一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法
【专利摘要】本发明涉及一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，属于免疫学的【技术领域】。本发明利用重组布鲁氏菌Omp19外膜蛋白作为抗原蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过免疫印迹试验进行人或者家畜动物血清的免疫识别，根据免疫印迹的结果可以直接判断人与家畜体内是否存在布鲁氏菌。本发明可以作为检测人或者家畜体内是否存在布鲁氏菌的重要方法，在我国广大农牧业养殖区的布鲁氏菌病的快速、准确检测方面有较大的应用空间。
【专利说明】一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，属于免疫学的【技术领域】。
【背景技术】
[0002]在我国北方广大农牧养殖区，包括内蒙古、青海、西藏、新疆以及东北地区，成规模爆发的布鲁氏菌病时有发生，引起这种疾病的细菌被称为布鲁氏菌，它主要在牧区的牛、羊、猪身上寄生，而且，可以通过多种途径直接传染给人，例如空气传染、食用肉制品传染、体液传染等等。比较棘手的一个问题是，到目前为止我国科研工作者仍然没有研制出效果良好的可供人使用的布鲁氏菌病疫苗，所以，一旦出现布鲁氏菌感染人的情况，往往感染后果不堪设想，所以，针对布鲁氏菌病的现状，摆在科研工作者面前的第一个科学难题就是布鲁氏菌可以在人畜之间多途径传染，造成“难防”的局面。此外，一旦布鲁氏菌从家畜体内传染到人的体内，造成的感染后果几乎是不能用现有的抗生素来完全治愈的，这也给科研工作者提出了第二个难题，那就是布鲁氏菌病“难治”的局面，因为这种在家畜和人体内都可以寄生的布鲁氏菌，不能被目前现有的抗生素彻底清除，往往出现病情反复、越来越严重的后果，甚至出现患者丧失劳动能力的严重后果。因此，针对布鲁氏菌病“难防、难治”的局面，我们首先应该研究出一套切实可行、快速准确的判定人或者家畜是否患布鲁氏菌病的技术，从而，为临床实际中从事布鲁氏菌病诊断与治疗的人医和兽医医务工作者提供一个科学的判断依据。
[0003]此前，多数从事布鲁氏菌与布鲁氏菌病研究的科研工作者是从布鲁氏菌本身的鉴定出发，来确定家畜或者人的体内是否存在布鲁氏菌，常用的技术就是PCR扩增技术，将家畜动物或者人的血液作为PCR反应的模板，根据布鲁氏菌基因组中的保守序列，设计特殊的扩增引物来检测受测试样品是否能够扩增到目的基因片段，一次来判断受测试样品中是否存在布鲁氏菌。现在看来，这种技术仍然存在一些缺点:第一，PCR扩增技术的扩增结果很容易受到外界因素的干扰而出现假阳性。第二，PCR扩增技术本省需要耗费较多的精密仪器和大量资金。第三，PCR扩增技术本身较为繁琐和复杂，不利于推广和应用。因此，需要一种简单、快速判定的方法。那么，血清学快速诊断技术就可以解决以上这些问题，一旦家畜或者人体感染布鲁氏菌之后，家畜或者人体的免疫系统就会发挥免疫作用，针对这一细菌产生大量的、各种类型的抗体来清除细菌。因此，一旦家畜或者人体的血清中存在针对布鲁氏菌的抗体，那么可以肯定地判断一定是感染了布鲁氏菌，不会出现假阳性的现象。而且，利用布鲁氏菌自身的抗原蛋白质来识别家畜和人的血清中的抗体，反应特别灵敏，涉及到的试验技术简单、仪器设备普通，便于技术的推广和应用。
[0004]布鲁氏菌在入侵家畜动物和人体过程的免疫识别阶段，主要依靠布鲁氏菌细菌表面的抗原决定簇来刺激机体产生抗体，从蛋白质的氨基酸结构来讲，这些暴露在细菌表面的抗原决定簇主要存在于布鲁氏菌外膜蛋白质(简称Omp蛋白)的氨基酸序列中，因此，利用大肠杆菌原核表达系统进行布鲁氏菌外膜蛋白的重组表达，获得的重组蛋白可以识别因布鲁氏菌感染而在动物和人体内产生的抗体，达到鉴定的效果。因此，本发明选择布鲁氏菌基因组中进化十分保守、在不同种的布鲁氏菌中基因序列完全一致的Ompl9外膜蛋白进行重组表达，通过蛋白质电泳技术和免疫印迹实验技术，应用此Ompl9外膜蛋白进行家畜动物和人体的血清中布鲁氏菌抗体的检测，来判定家畜动物或者人是否感染布鲁氏菌，在临床实际布鲁氏菌病的确诊方面有较大的应用前景。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，该方法能够快速、准确检测人和家畜体内有无布鲁氏菌。
[0006]技术解决方案:
[0007]本发明采用布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白进行重组表达。
[0008]本发明方法步骤如下:
[0009]I)布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白表达片段的克隆:根据美国国家生物技术中心网站公布的多种生物型的布鲁氏菌基因组信息，我们选择了保守性极高的布鲁氏菌的0mpl9外膜蛋白质基因进行研究，因为这个基因在不同生物型的布鲁氏菌中的序列是完全一致的，具有极高的保守性，所以它的应用范围会更广，之后，我们设计了目的基因表达引物0mpl9-F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 #口 0mpl9_R:5 —tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'用于目的基因表达片段的克隆，将从当地疾病控制中心购买来的家畜用的S2活菌疫苗瓶在沸水域中煮沸30min，之后取I ii L-2ii L作为PCR扩增目的基因表达片段的模板进行PCR反应，具体程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液；
[0010]2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(I)中的回收后的布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，之后，在16°C金属浴中进行T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)过夜连接，获得连接产物；
[0011]3)转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5 a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培养基平板；
[0012]4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物Ompl9_F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和弓I物 Ompl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min,之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸IOmin, PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37°C过夜液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；
[0013]5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒(TaKaRa公司产品)进行质粒提取，得到阳性重组质粒；
[0014]6)转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株:将步骤(5)中的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培
养基平板；
[0015]7)阳性克隆子的筛选:用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物 0mpl9_F:5'-tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3' 和引物 0mpl9_R:5'-tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg_3'作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm，培养12h_14h，获得表达菌株培养菌液；
[0016]8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50 V- g/mL,在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h_4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.5mmol/L，诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后,6000rpm低速离心收集菌体,用20mLl XPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎60min (具体要求为:功率200w，超声破碎Is、间歇2s，全程60min)，结束后12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，收集获得亲和纯化后的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的纯化洗脱液；
[0017]9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和纯化后的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的纯化洗脱液，对蒸馏水透析12h-24h，12h期间更换一次蒸馏水，利用PEG8000进行适当浓缩后，取50y L浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时，以常见的BSA蛋白作为对照进行试验，直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止，获得蛋白质凝胶电泳胶片；
[0018]10)“半干法”转膜:利用半干式印迹转膜仪，将布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上，转膜条件为:电压8v-10v，时间40min-50min，获得转膜后的醋酸纤维素薄膜；
[0019]11)免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育40min-60min，再用IOmLl XPBS缓冲液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100 u L-200 u L孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h，之后，利用IOmLl XPBS缓冲液洗膜40min-60min之后，用加有I y L辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用IOmLlXPBS缓冲液洗膜40min-60min，最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液lmL、30%双氧水10 y L、I XPBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色，发色时间为5min-10min，直到出现清晰可见的灰褐色条带。
[0020]本发明的优点:
[0021]本发明利用布鲁氏菌0mpl9抗原蛋白质进行人与家畜血液中布鲁氏菌的血清学检测，外源重组表达的布鲁氏菌0mpl9抗原蛋白质可以十分敏感地识别人与家畜血液中针对布鲁氏菌产生的抗体，方法具有检出限低、结果准确、避免假阳性的优点。【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9的诱导表达图；
[0023]图2为本发明布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9的亲和纯化电泳图；
[0024]图3为本发明布鲁氏囷外I旲蛋白0mpl9用于布鲁氏囷病患者血液中布鲁氏囷的检测结果图；
[0025]图4为本发明布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9用于患布鲁氏菌病牛的血液中布鲁氏菌的检测结果图。
【具体实施方式】
[0026]实施例1:
[0027]图1中，M为标准分子量蛋白质，I为诱导前大肠杆菌菌体总蛋白，2为诱导后大肠杆囷囷体总蛋白，3为囷体破碎后上清液蛋白质样品，4为囷体破碎后沉淀中蛋白质样品。
[0028]图2中，1、2、3、4分别为亲和纯化过程的4管IXelute洗脱液的蛋白质样品。
[0029]图3中，BSA为牛血清白蛋白对照样品，Omp19为布鲁氏囷外I旲蛋白0mpl9。
[0030]方法步骤如下:
[0031]I)布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白表达片段的克隆:根据美国国家生物技术中心网站公布的多种生物型的布鲁氏菌基因组信息，我们选择了保守性极高的布鲁氏菌的0mpl9外膜蛋白质基因进行研究，因为这个基因在不同生物型的布鲁氏菌中的序列是完全一致的，具有极高的保守性，所以它的应用范围会更广，之后，我们设计了目的基因表达引物0mpl9-F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 #口 0mpl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'用于目的基因表达片段的克隆，将从当地疾病控制中心购买来的家畜用的S2活菌疫苗瓶在沸水域中煮沸30min，之后取I ii L-2 ii L作为PCR扩增目的基因表达片段的模板进行PCR反应，具体程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液；
[0032]2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(I)中的回收后的布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，之后，在16°C金属浴中进行T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)连接10h-12h，获得连接产物；
[0033]3)转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物利用“热激法”转化大肠杆菌克隆菌株DH5 a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培养基平板；
[0034]4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物Ompl9_F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和弓I物 Ompl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min,之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin, PCR反应产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37°C过夜液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；[0035]5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒；
[0036]6)转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞，得到固体LB培养基平板；
[0037]7)阳性克隆子的筛选:用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物 0mpl9_F:5'-tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3' 和引物 0mpl9_R:5'-tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg_3'作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm，培养12h_14h，获得表达菌株培养菌液；
[0038]8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50 u g/mL,在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h_4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.5mmol/L，诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后，6000rpm低速离心收集菌体,用20mLl XPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎60min (具体要求为:功率200w，超声破碎Is、间歇2s，全程60min)，结束后12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，具体方法为:取出4°C冰箱中保存在20%酒精溶液中保存的His-tag凝胶亲和柱，在室温下将酒精流通至胶面之后，用3倍柱体积的去离子水充分洗柱，再用5倍柱体积的IXPBS缓冲液充分洗脱柱子，然后用5倍柱体积的试剂盒中的IXchargeBuffer溶液流通洗柱,再用5倍柱体积的IXbinding Buffer溶液流通洗柱,之后就是反复上样，要求用5mL超声波破碎后的高速离心上清液反复流通柱子3次，目的是让重组蛋白与柱子凝胶颗粒充分结合，之后，用5倍柱体积的IXbinding Buffer溶液缓慢流通柱子,用5倍柱体积的I Xwash Buffer溶液缓慢流通柱子来除掉杂蛋白，之后,用6mL的I X elute洗脱溶液进行样品的洗脱，并且用4只1.5mL印pendof离心管收集蛋白洗脱液，纯化结果用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，重组表达的电泳结果如图1所示，大肠杆菌原核表达系统能够正确表达布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白，而且，部分蛋白质分布在菌体破碎后的上清液中；亲和纯化的电泳检测结果如图2所示，通过His-tag凝胶亲和纯化，收集得到4管I X elute洗脱液，经过15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，这些蛋白质样品的电泳条带单一，纯度很闻。
[0039]9)15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳:取亲和纯化后的蛋白质样品50 u L，加入25 ii L的蛋白质样品处理液(15 ii L的5 X SDS-PAGE上样缓冲液、5 y L的质量体积比为10%的SDS和5UL的巯基乙醇)，沸水浴中煮沸5min-10min，冷却后取30 y L作为点样样品进行电泳，同时，取30 ii L质量体积浓度为lmg/mL的BSA蛋白质溶液作为对照样品，经过相同处理之后进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0040]10) “半干法”转膜:利用半干式印迹转膜仪将布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜(孔径为0.22 um)上，方法为:准备6张大小一致的滤纸和一张与滤纸大小相同的醋酸纤维素膜，在半干式印迹转膜仪的石墨电极上铺3张经过IXPBS缓冲液浸泡的滤纸之后，将IXPBS缓冲液浸泡的醋酸纤维素薄膜铺在3张滤纸上，再将经过I XPBS缓冲液浸泡的布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片铺在醋酸纤维素薄膜上，之后再将3张经过IXPBS缓冲液浸泡的滤纸铺在布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片上，注意全过程在“滤纸-醋酸纤维素薄膜-胶片-滤纸”之间不要产生气泡，最后盖上转膜仪的阴极金属盖子进行转膜，转膜条件为:电压 8v-10v,时间 40min-50min ；
[0041]11)免疫印迹试验:转膜结束后，用IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育醋酸纤维素薄膜60min，再用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min，然后用从当地疾病控制中心购买来的布鲁氏菌病患者的血清150 过夜孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h (血清是由相应的血液低速离心2min-3min制得)，之后，利用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min之后，用加有I UL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min，最后在不见光的环境中用质量体积比为3%的4-氯-1-萘酚发色液lmL、30%双氧水10 u L、IXPBS缓冲液9mL进行发色，发色时间为5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带,布鲁氏菌病患者的血清中布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9对应抗体的检测结果如图3所示，布鲁氏菌病患者的血清可以清楚地识别布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9，在醋酸纤维素薄膜上出现一条深色的条带，而作为对照的BSA蛋白不可以被识别，说明布鲁氏囷外I旲蛋白Omp 19可以作为检测布鲁氏囷病患者血液中布鲁氏囷的抗原蛋白。
[0042]实施例2:
[0043]图4中BSA为牛血清白蛋白对照样品，Omp19为布鲁氏囷外I旲蛋白0mpl9。
[0044]方法步骤如下:
[0045]I)布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白表达片段的克隆:根据美国国家生物技术中心网站公布的多种生物型的布鲁氏菌基因组信息，我们选择了保守性极高的布鲁氏菌的0mpl9外膜蛋白质基因进行研究，因为这个基因在不同生物型的布鲁氏菌中的序列是完全一致的，具有极高的保守性，所以它的应用范围会更广，之后，我们设计了目的基因表达引物0mpl9-F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 #口 0mpl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'用于目的基因表达片段的克隆，将从当地疾病控制中心购买来的家畜用的S2活菌疫苗瓶在沸水域中煮沸30min，之后取I ii L-2ii L作为PCR扩增目的基因表达片段的模板进行PCR反应，具体程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比为
1.0%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒(TaKaRa公司产品)进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白基因表达片段溶解液；
[0046]2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(I)中的回收后的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoR I和Xho I双酶切处理，之后，在16°C金属浴中进行T4DNA连接酶(TaKaRa公司产品)连接10h-12h，获得连接产物；
[0047]3)转化大肠杆菌DH5 a克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物利用“热激法”转化大肠杆菌克隆菌株DH5 a感受态细胞(TaKaRa公司产品)，得到固体LB培养基平板；
[0048]4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物0mpl9_F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和弓I物 0mpl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min,之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin, PCR反应产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37°C过夜液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液；
[0049]5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒；
[0050]6)转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞，得到固体LB培养基平板；
[0051]7)阳性克隆子的筛选:用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以引物 0mpl9_F:5'-tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3' 和引物 0mpl9_R:5'-tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg_3'作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm，培养12h_14h，获得表达菌株培养菌液；
[0052]8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50 u g/mL,在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h_4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.5mmol/L，诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h,之后，6000rpm低速离心收集菌体,用20mLl XPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎60min (具体要求为:功率200w，超声破碎Is、间歇2s，全程60min)，结束后12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱(上海生工生物工程有限公司产品)进行重组蛋白质的亲和纯化，具体方法为:取出4°C冰箱中保存在20%酒精溶液中保存的His-tag凝胶亲和柱，在室温下将酒精流通至胶面之后，用3倍柱体积的去离子水充分洗柱，再用5倍柱体积的IXPBS缓冲液充分洗脱柱子，然后用5倍柱体积的试剂盒中的IXchargeBuffer溶液流通洗柱,再用5倍柱体积的IXbinding Buffer溶液流通洗柱,之后就是反复上样，要求用5mL超声波破碎后的高速离心上清液反复流通柱子3次，目的是让重组蛋白与柱子凝胶颗粒充分结合，之后，用5倍柱体积的IXbinding Buffer溶液缓慢流通柱子,用5倍柱体积的I Xwash Buffer溶液缓慢流通柱子来除掉杂蛋白，之后,用6mL的I X elute洗脱溶液进行样品的洗脱，并且用4只1.5mL印pendof离心管收集蛋白洗脱液，纯化结果用15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，重组表达的电泳结果如图1所示，大肠杆菌原核表达系统能够正确表达布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白，而且，部分蛋白质分布在菌体破碎后的上清液中；亲和纯化的电泳检测结果如图2所示，通过His-tag凝胶亲和纯化，收集得到4管I X elute洗脱液，经过质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，这些蛋白质样品的电泳条带
单一，纯度很高。
[0053]9)15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳:取亲和纯化后的蛋白质样品50 u L，加入25 ii L的蛋白质样品处理液(15 ii L的5 X SDS-PAGE上样缓冲液、5 y L的质量体积比为10%的SDS和5UL的巯基乙醇)，沸水浴中煮沸5min-10min，冷却后取30 y L作为点样样品进行电泳，同时，取30 ii L质量体积浓度为lmg/mL的BSA蛋白质溶液作为对照样品，经过相同处理之后进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳；
[0054]10) “半干法”转膜:利用半干式印迹转膜仪将布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜(孔径为0.22 um)上，方法为:准备6张大小一致的滤纸和一张与滤纸大小相同的醋酸纤维素膜，在半干式印迹转膜仪的石墨电极上铺3张经过IXPBS缓冲液浸泡的滤纸之后，将IXPBS缓冲液浸泡的醋酸纤维素薄膜铺在3张滤纸上，再将经过I XPBS缓冲液浸泡的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片铺在醋酸纤维素薄膜上，之后再将3张经过IXPBS缓冲液浸泡的滤纸铺在布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白和BSA蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片上，注意全过程在“滤纸-醋酸纤维素薄膜-胶片-滤纸”之间不要产生气泡，最后盖上转膜仪的阴极金属盖子进行转膜，转膜条件为:电压 8v-10v,时间 40min-50min ；
[0055]11)免疫印迹试验:转膜结束后，用IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育醋酸纤维素薄膜60min，再用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min，然后用从当地疾病控制中心购买来的患布鲁氏菌病的牛的血清150 孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h (血清是由相应的血液低速离心2min-3min制得)，之后，利用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min之后，用加有I U L辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用IOmLlXPBS缓冲液洗膜60min，最后在不见光的环境中用质量体积比为3%的4-氯-1-萘酚发色液lmL、30%双氧水10 u L、IXPBS缓冲液9mL进行发色，发色时间为5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带,布鲁氏菌病患者的血清中布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9对应抗体的检测结果如图3所示，布鲁氏菌病患者的血清可以清楚地识别布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9，在醋酸纤维素薄膜上出现一条深色的条带，而作为对照的BSA蛋白不可以被识别，说明布鲁氏菌外膜蛋白0mpl9可以用于患布鲁氏菌病的牛的血液中布鲁氏菌的检测。
【权利要求】
1.一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，其特征在于:采用布鲁氏菌Ompl9外膜蛋白进行重组表达。
2.根据权利要求1所述的一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法，其特征在于，方法步骤如下: 1)表达片段克隆:将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min，之后取Iy L_2 y L作为PCR扩增目的基因表达片段的模板,利用引物Ompl9_F:5' -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和引物 Ompl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3 作为前后引物对进行PCR反应，具体程序为:94°C -95°C预变性3min-5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°〇变性308，591:退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸lOmin，PCR反应产物进行质量体积比为1.0%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，回收获得布鲁氏菌Omp 19外膜蛋白基因表达片段溶解液； 2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoR I和XhoI双酶切处理，之后，在16°C金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h，获得连接产物； 3)转化大肠杆菌DH5a克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5 a感受态细胞，采用“热激法”或者“电转化法”进行转化，得到固体LB培养基平板； 4)阳性克隆子的筛选:挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落，以前引物Ompl9_F:5 -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3 和后引物 Ompl9_R:5 -tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min,之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性30s，59°C退火45s，72°C延伸45s，最后72°C后延伸10min,PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行37°C过夜10h-12h液体摇菌处理，获得阳性菌株菌液； 5)质粒提取:取步骤(4)中的阳性菌株菌液lmL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，得到阳性重组质粒； 6)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)感受态细胞，得到固体LB培养基平板； 7)阳性克隆子的筛选:次日，用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落，以 Ompl9-F:5' -tactcagaattcatgggaatttcaaaagcaag-3' 和 Ompl9-R:5'_tactcactcgagtcagacaagcgcggcgatg-3'作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性表达菌株的筛选，PCR反应的程序为:94°C预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94°C变性`308，591:退火458，721:延伸45s，最后72°C后延伸lOmin，PCR反应产物进行质量体积比`1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理，液体摇瓶培养的条件为:37°C，180rpm-200rpm，培养12h_14h，获得表达菌株培养菌液； 8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液，从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中，卡那霉素的最终质量体积浓度为50ii g/mL，在37°C、180rpm-200rpm条件下转培养3h-4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为.0.lmmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37°C、180rpm-200rpm条件下诱导3h_4h。之后，5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体，用20mLl XPBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，收集获得纯化洗脱液； . 9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和纯化后的布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的纯化洗脱液，对蒸馏水透析20h-24h，并且12h期间更换一次蒸馏水，利用PEG8000进行浓缩，取.50uL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳，同时，以常见的BSA蛋白作为对照进行试验，试验直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止，获得蛋白质凝胶电泳胶片； . 10)“半干法”转膜:利用半干式印迹转膜仪，将布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上，转膜条件为:电压8v-10v，时间.40min-50min，获得转膜后的醋酸纤维素薄膜； .11)免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用IOmL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育40min-60min，再用IOmLlXPBS缓冲液洗膜40min-60min，然后用家畜或者人的血清100 u L-200 u L孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h，次日，利用IOmLl XPBS缓冲液洗膜.40min-60min之后，用加有I y L辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的IOmL质量体积比为.1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h，然后，用IOmLlXPBS缓冲液洗膜40min-60min，最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液lmL、30%双氧水10 y L、I XPBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色，发色时间为5min-10min，直到出现清晰可见的灰褐色条带。
3.根据权利要求2所述一种人与家畜体内布鲁氏菌的检测方法,其特征在于，将布鲁氏菌0mpl9外膜蛋白的质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.22 u m或0.45 u m。
【文档编号】G01N33/68GK103675289SQ201310403116
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月6日 优先权日:2013年9月6日
【发明者】杜志强, 王建英, 张雪峰 申请人:内蒙古科技大学