专利名称：大熊猫源轮状病毒CH-1株的Real-time PCR非诊断性检测方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，涉及针对大熊猫源轮状病毒CH-1株的Real-timePCR非诊断性诊断方法。
背景技术：
轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿及多种幼龄动物腹泻的重要病原之一，也是重要的人兽共患病病原，每年在世界范围内因人和动物感染RV而损失巨大。在全球范围内，腹泻是导致婴幼 儿死亡的第二大因素，而RV在这一因素中占首要地位。据邹兴淮和孙飞龙报道，大熊猫趋于濒危的主要原因之一是疾病致死，而在致死大熊猫的各种疾病中，以肠道疾病最为严重。叶志勇对50例野外发病大熊猫进行统计时发现消化系统疾病的发病率仅次于寄生虫病，占20%，位居野生大熊猫发病率第二名。1993年，邱先萌等对102只死亡大熊猫进行系统性的回顾时发现其中37%的大熊猫都死于肠道系统疾病，由此可见，肠道疾病对大熊猫种群的危害不容忽视。2008年王成东等首次报道大熊猫因感染轮状病毒(Giant Panda Rotavirus,GPRV)而引起幼龄大熊猫(5 11月龄)顽固性腹泻，最后导致多器官衰竭而死亡，并成功分离得到一株大熊猫源轮状病毒CH-1。由于GPRV的高度潜伏性给大熊猫这一世界濒危珍稀动物的生存和繁殖带来了极大的危害。作为观赏动物，大熊猫与人接触机会较多，故GPRV很可能由大熊猫传染给人，并使得婴幼儿患病，因此，对大熊猫轮状病毒的检测在疾病控制中具有重要意义。目前，RV的检测方法主要有病毒培养、ELISA、电镜观察、PAGE电泳以及RT-PCR。由于某些RV的基因型非致细胞病变，从而使得先分离得到病毒，再通过免疫学方法鉴定病毒这一方法的检出率受到影响；ELISA的结果受人为操作影响较大，易出现假阳性；PAGE方法则不易保证RNA的完整性；电镜方法试验操作繁琐且敏感性不高；常规RT-PCR易污染、扩增后需要电泳易出差错且不能进行定量，荧光定量方法与这几种方法相比较则可有效的弥补他们的不足，试验结果判定特异、敏感且快速。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种大熊猫源轮状病毒CH-1株的Real-time PCR非诊断性检测方法。本发明的技术方案如下:一种大熊猫源轮状病毒CH-1株的Real-time PCR非诊断性检测方法，上游引物F:5' -AGTTATACGCAGCACGGACC-3'，下游引物R:5' -GTTGTTGCGTTTGGTGTGGT-3 ;引物浓度是
0.5 μ mol/L, Real-time PCR循环条件为:95°C预变性 30s，94°C变性 5s，60.5°C退火 30s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。本发明建立的荧光定量RT-PCR方法检测到的最小拷贝数为1.0X 10°拷贝/μ L(见图5)，比常规RT-PCR(见图6及表I)的灵敏度至少高出100倍。
图1GPRV CH-1目的片断PCR扩增，M:DL2000DNA相对分子质量标准；1:PCR扩增
产物；图2荧光定对不同浓度质粒的检测结果(沿横轴平行线从左至右曲线序号依次为1、2、3、4、5)；图3标准曲线；图4特异性扩增曲线，1:大熊猫轮状病毒CH-1株；2:流行性腹泻病毒；3:传染性胃肠炎病毒；4:大肠杆菌；5:沙门氏菌；图5荧光定量RT-PCR检测结果，曲线I 8分别对应的质粒浓度为1.0X107、1.0Χ106、1.0Χ105、1.0Χ104、1.0Χ103、1.0Χ102、1.0XlO1U.0X 10° 拷贝 /μ L ；图6常规RT-PCR检测结果，-:阴性对照；+:阳性对照；M:DL2000DNA相对分子质量标准;1 8:分别对应质粒浓度为 1.0X107、1.0X106、1.0X105、1.0X104、1.0X 103、1.0Χ102、1.0X IO1U.0X 10° 拷贝 /μ L ；
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。1.1大熊猫轮状病毒VP4基因序列扩增根据GenBank 中 GPRV VP4 序列(HQM1296)，使用 Oligo6.0 和 Primer5.0 设计一对荧光定量PCR引物:上游引物F: 5 ' -AGTTATACGCAGCACGGACC-3 '，下游引物R:5' -GTTGTTGCGTTTGGTGTGGT-3,扩增轮状病毒VP4基因保守区间，大小为107bp，引物送由上海Invitrogen公司合成。1.2标准阳性模板的制备I)病毒RNA的抽提和细菌DNA的提取取200 μ L大熊猫RV CH-1株病毒液，按照OMEGA公司RNA Isolation Kit说明书操作，抽提病毒RNA，-70°C保存。2)反转录以抽提的大熊猫源轮状病毒CH-1株RNA作为模板,按PrimeSccript RT reagentKit说明，采用10 μ L体系如表1:表I
权利要求
1. 一种大熊猫源轮状病毒CH-I株的Real-time PCR非诊断性检测方法，其特征在于，上游引物 F : 5' -AGTTATACGCAGCACGGACC-3'，下游引物 R : 5' -GTTGTTGCGTTTGGTGTGGT-3 ；引物浓度是O. 5 μ mol/L，Real-time PCR循环条件为95°C预变性30s，94°C变性5s，60. 5°C退火30s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。
全文摘要
本发明公开了一种大熊猫源轮状病毒CH-1株的Real-time PCR非诊断性检测方法，上游引物F5′-AGTTATACGCAGCACGGACC-3′，下游引物R5′-GTTGTTGCGTTTGGTGTGGT-3；引物浓度是0.5μmol/L，Real-time PCR循环条件为95℃预变性30s，94℃变性5s，60.5℃退火30s，进行40个循环，每个循环后检测荧光信号。本发明建立的荧光定量RT-PCR方法检测到的最小拷贝数为1.0×100拷贝/μL，比常规RT-PCR的灵敏度至少高出100倍。
文档编号G01N21/64GK103255235SQ20131020171
公开日2013年8月21日 申请日期2013年5月27日 优先权日2013年5月27日
发明者颜其贵, 王成东, 马磊, 郭玲, 曹三杰, 文心田, 张志和, 王彬, 黄小波 申请人:四川农业大学