，其在两个方向流动，以从下游检测(反应)通道有效地除去样品，并防止在上游柱间隙中的样品进入检测(反应)通道。
所述冲洗流体通常由0.1M磷酸钠、1%牛血清白蛋白和0.1%表面活性剂组成。为了降低表面张力以允许流体通过毛细管力进行流动，在微柱间隙中到处需要表面活性剂。就现有技术芯片设计而言，Triton X-45已经成为优选的表面活性剂，将其沉积在所述微柱芯片的样品区中，并干燥。为了使全血在芯片中连贯地流动，在所述样品区中放置TX-45并非最佳的。经证实，几种其它的非离子表面活性剂会提高全血在微柱芯片中的流速。图5显示了在减小体积的芯片设计(将不同的表面活性剂沉积在所述样品添加区中)中全血到达芯吸区起点所需的平均流动时间和到达芯吸区末端所需的时间。结果表明，与TX-45相t匕，在使用测试的所有表面活性剂时，全血更快地流动。
使用单一全血样品得到了这些结果。因为全血可以随人员不同而极大地变化，预见到流速的较大变异。样品的血细胞比容水平越高，观察到流速就越慢，在具有高血细胞比容的样品中观察到流动阻滞。通过在所述样品添加区中使用优选的表面活性剂和通过在样品添加之前添加含有相同表面活性剂的预湿溶液，得到全血的连续流。
优选的预湿和冲洗溶液含有表面活性剂Surfynol 485或Surfynol 465。其它优选的表面活性剂包括Silwet L7600、吐温 20、Pluronic L64、表面活性剂10G、Triton X-305、Triton X-45和Triton X-100。0.05% -1%的表面活性剂水平是优选的。
使用中断洗液的全血试验结果:通过静脉采集，得到EDTA全血，并掺入卡马西平和苯巴比妥至表I所示的水平。使用减小体积的芯片设计，其具有覆盖所述芯吸区和所述检测区的大约2/3的带(参见图2)，评价中断洗液方案。每个多路芯片含有:由固定化的针对卡马西平的捕获抗体组成的检测(反应)区，和用苯巴比妥捕获抗体固定化的第二检测(反应)区。将BSA和每种药物的荧光体的缀合物沉积在试剂(缀合物)区中。
将I微升含有I % BSA、0.1 % TX-100 (在磷酸盐缓冲盐水中)的冲洗流体点在样品区中，并使其完全进入微柱间隙，然后立即分配15微升全血样品。通过目检，监测流体锋线，直到流体填充芯吸区的50%。然后将15微升相同的冲洗流体直接施加在通道上面(在试剂添加区处)，并监测流体锋线，直到完全填充芯吸区。将芯片装配进筒中，并在荧光读数器中读取。
表1:CRBM/PHBR掺入的全血样品。
权利要求
1.一种测定装置，包括: 液体样品添加区； 含有试剂材料的试剂区，其位于所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通； 与所述试剂区流体连通的检测区，具有与其结合的捕获元件；和与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径，并且还包括沿着所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通的试剂添加区，所述试剂添加区位于所述样品添加区的下游且位于所述检测区的上游。
2.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述流体流动路径的至少一部分具有基质表面和突出物，所述突出物从所述基质表面基本上竖直地伸出，其中所述突出物具有限定所述突出物之间的间隙的高度、横截面以及彼此间距，所述间隙能够产生与所述基质表面平行的毛细管流。
3.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述试剂添加区位于所述试剂区的下游。
4.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述试剂添加区包含蓄池。
5.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述试剂材料包括标记的试剂材料。
6.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述检测区包括与其结合的捕获元件。
7.根据权利要求1所述的测定装置，其中所述样品添加区包括沉积在其上的表面活性剂。
8.根据权利要求1所述的测定装置，还包括在所述样品添加区上的过滤器，其中样品穿过所述过滤器之后才进入所述流体流动路径。
9.根据权利要求1所述的测定装置，所述测定装置还包括至少部分地覆盖所述检测区的亲水带。
10.一种控制测定装置中的样品大小的方法，包括: 提供液体样品添加区； 提供含有试剂材料的试剂区，所述试剂区位于所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通； 提供与所述试剂区流体连通的检测区； 提供与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径； 还提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通，所述试剂添加区在所述样品添加区的下游并位于所述检测区的上游； 给所述样品添加区添加样品，其中所述样品移动穿过所述流体流动路径；和给所述试剂添加区添加试剂，其中所述试剂中断穿过所述流体流动路径的样品流，从而控制所述流体流动路径内的样品大小。
11.根据权利要求10所述的方法，其中当所述样品已经移动进入所述芯吸区中时，将所述试剂添加到所述试剂添加区中。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述样品已经移动进入所述芯吸区的50%中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中添加到所述试剂添加区中的试剂是洗液试剂。
14.根据权利要求10所述的方法，还包括:将表面活性剂沉积在所述样品添加区上。
15.根据权利要求14所述的方法，其中在将所述样品添加到所述样品添加区之前，将所述表面活性剂沉积在所述样品添加区上。
16.根据权利要求10所述的方法，还包括在所述样品添加区上提供过滤器，其中样品穿过所述过滤器之后才进入所述流体流动路径。
17.根据权利要求10所述的方法，还包括提供至少部分地覆盖所述检测区的亲水带。
18.一种为了检测一种或更多种目标分析物而对液体样品进行测定的方法，包括: 提供液体样品添加区； 提供含有试剂材料的试剂区，所述试剂区位于所述样品添加区的下游并与所述样品添加区流体连通； 提供与所述试剂区流体连通的检测区； 提供与所述检测区流体连通的芯吸区，其具有接收从所述检测区流出的液体样品的能力，其中所述样品添加区、所述试剂区、所述检测区和所述芯吸区限定流体流动路径； 还提供试剂添加区，所述试剂添加区沿着所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通，所述试剂添加区位于所述样品添加区的下游且位于所述检测区的上游； 将含有目标分析物的液体样品添加到所述样品添加区上； 通过毛细管作用，移动所述样品进入所述试剂区，其中所述样品溶解所述试剂材料； 通过毛细管作用，使所述样品与溶解在其中的试剂材料一起从所述试剂区流入所述检测区，其中通过读取所产生的信号，在所述检测区中检测所述目标分析物；和使所述样品和任何未结合的材料流入所述芯吸区中； 其中所述方法还包括给所述试剂添加区添加试剂，其中所述试剂中断穿过所述流体流动路径的样品流，从而控制在所述流体流动路径内的样品大小。
19.根据权利要求18所述的方法，其中当所述样品已经移动进入所述芯吸区中时，将所述试剂添加到所述试剂添加区中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述样品已经移动进入所述芯吸区的50%中。
21.根据权利要求18所述的方法，其中添加到所述试剂添加区中的试剂是洗液试剂。
22.根据权利要求18所述的方法，其中所述样品从所述检测区移出并进入芯吸区，并且可以在所述样品已经移动穿过所述检测区之后立即地或在短时间内读取所述信号。
23.根据权利要求18所述的 方法，其中在样品穿过测定装置以后，可以进行一次或更多次冲洗，以将任何未结合的检测元件冲离所述检测区。
24.根据权利要求18所述的方法，其中所述试剂材料用检测元件标记。
25.根据权利要求18所述的方法，其中所述检测区包含捕获元件以捕获所述检测元件。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述信号由所述检测元件产生。
全文摘要
本发明公开了一种测定装置，该测定装置包括液体样品添加区、试剂区、检测区和芯吸区，它们限定流体流动路径。所述装置还包括试剂添加区，所述试剂添加区沿着所述流体流动路径并与所述流体流动路径流体连通，其位于所述样品添加区的下游并位于所述检测区的上游。根据主题发明的方法，在该试剂添加区处添加中断洗液以控制样品体积。以预定的填充体积，将中断冲洗流体添加在芯片装置上，并用于冲洗检测通道和填充剩余的芯片体积。
文档编号G01N33/577GK103212454SQ201310025990
公开日2013年7月24日 申请日期2013年1月18日 优先权日2012年1月20日
发明者E.R.斯卡利斯, P.C.霍西默, Z.丁, J.D.卡纳利, D.A.托马索, D.P.萨罗托, T.C.沃伦 申请人:奥索临床诊断有限公司