一种酸性紫6b标准样品的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种酸性紫6B标准样品的制备方法。它是以正丁醇-乙腈-0.1mol/L三氟乙酸水溶液为逆流色谱的分离溶剂体系，采用高速逆流色谱法对粗品酸性紫6B进行分离纯化；分离后的目标成分用水溶解后，然后用正丁醇反复萃取，合并正丁醇层减压蒸干；然后用水溶解后通过凝胶柱色谱分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。该方法制备的酸性紫6B纯度高、均匀度好、稳定性好、定值准确，从而为酸性紫6B的检测、定量等提供优质的标准品。
【专利说明】一种酸性紫6B标准样品的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种酸性紫6B标准样品的制备方法，属于标准品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]酸性紫6B,英文名称=Acid Violet6B,分子式=C39H40N3NaO6S2,分子量:733.87，CAS =1694-09-3ο化学结构式如下:
[0003]
\、
I.0
[0004]酸性紫6B是一种化工颜料，主要用于羊毛、丝绸、锦纶的染色。由于酸性紫6B具有一定的致癌性，因此应严格控制它在羊毛、丝绸、锦纶中的添加量及废水、粉尘中的含量。目前还没有用于检测使用的酸性紫6B的标准样品的报道。
【发明内容】
[0005]本发明的的目的是提供一种酸性紫6B标准样品的制备方法。该方法制备的酸性紫6B纯度高、均匀度好、稳定性好、定值准确，从而为酸性紫6B的检测提供优质的标准品。
[0006]本发明的技术方案是:一种酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是，包括以下步骤:
[0007]( I)高速逆流色谱的分离纯化
[0008]逆流色谱的分离溶剂体系:正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系；
[0009]配制正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，充分振摇后静置至少12h，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；
[0010]将粗品酸性紫6B溶解于正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系中，配制成样品溶液；首先将固定相泵入分离柱；待固定相充满管道后，打开主机速度控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到750-850r/min时，以
1.5-2.5mL/min的速度泵入流动相，并通过六通进样阀进样，待流动相开始流出色谱柱后，收集各峰流出液，收集的溶液通过HPLC检测，确定目标成分；
[0011](2)酸性紫样品脱酸
[0012]收集高速逆流色谱分离纯化后的目标成分，用水溶解后，然后用正丁醇反复萃取，合并正丁醇层减压蒸干；然后用水溶解后通过凝胶柱色谱(sephadexLH-20)分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。
[0013]优选技术方案为:
[0014]( I)高速逆流色谱的分离纯化
[0015]逆流色谱的分离溶剂体系:正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，三者体积比为4:1:5 ；
[0016]按照上述比例在分液漏斗中配制正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，充分振摇后静置12h，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相；
[0017]将粗品酸性紫6B粗样200mg溶解于4mL上相和4mL下相的混合溶剂中；首先将固定相以20mL/min的速度泵入分离柱，待固定相充满管道后，打开主机速度控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到800r/min时，以2.0mL/min的速度泵入流动相，并通过六通进样阀进样，收集各峰流出液，收集的溶液通过HPLC检测，确定目标成分；
[0018](2)酸性紫样品脱酸
[0019]收集高速逆流色谱分离纯化后的目标成分，用水溶解后，置于分液漏斗中，然后用等体积的饱和正丁醇反复萃取三次，合并正丁醇层减压蒸干；然后用IOmL水溶解后通过凝胶柱色谱(sephadexLH-20)分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。
[0020]分装与储存:将制得酸性紫6B标准品，用棕色瓶进行分装，每瓶20mg，在室温下干燥避光密闭保存。
[0021]本发明的有益效果是:该方法制备的酸性紫6B纯度高、均匀度好、稳定性好、定值准确，从而为酸性紫6B的检测、定量等提供优质的标准品。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为酸性紫6B的液相色谱图；
[0023]图2为酸性紫6B的紫外吸收光谱图；
[0024]图3为酸性紫6B的红外光谱图；
[0025]图4为酸性紫6B的质谱图；
[0026]图5 为酸性紫 6B 的 HNMR 图(DMS0_d6)；
[0027]图6 为酸性紫 6B 的 CNMR 图(DMS0_d6)；
[0028]图7为均匀性趋势图。
【具体实施方式】
[0029]I样品的制备
[0030]1.1仪器与设备
[0031]高速逆流色谱仪:TBE-300A (上海同田生物技术有限公司)，仪器中自带色谱柱；凝胶柱色谱(sephadexLH-20) sephadexLH-20凝胶柱色谱(是将sephadex LH-20填料装在一个玻璃柱中，是自己装填的，sephadex LH-20填料是从北京慧得易科技有限责任公司买的)，Agilentl260液相色谱仪配二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)；TSQ quantum ultra液相色谱-串联质谱仪(美国Thermo公司)；Bruker AV400核磁共振仪(德国，Bruker公司);感量为0.1mg的分析天平(瑞士梅特勒公司)纯水器(美国Millipore公司)；IKA-KS130型振荡器(德国IK公司)。
[0032]1.2材料与试剂
[0033]甲醇和乙腈(色谱纯，默克公司)；乙酸乙酯，正丁醇，甲醇，氯仿，三氟乙酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；超纯水由Mill1-Q纯水器制备；酸性紫6B，分析纯，购于上海试剂三厂。其他试剂，如非提及均为分析纯。
[0034]1.3实验方法与步骤
[0035]1.3.1高速逆流色谱的分离纯化
[0036]取正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液(4:l:5，v/v)溶剂体系作为逆流色谱的分离溶剂体系，按照比例在分液漏斗中配制1500mL的两相溶剂体系，充分振摇后静置12h，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相，将粗样200mg溶解于4mL上相和4mL下相的混合溶剂中。首先将固定相以20mL/min的速度泵入分离柱，待固定相充满管道后，打开主机速度控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到800r/min时，以2.0mL/min的速度泵入流动相，并通过六通进样阀进样,待流动相开始流出色谱柱时，根据记录信号的出峰情况分别收集流出液，收集的溶液通过HPLC检测，检测波长为254nm。
[0037]1.3.2酸性紫样品脱酸
[0038]收集高速逆流色谱分离纯化后的目标成分，用水溶解后，置于分液漏斗中，然后用等体积的饱和正丁醇反复萃取三次，合并正丁醇层减压蒸干。然后用IOmL水溶解后通过凝胶柱色谱(sephadexLH-20)分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。
[0039]1.4分装与储存
[0040]将制得酸性紫6B标准品，用棕色瓶进行分装，每瓶20mg，共100瓶，编号后在室温下干燥避光密闭保存。
[0041 ] 2纯度检查及含量测定
[0042]在酸性紫6B标准样品的研制中，选择HPLC峰面积归一法进行测定。
[0043]2.1仪器及条件
[0044]高效液相色谱仪(安捷伦1260),配紫外检测器；色谱柱:Agela TechnologiesVenusil XBP C18 (L)色谱柱(4.6_X 250mm, 5 μ m)或相当者。流动相 A:20mmol/L 乙酸铵，流动相B:甲醇，流动相根据不同时间采取梯度洗脱见表2.1 ;流速为1.0mL/min ;柱温:室温；进样量=IOyL ;检测波长:608nm。
[0045]上述操作参数是典型的，可根据不同仪器特点，对给定的操作条件做适当调整以获得最佳效果。
[0046]2.2定量测定
[0047]准确称取一定量的酸性紫6B样品，经色谱纯甲醇稀释定容后，配制成浓度为0.02mg/mL的样液，在选定的液相色谱条件下，应用面积归一化法进行纯度测定(色谱图如图1所示)，酸性紫6B的纯度为99.87%。
[0048]3结构确认[0049]3.1紫外光谱检测
[0050]3.1.1分析条件
[0051]分析仪器:紫外-可见光谱用Shimadzu UV-3100UV-VIS-NIR分光光度计测定。
[0052]条件:配制浓度为0.02mg/ml酸性紫6B水溶液；用紫外可见光谱在190~800nm进行全波长扫描。
[0053]3.1.2分析结果
[0054]从图2可以看出，酸性紫6B在波长254nm、290nm和608nm处有特征吸收，其中608nm吸收值最强，因此,液相色谱定值分析选择608nm。
[0055]3.2结构鉴定
[0056]3.2.1仪器与设备
[0057]Bruker AV400核磁共振成像仪(德国Bruker公司)
[0058]TSQ quantum ultra液相色谱_串联质谱仪(美国Thermo公司)
[0059]Vertex70红外光谱仪(德国Bruker公司)
[0060]3.2.2结果分析
[0061]采用红外光谱(IR)、液相色谱-质谱(MS)、核磁共振(NMR)对制备的酸性紫6B样品进行结构确认，谱图见图3-6，其紫外、IR和ES1-MS数据见表1所示。
[0062]表1酸性紫6B的特征数据
【权利要求】
1.一种酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是，包括以下步骤: (1)高速逆流色谱的分离纯化 逆流色谱的分离溶剂体系:正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系； 配制正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，充分振摇后静置至少12h，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相； 将粗品酸性紫6B溶解于正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系中，配制成样品溶液；首先将固定相泵入分离柱，待固定相充满管道后，打开主机速度控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到750-850r/min时，以1.5-2.5mL/min的速度泵入流动相，并通过六通进样阀进样，待流动相开始流出色谱柱后，收集各峰流出液，收集的溶液通过HPLC检测，确定目标成分； (2)酸性紫样品脱酸 收集高速逆流色谱分离纯化后的目标成分，用水溶解后，然后用正丁醇反复萃取，合并正丁醇层减压蒸干；然后用水溶解后通过凝胶柱色谱分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。
2.如权利要求要求I所述的酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是，所述正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，三者体积比为4:1:5。
3.如权利要求1所述的酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是，所述步骤(I)将粗品酸性紫6B溶解于正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系中，配制成浓度为25mg/ml的样品溶液。
4.如权利要求1所述的酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是，所述步骤(2)用等体积的饱和正丁醇反复萃取三次。
5.如权利要求要求2-4中任意一项所述的酸性紫6B标准样品的制备方法，其特征是， (1)高速逆流色谱的分离纯化 逆流色谱的分离溶剂体系:正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，三者体积比为4:1:5 ； 按照上述比例在分液漏斗中配制正丁醇-乙腈-0.lmol/L三氟乙酸水溶液溶剂体系，充分振摇后静置12h，分层，取上相作为固定相，下相作为流动相； 将粗品酸性紫6B粗样200mg溶解于4mL上相和4mL下相的混合溶剂中；首先将固定相以20mL/min的速度泵入分离柱，待固定相充满管道后，打开主机速度控制器，使高速逆流色谱仪螺旋管柱按照顺时针的方向旋转，当转速达到800r/min时，以2.0mL/min的速度泵入流动相，并通过六通进样阀进样，收集各峰流出液，收集的溶液通过HPLC检测，确定目标成分； (2)酸性紫样品脱酸 收集高速逆流色谱分离纯化后的目标成分，用水溶解后，置于分液漏斗中，然后用等体积的饱和正丁醇反复萃取三次，合并正丁醇层减压蒸干；然后用IOmL水溶解后通过凝胶柱色谱分离，收集紫色部分，减压浓缩得到目标成分，室温干燥得纯品酸性紫6B。
【文档编号】G01N30/14GK103645268SQ201310725919
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】韩焕美, 何桂华, 郑新华, 张爱霞, 陈晞, 包海英, 李晓明 申请人:济南出入境检验检疫局检验检疫技术中心