人肺炎链球菌抗体及其用途

人肺炎链球菌抗体及其用途
【专利摘要】本发明涉及特定的单克隆抗体及其片段，其发现用于检测、预防和治疗肺炎链球菌感染。尤其是，这些抗体可以杀灭肺炎链球菌或限制肺炎链球菌的复制。还公开了产生此类单克隆抗体的改进的方法。
【专利说明】人肺炎链球菌抗体及其用途
[0001] 发明背景 本发明用政府支持在基金号 P20RR015577、P20RR015577-10S1、P30RR031152、 P30AR053483 和 U19AI062629 和合同号 HHSN266200500026C (N01-AI500026)下，由 National Institutes of Health资助完成。政府在本发明中具有某些权利。
[0002] 本申请要求享有于2012年2月1日提交的美国临时申请系列号61/593,654的优 先权，其完整内容通过引用并入本文。
[0003] 包含于文件中名为"0MRFP0108US_ST25"的序列表(其为?91. 8 KB并且在2013 年1月8日产生）与本文一同通过电子申请提交，并通过引用并入本文。
[0004] 1.【技术领域】 本发明总体涉及微生物学、免疫学及病理学领域。更具体而言，其涉及用于肺炎链球菌 感染的诊断、预防和治疗的人单克隆抗体的开发。
[0005] 2.发明背景 肺炎链球菌(Stre/?iococcws )是引起一系列临床感染诸如中耳炎、 肺炎、脑膜炎和菌血症的普遍存在的人病原体。更严重的表现尤其在无免疫应答的 (immunocompromised)和老年个体中是致命的。超过90种不同的肺炎链球菌血清型已被表 征，每一种具有不同的荚膜多糖结构。这些多糖在成人中是免疫原性的，并且Pne Um〇Vax?23 疫苗由23种最常见的和/或强毒的肺炎链球菌菌株的混合物组成。该疫苗推荐用于超过 60岁的每个人以及所有无免疫应答个体，以确保针对这些菌株的血清保护。
[0006] 已深度研究了对Pneumovax?23以及缀合疫苗Prevnar? (用于免疫儿童）应答的 血清学关于在血清和唾液中的体液多克隆IgG和IgA应答（Anttila等，1999; Nieminen 等，1998a; Nieminen等，1998b)。记忆细胞和抗体分泌细胞（ASC)对这些疫苗的应答之 前也已在细胞水平上用B细胞ELISpot测定和流式细胞术进行研究Nieminen等，1998b ; Clutterbuck等，2006)，并且接种后两种应答的存在现在完全确定。然而，利用ASC来产 生人单克隆抗体将提供完全阐释接种后对病原体血清型的回忆应答的新的方法，并甚至提 供了勘察过去应答的进化的窗口。
[0007] 与两种或多种肺炎球菌多肽交叉反应的抗体在免疫前和免疫后存在于血清中 (Lee等，1984; Soininen等，2000);然而，仍不知晓这是否由于能够交叉反应的单 一抗体特异性或是由于广泛的多克隆抗体特异性。尽管已报道在患有SLE的患者中用 Pneumovax?23免疫不诱导新的自身特异性（Elkayam等，2005)，但一个报道已显示在患有 SLE的患者中肾结合抗体还与肺炎球菌多糖交叉反应（Chowdhry等，2005)。因此，可能从 SLE供体的B细胞中产生的抗体可以显示增加的多反应性（poly-reactivity)或自反应性 (auto-reactivity)。仅仅可以通过从SLE供体的人单克隆抗体的表征来确定此类经抗体 (per-antibody)的现象。
[0008] 发明概述 因此，根据本发明，提供包含多种抗体的人单克隆抗体组（panel)，其中所述组中的抗 体结合至少15种肺炎链球菌的血清型。所述组中的抗体可以结合至少18种肺炎链球菌血 清型或21种肺炎链球菌血清型。至少15种抗体可以是血清型特异性的，至少17种抗体可 以是血清型特异性的，或者19种抗体可以是血清型特异性的。抗体组可以附着在支持物 上，诸如珠、浸渍片（dipstick)、滤器、膜、板或芯片。血清型可以选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、 叭、118、14、158、17?、18(：、194、19?、20、22?、23?、33?和01?5。抗体组可以包含与两种血清 型反应的抗体。
[0009] 在另一个实施方案中，提供评估主体中肺炎链球菌的方法，所述方法包括从所述 主体中获得第一含抗体的样品，并评估所述样品中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体 组的结合，其中所述组中的抗体结合至少15种肺炎链球菌的血清型。所述组中的抗体可以 结合至少18种肺炎链球菌血清型或21种肺炎链球菌血清型。至少15种抗体可以是血清型 特异性的，至少17种抗体可以是血清型特异性的，或者19种抗体可以是血清型特异性的。 抗体组可以附着在支持物上，诸如珠、浸渍片（dipstick)、滤器、膜、板或芯片。血清型可以 选自1、2、3、4、5、68、8、9队叭、1比、14、158、17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5。抗 体组可以包含与两种血清型反应的抗体。
[0010] 主体可以是无免疫应答的和/或60岁龄或更老的。主体可以是怀疑具有肺炎链 球菌。方法可以进一步包括用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体，如果发现所述第一含抗 体的样品对一种或多种血清型是阳性的。方法可以进一步包括用万古霉素或左氧氟沙星 (Ievoflaxin)治疗所述主体,如果发现所述第一含抗体的样品对血清型19A和/或19F是 阳性的。所述第一含抗体的样品可以是血液、血清、血楽、痰（sputum)或唾液（saliva)。 toon] 方法可以进一步包括从所述主体中获得第二含抗体的样品，并评估所述第二样品 中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体组的结合，其中所述组中的抗体结合至少15种 肺炎链球菌的血清型。所述第二含抗体的样品可以是血液、血清、血楽、痰（sputum)或唾液 (saliva)。主体可以在确定所述第一含抗体样品对于一种或多种血清型是阳性后已用抗肺 炎链球菌疗法治疗，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价的降低表明所述抗肺炎 链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是有效的。主体可以在确定所述第一含抗体样品对于一种或 多种血清型是阳性后已用抗生素治疗，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价未降 低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是无效的，并且任选所述方法可以进一步 包括用不同的抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。
[0012] 在仍另一个实施方案中，提供选择性结合肺炎链球菌的抗体，其中所述抗体具有 选自表2中所述的那些的重链和轻链CDR。抗体可以是单链抗体、单结构域抗体、嵌合抗体、 Fab片段或IgG。抗体可以进一步包含与其连接的抗生素，诸如经光不稳定的接头或经酶促 切割的接头连接至所述抗体的抗生素。抗体可以缀合至纳米颗粒或脂质体。
[0013] 在还仍另一个实施方案中，提供治疗主体中肺炎链球菌感染的方法，其包括如上 所述向所述主体施用抗体。方法可以进一步包括向所述主体施用第二抗肺炎链球菌治疗， 其可以在所述抗体的同时给予或在所述抗体之前和/或之后给予。抗体可以是单链抗体、 单结构域抗体、嵌合抗体、Fab片段或IgG。
[0014] 抗体可以进一步包含与其连接的抗生素，诸如经光不稳定的接头或经酶促切割的 接头连接至所述抗体的抗生素。抗体可以缀合至脂质体或纳米颗粒。施用多抗肺炎链球菌 抗体，诸如结合 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、 26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 种肺炎链球菌血清型 的多抗肺炎链球菌抗体。
[0015] 考虑本文描述的任何方法或组合物可以就本文描述的任何其他方法或组合物来 实现。
[0016] 在权利要求和/或说明书中当与术语"包含（comprising)"结合使用时，词语"一 个（a)"或"一个（an)"的用法可以表示"一个（one)"，但它也与"一个或多个"、"至少一个" 和"一个或多于一个"的意思一致。词语"约"表示所述数字的正负5%。
[0017] 本发明的其他目标、特征和优点将从以下详述中变得显而易见。然而，应该理解， 详述和具体实施例尽管说明了本发明的具体实施方案，但仅是通过举例说明的方式给出， 因为从该详述中本发明的精神和范围内的多种改变和变化对于本领域技术人员而言将变 得显而易见。
[0018] 附图简述 以下附图构成本说明书的部分并且包括在内以进一步说明本发明的某些方面。本发明 可以通过参考这些附图中的一幅或多幅并组合本文呈现的具体实施方案的详述而被更好 理解。
[0019] 图1A-B. Pneumovax?23引起大量ASC爆发，其可以用作高亲和力抗多糖抗体的来 源。（图1A)在用Pneumovax?23接种后7天从四个供体中收获PBMC。将它们染色并对作 为CD3和CD20阴性和CD19中间体的细胞进行分选。呈现的点图表明在所有四个供体中的 大ASC爆发（⑶27高、⑶38高；循环门控)。将来自这四个供体(命名为Coni、Con2、SLEl和 SLE2)的ASC的百分比平均，外周血中16. 3%的总B细胞是ASC。（图1B)将A中所示的ASC 分选至96孔板。进行RT-PCR和几轮嵌套PCR来制备V区用于克隆。然后将DNA克隆入表 达载体，扩增，并转染入HEK293人细胞系。
[0020] 图2A-C.平均上，用Pneumovax?23接种后产生的77%的抗体结合疫苗组分。（图 2A)通过ELISA，平均77%(Conl，62% ;Con2，90%;SLEl，75%;SLE2，75%)的表达的 抗体结合肺炎链球菌荚膜或细胞壁多糖。（图2B)尽管显著百分比的抗体是交叉反应性的 (12%)，但产生的大部分抗体对单一血清型是特异性的。（图2052%的来自SLE2的抗体 是多反应性的，结合以下五种抗原的至少两种：R〇、La、Sm、nRNP或心磷脂。
[0021] 图3A-D.个体可以产生对同一血清型的多种抗体，其中的一些是特异性的，并且 其他是交叉反应性的。（图3A)血清型9N和9V具有非常相似的结构，但勿似仅结合 9N，且卻7仅结合9V。（图3B)相反，游似结合9N和9V。如由亲和力（affinity) 和抗体亲抗原性（avidity)测量所示，对9N的结合强于对9V的结合。（图 结合9N，但与14而非9V交叉反应。其对9N和14的亲和力和抗体亲抗原性相似。（图3D) 这%^结合19A和19F，其也具有相似结构。对19A和19F的亲和力相似，然而，对19A 的抗体亲抗原性比对19F的强4倍。亲和力ELISA通过用抗体的连续稀释包被具有单一纯 化的多糖的板来进行。亲和力（Kd's)以摩尔浓度表示。抗体亲抗原性离液序列高的ELISA 以相同方式进行，但加入使用硫氰酸铵的多种稀释的15分钟洗脱步骤。抗体亲抗原性图作 为保留的百分比结合（OD 4tl5具有SCN/0D4(i5 XSCN * 100)相比于硫氰酸盐浓度的log来呈 现。抗体亲抗原性等于引起结合50%降低(或保留）的硫氰酸铵的浓度。
[0022] 图4A-C. B细胞产生对血清型15B和14,以及17F和33F的交叉反应性的抗体。（图 4A)两种抗体兄没/?況浙和兄万办光似分别单独结合17F和33F。（图4B)然而， 结合两种血清型。对33F的亲和力比对17F的亲和力要好一个数量级，然而，它们的抗体亲 抗原性是相似的。（图4C)5Z￡^7及?7结合15B和14两者。尽管亲和力几乎比对15B的高 一个数量级，但它常常显示对14的高两倍的抗体亲抗原性。
[0023] 图5从用Pneum〇Vax?23接种产生的ASC产生高度突变的抗体。每一数据点是来 自每一供体的每条序列的体细胞突变(核苷酸）的平均频率(在方法中为/?值)。平均上，抗 多糖ASC已积累了与季节性流感接种后抗流感ASC的相似数目的突变 14。GC =生发中心 群。
[0024] 图6A-B.由Pneumovax?23诱导的ASC特异性通过由疫苗引起的供体的记忆应答 来确定。（图6A)来自四个供体的'记忆指纹（anamnestic fingerprint)'。之前均未接受 Pneumovax?23,因此由于之前暴露于肺炎链球菌而从记忆中产生克隆的ASC '回忆'抗体。 每一供体具有独特的血清型(针对其他们已产生抗体）的"指纹"。（图6B)在排除克隆库成 员并组合所有四幅图后，供体具有非常不同的'肺炎球菌指纹'，其中仅三种血清型（9V、15B 和17F)表示来自三个供体，且仅两种来自所有四个供体（8和33F)。
[0025] 图7A-B.显示来自每一供体的交叉反应性和多反应性的抗体。在此再现还显示抗 体(其以红色为交叉反应性的（图7A)和以橙色为多反应性的（图7B))的来自图2A的ELISA 曲线。来自SLE2的四种交叉反应性抗体的三种也是多反应性的(但均不来自其他供体)。
[0026] 示例性实施方案描述 为了探究通过Pneumovax?23疫苗产生的抗体应答，本发明人从SLE患者和健康对照 产生并表征了大量针对存在于疫苗中的肺炎链球菌血清型的高亲和力人单克隆抗体。尽 管在过去已制备了针对肺炎链球菌的人单克隆抗体（Baxendale和Goldblatt, 2006; Baxendale等，2000; Zhou等，2002; Zhou等，2004)，但这些研究还受以下两个因素限 制：一，它们利用Fab表达文库筛选并且二，它们利用杂交瘤的随机产生。此外，之前研究要 么集中于一种血清型（6B和23F)要么利用用缀合疫苗Prevnar (其仅由七种荚膜血清型组 成)接种。相反，本发明人的技术提供了及时的(接种后7天)在一个特定点上抗多糖应答的 代表性表征；因此，用于克隆抗体的每一细胞已从针对于该特定接种的记忆应答产生。该系 统将告知在多糖免疫应答和自身免疫领域中大量仍未解答的问题。具体而言，本文数据具 体解决不同血清型间交叉反应的人单克隆多糖抗体的百分比，个体的ASC对Pneumovax?23 的应答如何是由于对肺炎链球菌的前期暴露，并且该应答在患有SLE的供体中如何不同。 结果是，目前存在可用的广泛范围的针对肺炎链球菌的完全人单克隆抗体，其可以应用于 诊断学、治疗诊断学和治疗学应用。本发明的这些和其他方面在下文详细描述。
[0027] W.肺炎链球菌 A.概述 肺炎链球菌或肺炎球菌是属链球菌属（Streptococcus)的革兰氏阳性、α溶血的、胆 汁可溶的耐氧性厌氧成员。重要的人病原性细菌肺炎链球菌被认为是19世纪后期肺炎的 主要原因，并且是许多体液免疫研究中的主题。
[0028] 肺炎链球菌与草绿色链球菌(SirepiococciAs ririt/a/75·)有所区别，其一些也是α 溶血的，使用奥普托欣试验，如同肺炎链球菌是奥普托欣敏感的。肺炎链球菌还可以基于其 对胆汁溶菌的敏感性而区别。该有荚膜的、革兰氏阳性球形细菌在革兰氏染色上具有特征 性形态学，所谓的"柳叶刀形的（lancet-shaped) "双球菌。它们具有多糖荚膜，其充当生物 的毒力因子；多于90种不同的血清型是已知的，并且这些类型在毒力、流行性和药物抗性 程度上不同。
[0029] 肺炎链球菌的基因组是闭合的、环形DNA结构，根据菌株不同，其含有2. 0-2. 1 百万个碱基对。它具有1553个基因的核心组，加在其毒力组（virulome)中的154个基因 (其负责毒力）和维持非侵袭性表型的176个基因。遗传信息在菌株间可以变化高至10%。
[0030] 肺炎链球菌是正常的上呼吸道菌群的部分，但是，如同许多天然菌群，它在合适条 件下可以变为致病性的(例如，如果宿主的免疫系统受到抑制)。侵染素诸如肺炎链球菌溶 血素、抗吞噬的荚膜、多种黏附素和免疫原性的细胞壁组分是所有主要的毒力因子。
[0031] 社区获得性肺炎（Community-acquired pneumonia, CAP)变得越来越普遍，并且 代表世界范围内死亡率和发病率的重要成因。尽管大量不同的病原体可以产生CAP，但肺炎 链球菌是最普遍之一。
[0032] CAP常常经吸入或抽吸肺致病性生物进入肺区或肺叶中而获得。更不常见的，CAP 产生于来自远源的继发菌血症。
[0033] 严重CAP通常在患有心肺疾病、受损的脾功能、和/或致病性毒力的患者中发生， 但甚至年轻和/或健康宿主也可以发生严重CAP，如果成因的病原体足够有毒力。CAP中的 并发症依赖于感染性病原体和患者健康。由于社区获得性肺炎（CAP)的发热可能促成心肌 梗塞。而且，具有受损的脾功能的患有CAP的患者可以发生无法抗拒的肺炎球菌败血病，可 能在12-24小时内导致死亡，而与所用的抗微生物疗法无关。
[0034] CAP发病率和死亡率在老年患者中和在无免疫应答的宿主中是最高的。预测患有 CAP患者中升高的死亡率风险的其他因素包括显著并存病的存在、升高的呼吸速率、低血 压、发热、牵连多叶（multilobar involvement)、贫血和缺氧。
[0035] B.相关疾病状态 无关名称，肺炎链球菌导致除肺炎外的许多类型的肺炎球菌感染，包括急性鼻窦炎、中 耳炎、脑膜炎、菌血症、败血病、骨髓炎、脓毒性关节炎、心内膜炎、腹膜炎、心包炎、蜂窝组织 炎和脑脓肿。
[0036] C.多药物抗性 肺炎链球菌疗法中日益增长的关注是菌株许多对青霉素及其他对β内酰胺(如阿莫 西林)的抗性，其在全世界范围内增加。抗性的主要机制涉及编码青霉素结合蛋白的基因中 引入突变。该发展使得治疗极大地复杂化，并且当疗法失败时还增加了不必要的花费。
[0037] 在 2〇00 年，Whitney 等检查了在 Centers for Disease Control and Prevention 的活性细菌核心监视（Active Bacterial Core Surveillance)计划中从1995年至1998 年鉴定的患者中侵袭性肺炎球菌疾病的数据。在1998年间，报道了 4013例侵袭性肺炎链 球菌疾病，并且3475例可获得隔离群（87%)。总体上，来自1998年的24%的隔离群对青 霉素是抗性的。青霉素抗性隔离群比易感性隔离群更可能具有高水平的对其他抗微生物剂 的抗性。包括在7价缀合物和23价肺炎球菌多糖疫苗中的血清型分别占了青霉素抗性菌 株的78%和88%。在1995年至1998年之间，对三类或更多类药物有抗性的隔离群的比例 从9%增加至14%;在对青霉素(从21%至25%)、头孢噻肟(从10%至14%)、美罗培南(从 10%至16%)、红霉素(从11%至15%)、和甲氧苄啶磺胺甲噁唑(从25%至29%)有抗性的 隔离群的比例中也存在增加。这些趋势可能持续，给予临床医生更大的压力以求诸药物诸 如万古霉素和左氧氟沙星（Ievoflaxin)。
[0038] D.诊断 肺炎链球菌可以基于α溶血测试而与其他链球菌感染区分开。草绿色链球菌(其 中一些也是α溶血的）可以使用奥普托欣测试来区别，因为肺炎链球菌是奥普托欣敏感 的，而草绿色链球菌不是。肺炎链球菌还可以基于其对胆汁溶菌的敏感性而区别。该有 荚膜的、革兰氏阳性球形细菌在革兰氏染色上具有特征性形态学，所谓的"柳叶刀形的 (lancet-shaped) "双球菌。它们具有多肽荚膜，其充当生物的毒力因子；多于90种不同的 血清型是已知的，并且这些类型在毒力、流行性和药物抗性程度上不同。
[0039] 在区别血清型方面，目前可获得对血清型1、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、12F、14、18C、 19F 和 23F 的抗体（ARUP Laboratories, Salt Lake City, UT)。
[0040] E.治疗 抗生素是对肺炎链球菌感染的治疗选择，并且通风(氧补充）作为细菌性肺炎的支持疗 法。抗生素选择依赖于在地理区域中最常引起肺炎的微生物，以及具体生物的性质，个体的 免疫状态和根本健康，感染的严重程度以及之前的治疗史。在英国，将阿莫西林用作绝大部 分在社区中获得肺炎的患者的一线疗法，有时并加入克拉霉素。在北美，在那社区获得性肺 炎的"非典型性"形式变得越来越普遍，克拉霉素、阿奇霉素或氟喹诺酮类作为单一疗法已 经取代了阿莫西林作为一线疗法。在开始药物治疗时，应该总是考虑抗生素抗性的本地模 式。在住院个体或具有免疫缺陷的那些个体中，本地指导方针决定抗生素的选择。这些抗生 素通常经静脉内路线给予。具体而言，用阿莫西林(或在对青霉素过敏的患者中为红霉素） 治疗肺炎链球菌，并且在严重情况下用头孢呋辛和红霉素。
[0041] III.产生单克隆抗体 Α.总体方法 应理解结合肺炎链球菌的单克隆抗体将用于几种应用中。这些包括产生用于检测和诊 断疾病的诊断试剂盒。在这些背景下，技术人员可以将此类抗体与诊断剂或治疗剂连接，或 者使用它们作为竞争性测定中的俘获剂或竞争物。用于制备并表征抗体的方法是本领域中 熟知的（参见例如Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988;美国专利 4, 196, 265)。
[0042] 用于产生单克隆抗体（Mb)的方法通常与用于制备多克隆抗体的方法沿相同路 线开始。这两种方法的第一步是免疫合适宿主或鉴定由于之前天然感染而被免疫的主体。 如本领域中熟知的，用于免疫的给定组合物可以在其免疫原性上不同。因此，加强宿主免 疫系统通常是必要的，如同可以通过将肽或多肽免疫原与载体偶联来实现。示例性且优选 的载体是匙孔槭血蓝蛋白（KLH)和牛血清白蛋白（BSA)。其他白蛋白诸如卵清蛋白、小鼠 血清白蛋白或兔血清白蛋白也可以用作载体。用于缀合多肽与载体蛋白的方法是本领域 中熟知的，并且包括戊二醛、间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯（m-malei midobencoyl-N-hydroxysuccinimide ester)、碳二亚胺（carbodiimyde)和双重氮联苯胺 (bis-biazotized benzidine)。本领域中还熟知的是，特定免疫原组合物的免疫原性可以 通过使用免疫应答的非特异性刺激物(称为佐剂)来增强。示例性且优选的佐剂包括完全弗 氏佐剂(含有杀灭的结核分枝杆菌(MercWo 1Si1S)的免疫应答非特异性刺 激物)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。
[0043] 用于制备多克隆抗体的免疫原组合物的量根据免疫原的性质以及用于免疫的动 物而不同。多种途径可用于施用免疫原(皮下、肌内、皮内、静脉内和腹膜内）。多克隆抗体 产生可以通过在免疫后多个点取样经免疫的动物的血液来监测。还可以给予第二次加强注 射。重复加强和滴定过程直到达到合适的效价。当获得期望水平的免疫原性时，可以将免 疫的动物放血并分离血清并储存，和/或将动物用于产生MAb。
[0044] 在人单克隆抗体的情况下，技术人员可以改为简单寻找已经知道已产生免疫应答 的个体，在这种情况下，为已暴露于肺炎链球菌或用Pneumovax?23免疫。为了鉴定具有对 多种肺炎链球菌菌株的免疫性的主体，技术人员通常能够从主体获得血液并测试它们的肺 炎链球菌抗体。本发明中描述的许多抗体以这种方式使用来自其他健康个体(之前感染过 肺炎链球菌）的外周血来产生。
[0045] 免疫或从如上所述的之前感染过的主体中获得细胞后，具有产生抗体潜力的体细 胞(具体为B淋巴细胞（B细胞))选择用于MAb产生方案。这些细胞可以从活检的脾或淋巴 结或从循环血中获得。来自免疫的动物的产生抗体的B淋巴细胞随后与无限增殖的骨髓瘤 细胞(通常为与已免疫的动物相同的物种或人或人/小鼠嵌合细胞之一)的细胞融合。适合 用于产生杂交瘤融合程序的骨髓瘤细胞系优选为非抗体产生性的，具有高融合效率，和酶 缺乏，所述酶缺乏进而使得无法在某些仅支持期望的融合细胞(杂交瘤）生长的选择性培养 基中生长。
[0046] 可以使用大量骨髓瘤细胞的任何一种，如本领域技术人员所知的（Goding,第 65-66页，1986; Campbell,第75-83页，1984)。例如，其中免疫的动物是小鼠时， 技术人员可以使用 P3_X63/Ag8、X63-Ag8. 653、NS1/1. Ag 4 1、Sp210-Agl4、F0、NS0/U、 MPC-11、MPC11-X45-GTG I. 7 和 S194/5XX0 Bul ;对于大鼠，技术人员可以使用 R210. RCY3、 Y3-Ag L 2. 3、IR983F 和 4B210 ;并且 U-266、GM1500-GRG2、LICR-L0N-HMy2 和 UC729-6 均 可用于与人细胞融合相关中。一种具体的鼠骨髓瘤细胞是NS-I骨髓瘤细胞系（也称为 P3-NS-l-Ag4-l)，其通过要求细胞系储存号GM3573可容易地获自NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository。可以使用的另一种小鼠骨髓瘤细胞系是8-氮鸟噪呤抗性的小 鼠鼠骨髓瘤SP2/0非生产者细胞系。更近期，已描述了用于与人B细胞的另外的融合伴侣 系，包括 KR12 (ATCC CRL-8658; K6H6/B5 (ATCC CRL-1823 SHM-D33 (ATCC CRL-1668)和 HMMA2. 5 (Posner等，1987)。本发明中的抗体使用HMMA2. 5系产生。
[0047] 用于生成产生抗体的脾或淋巴结细胞和骨髓瘤细胞的杂交物的方法通常包括将 体细胞与骨髓瘤细胞以2:1的比例混合，尽管在促进细胞膜融合的一种或多种试剂(化学 的或电的）存在的情况下，该比例可以分别从约20:1至约1:1变化。使用仙台病毒的融合 方法已由Kohler和Milstein (1975; 1976)描述，以及使用聚乙二醇（PEG)的方法，诸如 37% (v/v) PEG,由Gefter等（1977)描述。电诱导的融合方法的使用也是合适的（Goding, 第71-74页，1986)。本发明中分泌流感抗体的杂交瘤可以通过电融合获得。
[0048] 融合程序通常以低频率(约I X KT6至I X KT8)产生活的杂交物。然而，这 不会产生问题，因为通过在选择性培养基上培养，活的、融合的杂交物与亲代、未融合的 (infused)细胞(特别是未融合的骨髓瘤细胞，其将通常持续不确定地分裂）被区分。选择 性培养基通常是含有阻断组织培养基中核苷酸的重新合成的试剂的培养基。示例性且优选 的试剂是氨基蝶呤、甲氨蝶呤、和偶氮丝氨酸。氨基蝶呤和甲氨蝶呤阻断嘌呤和嘧啶的重新 合成，而偶氮丝氨酸仅阻断嘌呤的合成。在使用氨基蝶呤或甲氨蝶呤时，培养基补充有次黄 嘌呤和胸苷作为核苷酸的来源（HAT培养基)。在使用偶氮丝氨酸时，培养基补充有次黄嘌 呤。如果B细胞来源是转化EB病毒（EBV)的人B细胞系，则加入哇巴因，以排除未与骨髓 瘤融合的EBV转化的系。
[0049] 优选的选择培养基是HAT或具有哇巴因的HAT。只有能够运行核苷酸补救途径的 细胞才能够在HAT培养基中存活。骨髓瘤细胞缺乏补救途径的关键酶，例如次黄嘌呤磷酸 核糖基转移酶（HPRT)，并且它们无法存活。B细胞可以运行该途径，但它们在培养中具有有 限的生存期，并且通常在约两周内死亡。因此，只有能够在选择性培养基中存活的细胞是那 些从骨髓瘤和B细胞形成的杂交物。当用于融合的B细胞来源是EBV转化的B细胞系时，同 样，也使用哇巴因用于杂交物的药物选择，因为EBV转化的B细胞对于药物杀死是易感的， 而所用的骨髓瘤伴侣被选为哇巴因抗性的。
[0050] 培养提供了杂交瘤的群，从中选择特定的杂交瘤。通常，通过培养细胞由在微量滴 定板中单克隆稀释，随后测试单独的克隆上清液(在约2至3周后）的期望的反应性来完成 杂交瘤的选择。测定应该是灵敏、简单且快速的，诸如放射性免疫测定、酶免疫测定、细胞毒 性测定、噬菌斑测定、点免疫结合测定等。
[0051] 然后将所选的杂交瘤连续稀释或通过流式细胞术分选进行单细胞分选，并克隆入 单独的抗体产生细胞系，该克隆可以随后不确定地繁殖以提供mAb。可以以两种基本方式 开发细胞系的MAb产生。可以将杂交瘤样品注射(通常注射入腹膜腔）入动物(例如小鼠)。 任选地，注射前用烃引发动物，尤其是油诸如姥鲛烷（四甲基十五烷)。当以这种方式使用人 杂交瘤时，优选注射无免疫应答的小鼠，诸如SCID小鼠，以防止肿瘤排斥。注射的动物发生 由融合的细胞杂交物产生的分泌特异性单克隆抗体的肿瘤。动物的体液诸如血清或腹水液 可随后放出以提供高浓度的MAb。单独的细胞系还能够体外培养，其中Mb天然分泌入培养 基中，从中可以容易地将它们以高浓度获得。或者，可以体外使用人杂交瘤细胞系来在细胞 上清液中产生免疫球蛋白。细胞系可以适应于在无血清培养基中生长以优化回收高纯度的 人单克隆免疫球蛋白的能力。
[0052] 如需要，由任一种方法产生的Mb可以进一步纯化，其使用过滤、离心和多种层析 方法诸如FPLC或亲和层析。本发明的单克隆抗体的片段可以获自纯化的单克隆抗体，其 通过包括用酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化在内的方法，和/或通过化学还原裂解二硫 键。或者，本发明包括的单克隆抗体片段可以使用自动肽合成仪来合成。
[0053] 还考虑的是可以使用分子克隆方法来产生单克隆抗体。为此，可以从杂交瘤系分 离RNA并通过RT-PCR获得抗体基因并克隆入免疫球蛋白表达载体。或者，从分离自细胞系 的RNA制备组合的免疫球蛋白噬菌粒文库，并通过使用病毒抗原淘选来选择表达合适抗体 的噬菌粒。该方法相对于常规杂交瘤技术的优点是多至大约IO 4倍的抗体可以在单一轮次 中产生并筛选，并且通过H链和L链组合产生新的特异性，其进一步增加了发现合适抗体的 机会。
[0054] 教导了用于本发明中的抗体产生的其他美国专利(其每一个通过引用并入本文） 包括美国专利5, 565, 332,其描述了使用组合方法产生嵌合抗体；美国专利4, 816, 567,其 描述了重组免疫球蛋白制备；和美国专利4, 867, 973,其描述了抗体治疗剂缀合物。
[0055] B.本发明的抗体 在第一种情况下，本发明的抗体可以通过其结合特异性来确定。通过使用本领域技术 人员熟知的技术来评估给定抗体的结合亲和力，本领域技术人员能够确定此类抗体是否落 入本权利要求的范围内。
[0056] 在本发明的上下文中，抗体特异性涉及肺炎链球菌血清型。存在由Pneumovax?23 代表的24种不同血清型，由以下命名所代表：1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、 14、15B、17F、18C、19F、19A、20、22F、23F、33F和CWPS。代表性抗体的CDR区序列包括在所附 的序列表中。
[0057] 另一个分类本发明的抗体的方法是通过它们的活性。这可以包括在存在或不存在 补体的情况下，中和或杀灭肺炎链球菌的能力。最后，抗体可以具体参考重/轻链可变区序 列来确定。本发明人提供了以下抗体，其在调理吞噬测定（OPA)中已显示出针对肺炎链球 菌的活性，所述测定测量抗体介导的通过吞噬细胞系的细菌摄入。这也可以通过如表2中 所述的可变区来呈现。
[0058] C.抗体序列的工程化 在多个实施方案中，技术人员可以由于多种原因选择来工程化鉴定的抗体的序列，诸 如改进表达、改进交叉反应性或消除脱靶（off-target)结合。以下内容是用于抗体工程化 的相关技术的一般讨论。
[0059] 可以培养杂交瘤，然后裂解细胞，并提取总RNA。可以使用随机六聚物用RT来产生 RNA的cDNA拷贝，并随后使用预期扩增全部人可变基因序列的PCR引物的多重混合物来进 行PCR。可以将PCR产物克隆入pGEM-T Easy?载体，然后通过自动DNA测序使用标准载体 引物来测序。结合和中和测定可以使用从杂交瘤上清液收集并通过FPLC使用蛋白G柱纯 化的抗体来进行。
[0060] 重组全长IgG抗体可以通过将来自克隆载体的重链和轻链Fv DNA亚克隆入第二 载体中，诸如Lonza pConlgGl或pConK2质粒载体，转染入293自由式（Freestyle)细胞或 Lonza CHO细胞来产生，并且抗体可以随后从细胞上清液中收集并纯化。
[0061] pCon Vectors?是再表达完整抗体的简单方法。恒定区载体是一组提供一定范围 的克隆入PEE载体中的免疫球蛋白恒定区载体的载体。这些载体提供具有人恒定区的全长 抗体的简单构建和GS System?的便利。
[0062] 抗体分子将包含片段（诸如F(ab'）、F(ab'）2)，其例如通过mAb或例如可经重 组方法产生的单链免疫球蛋白的蛋白水解切割来产生。此类抗体衍生物是单价的。在一 个实施方案中，此类片段可以彼此组合，或与其他抗体片段或受体配体组合，以形成"嵌合" 结合分子。值得注意的是，此类嵌合分子可以含有能够结合相同分子的不同表位的取代基 (substituent)〇
[0063] 在相关的实施方案中，抗体是公开的抗体的衍生物，例如包含与公开的抗体中的 CDR序列相同的CDR序列的抗体(例如，嵌合或CDR移植抗体)。在仍进一步的实施方案中， 抗体是完全人重组抗体。或者，技术人员可以期望进行更多轻微改变，诸如向抗体分子引入 保守改变。在进行这种改变中，可以考虑氨基酸的亲水指数。亲水氨基酸指数在赋予对蛋 白的相互作用的生物学功能上的重要性是本领域通常理解的（Kyte和Doolittle, 1982)。 接受的是氨基酸的相关亲水特征促成产生的蛋白的二级结构，其进而确定蛋白与其他分子 (例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等）的相互作用。
[0064] 在本领域还理解的是基于亲水性可以有效地进行相似氨基酸的取代。美国专利 4, 554, 101 (其通过引用并入本文）陈述了蛋白的最高局部平均亲水性（由其相邻的氨基 酸的亲水性所控制）与蛋白的生物学特性相关。如美国专利4, 554, 101中详述，以下亲水 性值已分配于氨基酸残基：碱性氨基酸：精氨酸（+3. 0)、赖氨酸（+3. 0)和组氨酸（-0. 5); 酸性氨基酸：天冬氨酸（+3.0 ± 1)、谷氨酸（+3.0 ± 1)、天冬酰胺（+0.2)和谷氨酰胺 (+0. 2);亲水性、非离子氨基酸：丝氨酸（+0. 3)、天冬酰胺（+0. 2)、谷氨酰胺（+0. 2)和苏氨 酸（-0. 4)，含硫的氨基酸：半胱氨酸（-1. 0)和甲硫氨酸（-1. 3);疏水性、非芳香族氨基酸： 缬氨酸（-1. 5)、亮氨酸（-1. 8)、异亮氨酸（-1. 8)、脯氨酸（-0. 5 ± 1)、丙氨酸（-0. 5)和甘 氨酸（〇);疏水性、芳香族氨基酸：色氨酸（-3. 4)、苯丙氨酸（-2. 5)和酪氨酸（-2. 3)。
[0065] 理解的是氨基酸可以取代为另一个具有相似亲水性的氨基酸，并且产生生物学上 或免疫学上修饰的蛋白。在这种改变中，优选其亲水性值在± 2以内的氨基酸的取代，在 ± 1以内的那些是尤其优选的，并且在± 0.5以内的那些是甚至更尤其优选的。
[0066] 如上所述，氨基酸取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如其疏水性、 亲水性、电荷、大小等。考虑多种前述特征的示例性取代是本领域技术人员熟知的，并且包 括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；和缬氨 酸、亮氨酸和异亮氨酸。
[0067] 本发明还考虑同种型修饰。通过修饰Fc区以具有不同的同种型，可以实现不同的 功能性。例如，对IgG 1的改变可以增加抗体依赖性细胞细胞毒性，转换至A类可以改进组 织分布，并且转换至M类可以改进效价。
[0068] 修饰抗体可以通过本领域技术人员已知的任何技术来进行，包括通过标准分子生 物学技术来表达，或多肽的化学合成。用于重组表达的方法在本文件中其他处提及。
[0069] D.单链抗体 单链可变片段（scFv)是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区的融合体，用短(通常为丝 氨酸、甘氨酸）接头连接在一起。该嵌合分子保留原始免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒 定区并引入了接头肽。该修饰通常使特异性未改变。这些分子历史上产生以促进噬菌体展 示，其中极大地方便于表达作为单一肽的抗原结合域。或者，scFv可以直接从来源于杂交 瘤的亚克隆的重链和轻链产生。单链可变分子缺少在完整抗体分子中发现的恒定Fc区，并 因此缺少用于纯化抗体的常用结合位点（例如，蛋白A/G)。这些片段常常可以使用蛋白L 来纯化/固定，因为蛋白L与κ轻链的可变区相互作用。
[0070] 柔性接头通常由促螺旋和促转角（helix- and turn-promoting)氨基酸残基诸如 丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸构成。然而，其他残基也可以起作用。Tang等（1996)使用噬菌体 展示作为快速选择来自蛋白接头文库的单链抗体（scFvs)的定制接头的方法。构建随机接 头文库，其中重链和轻链可变域的基因通过编码可变组成的18个氨基酸多肽的区段来连 接。scFv所有组成成分(约5 X IO6个不同成员）在丝状噬菌体上展示并进行用半抗原的 亲和力选择。选择的变体的群展示出结合活性中的显著增加，但保留了相当大的序列多样 性。筛选1054个单独的变体随后产生了以可溶形式有效产生的催化活性的scFv。序列分 析揭示了接头中在V h C末端后两个残基的保守脯氨酸和在其他位置处精氨酸和脯氨酸的 丰富，其作为所选范围的唯一共同特征。
[0071] 本发明的重组抗体还可能涉及允许受体二聚化或多聚化的序列或部分。此类序列 包括来源于IgA的那些，其允许缀合有J链的多聚物的形成。另一个多聚化结构域是Gal4 二聚化结构域。在其他实施方案中，链可以用试剂诸如生物素/抗生物素蛋白来修饰，其允 许两种抗体的组合。
[0072] 在一个单独的实施方案中，单链抗体可以通过使用非肽接头或化学单元将受体轻 链和重链结合来产生。通常，轻链和重链将在不同细胞中产生，纯化并随后以合适方式连接 在一起（即，重链的N末端经合适的化学桥键（chemical bridge)连接至轻链的C末端)。 [0073] 使用交联剂来形成将两个不同分子的官能团连在一起形成分子桥键，例如稳定剂 和混凝剂。然而，应考虑可以产生相同类似物的二聚体或多聚体或者不同类似物构成的 异聚化复合体（heteromeric complex)。为了以分步（step-wise)方式连接两种不同的 化合物，可以使用消除不想要的均聚物形成的异-双功能交联剂（hetero-bifunctional cross-linker)〇
[0074] 示例性异-双功能交联剂包含两个反应基团：一个与伯胺基反应（S卩N-羟基琥珀 酰亚胺）并且另一个与巯基反应(例如吡啶基二硫化物、马来酰亚胺、卤素等)。经伯胺反应 基团，交联剂可以与一个蛋白（例如选择的抗体或片段）的一个或多个赖氨酸残基反应并且 经过巯基反应基团，已连接至第一蛋白的交联剂可以与另一个蛋白（例如选择剂）的半胱氨 酸残基(游离巯基）反应。
[0075] 优选将使用在血液中具有合理的稳定性的交联剂。许多类型的含二硫键的接头是 已知的，其可以成功用于缀合靶向剂和治疗/预防剂。含有为空间位阻的二硫键的接头可 以证实提供更大的体内稳定性，防止靶向肽在达到作用位点之前释放。这些接头因此是一 组连接剂。
[0076] 另一种交联剂是SMPT，其是含有二硫键的双功能交联剂，所述二硫键通过邻近的 苯环和甲基而是"空间位阻的"。认为二硫键的空间位阻起到保护键免于硫醇盐阴离子(诸 如谷胱甘肽，其可能存在于组织和血液中）的攻击的作用，并由此帮助防止在递送连接的试 剂到目标位点前缀合物的解偶联。
[0077] SMPT交联剂，如同许多其他已知的交联剂一样，带来交联官能团诸如半胱氨酸的 SH或伯胺(例如，赖氨酸的ε氨基）的能力。另一种可能类型的交联剂包括异-双功能光 反应性苯基叠氮化物，其含有可裂解的二硫键，诸如磺基琥珀酰亚胺基-2-(对-叠氮水杨 酰基氨基）乙基-1，3' -二硫代丙酸盐/酯。N-羟基-琥珀酰亚胺基与伯氨基反应并且苯 基叠氮化物(光裂解后）非选择性地与任何氨基酸残基反应。
[0078] 除了位阻的交联剂外，无位阻的接头也可以一同使用。其他有用的交联剂(不考 虑含有或生成受保护的二硫化物）包括SATA，SPDP和2-亚氨基硫烷（iminothiolane) (Wawrzynczak和Thorpe, 1987)。使用此类交联剂是本领域熟知的。另一个实施方案涉及 使用柔性接头。
[0079] 美国专利4, 680, 338描述了用于产生配体与含胺的聚合物和/或蛋白的缀合物， 尤其是用于与螯合剂、药物、酶、可检测标记等形成抗体缀合物的双功能接头。美国专利 5, 141，648和5, 563, 250公开了含有在许多温和条件下可裂解的不稳定键的可裂解的缀合 物。该接头尤其可用于目标试剂可以与接头直接成键并且裂解导致释放活性试剂的情况 中。具体用途包括向蛋白（诸如抗体）或药物添加游离氨基或游离巯基。
[0080] 美国专利5, 856, 456提供了用于连接多肽组分以形成融合蛋白例如单链抗体的 肽接头。该接头长度多至约50个氨基酸，含有至少出现一次的带电荷的氨基酸(优选精 氨酸或赖氨酸）随后为脯氨酸，并且其特征在于更大的稳定性和降低的聚集。美国专利 5, 880, 270公开了含氨基氧基的接头，其用于多种免疫诊断和分离技术。
[0081] 在具体的实施方案中，抗体是重组抗体，其适合于在细胞内部作用一此类抗体称 为"细胞内抗体（intrabodies)"。这些抗体可能由于多种机制(诸如通过改变胞内蛋白运 输）而干扰目标功能，干扰酶功能，并阻断蛋白-蛋白或蛋白-DNA相互作用。以许多方式， 它们的结构模拟上文讨论的那些单链和单结构域抗体或与其相似。的确，单转录物/单链 是允许在目标细胞内胞内表达的重要特征，并还使得蛋白运输过细胞膜更可行。然而，需要 另外的特征。
[0082] 影响细胞内抗体治疗剂的实现的两个主要问题是递送，包括细胞/组织靶向，和 稳定性。关于递送，已可以使用多种方法，诸如组织定向递送，使用细胞类型特异性启动子， 基于病毒的递送和使用细胞穿透性/膜易位肽。关于稳定性，方法通常为通过蛮力（brute force)来筛选(包括涉及噬菌体展示并可以包括序列成熟或共有序列发展的方法)，或者为 更加定向的修饰诸如插入稳定序列(例如，Fc区、分子伴侣蛋白序列、亮氨酸拉链)和二硫化 物置换/修饰。
[0083] 细胞内抗体可能需要的另一个特征是细胞内靶向的信号。可以将细胞内抗体(或 其他蛋白)靶向亚细胞区域诸如细胞质、细胞核、线粒体和ER的载体已被设计并且是可商购 的（Invitrogen Corp. ; Persic 等，1997) 〇
[0084] 由于它们进入细胞的能力，细胞内抗体具有其他类型抗体无法实现的额外用途。 在本发明抗体的情况下，在活细胞中与MUC1胞质结构域相互作用的能力可以干扰与MUC1 CD相关的功能，诸如信号传递功能(结合至其他分子）或寡聚体形成。尤其是，考虑此类抗 体可以用于抑制MUCl二聚体形成。
[0085] E.纯化 在某些实施方案中，本发明的抗体可以纯化。如本文所用术语"纯化的"意指组合物， 其可从其他组分中分离，其中将所述蛋白纯化至相对于其天然可获状态的任何程度。因此， 纯化的蛋白还指这样的蛋白，其从它可能天然存在的环境中分离出来。当使用术语"基本上 纯化的"时，该用法将指这样的组合物，其中蛋白或肽形成了所述组合物的主要组分，诸如 构成所述组合物中约50%、约60%、约70%、约80%、约90%、约95%或更多的蛋白。
[0086] 蛋白纯化技术对于本领域技术人员是熟知的。这些技术在一个水平上涉及细胞环 境至多肽和非多肽级分的粗分级。已将多肽从其他蛋白中分离后，目标多肽可以使用层析 和电泳技术进一步纯化以实现部分或完全的纯化(或纯化至同质性)。尤其适合于制备纯肽 的分析方法是离子交换层析、排阻层析；聚丙烯酰胺凝胶电泳；等电聚焦。蛋白纯化的其他 方法包括用硫酸铵、PEG、抗体等沉淀或通过热变性，随后离心；凝胶过滤、反向、羟基磷灰石 和亲和层析；和这些及其他技术的组合。
[0087] 在纯化本发明的抗体中，可以期望在原核生物或真核生物表达系统中表达多肽， 并使用变性条件提取蛋白。多肽可以使用亲和柱(其结合多肽的标签化部分)从其他细胞组 分中纯化。如本领域中通常熟知的，认为可以改变进行多个纯化步骤的次序，或者可以去除 某些步骤，并仍产生用于制备基本上纯化的蛋白或肽的合适方法。
[0088] 通常，完全抗体是分级的利用试剂（即，蛋白A)，其结合抗体的Fc部分。或者，抗原 可以同时用于纯化并选择合适抗体。此类方法通常利用结合至支持物(诸如柱、滤器或珠） 上的选择剂。将抗体结合至支持物上，去除污染物(例如洗掉)，并通过施用条件(盐、热等） 将抗体释放。
[0089] 定量蛋白或肽纯化的程度的多种方法对于本领域技术人员在本公开的教导下将 是已知的。这些包括例如确定活性级分的比活，或者通过SDS/PAGE分析评估级分内多肽的 量。用于评估级分的纯度另一个方法是计算所述级分的比活，将其与起始提取物的比活比 较，并因而计算纯化程度。用于代表活性的量的实际单位将当然依赖于所选的进行纯化的 具体测定技术和表达的蛋白或肽是否展示出可检测的活性。
[0090] 已知用不同的SDS/PAGE条件，多肽的迁移可以改变，有时显著地改变（Capaldi 等，1977)。因此，应理解在不同的电泳条件下，纯化的或部分纯化的表达产物的表观分子 量可以改变。
[0091] IV.肺炎链球菌感染的被动免疫和治疗 A.制剂和施用 抗体的被动转移，称为人工获得性被动免疫，通常涉及使用静脉内或肌内注射。此类免 疫通常持续仅短时间周期，但提供了立即保护。抗体将在适合于注射的载体诸如无菌的且 可注射的（syringeable)载体中配制。因此，本发明提供包含抗肺炎链球菌抗体和用于产生 所述抗体的抗原的药物组合物。此类组合物包含预防上或治疗上有效量的抗体或其片段， 以及药学上可接受的载体。在具体的实施方案中，术语"药学上可接受的"意指通过联邦或 州政府的管理机构批准或列于美国药典或其他通常认可的用于动物且更具体为人中的药 典里。术语"载体"指稀释剂、赋形剂、或媒介物，用其可施用治疗剂。此类药学上载体可以 是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿 物油、芝麻油等。当药物组合物静脉内施用时，水是具体的载体。盐水溶液和含水葡萄糖和 甘油溶液也可以用作液体载体，尤其是可注射的溶液。其他合适的药物赋形剂包括淀粉、葡 萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯 化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇（propylene, glycol)、水、乙醇等。
[0092] 如需要，组合物还可以含有少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。这些组合物 可以采用溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。口服制剂可以 包括标准载体诸如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合 适的药物试剂的实例描述于"Remington's Pharmaceutical Sciences"。此类组合物将 含有预防上或治疗上有效量的抗体或其片段，优选以纯化的形式，连同合适量的载体，以 向患者提供合适施用的形式。制剂应适合施用模式，其可以是口服、静脉内、动脉内、颊内 (intrabuccal)、鼻内、喷雾、支气管吸入，或通过机械通气递送。
[0093] 通常，本发明的组合物的成分单独地或以单位剂量形式(例如，在气密密封容器内 诸如表明活性剂的量的安瓿或小袋（sachette)内作为干燥的冷冻干燥粉末或无水浓缩物） 混合在一起来提供。当组合物通过输注施用时，它可以用含无菌药用级水或盐水的输注瓶 来配制。当组合物通过注射施用时，可以提供一安瓿的用于注射的无菌水或盐水，从而使成 分在施用前可以混合。
[0094] 本发明的组合物可以配制为中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子诸 如来源于盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的那些形成的盐，和与阳离子诸如来源于钠、钾、 铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的那些形成的盐。 [0095] B.组合疗法 为了增加本发明的抗体疗法的有效性，可以期望将该治疗与其他在治疗或预防肺炎链 球菌感染上有效的药剂例如抗生素组合。该方法可以涉及向患者同时施用本发明的抗体和 一种或多种其他药剂。这可以通过使用单一的药物组合物来实现，所述药物组合物包括两 种药剂，或通过同时施用两种不同组合物来实现，其中一种组合物包括本发明的抗体并且 另一种包括一种或多种第二药剂。
[0096] 两种疗法可以以任何次序给予，并且可以以范围在数分钟至数周的时间间隔在另 一种治疗之前或之后。在其中其他药剂分开应用的实施方案中，技术人员应通常保证在每 次递送时刻之间重要的时间周期没有失效，从而使药剂仍能够实施对患者的有利地组合效 果。在这种情况下，考虑可以在彼此的约12-24 h内并且更优选在彼此的约6-12 h内施用 两种药物手段（modality)。在某些情况下，可以期望明显延长治疗时间周期，然而，其中在 各次施用之间过去了若干天（2、3、4、5、6或7)至若干周（1、2、3、4、5、6、7或8)。
[0097] 可以使用多种组合，本发明的抗体治疗是"A"，并且第二治疗为"B"：
【权利要求】
1. 包含多种抗体的人单克隆抗体组，其中所述组中的抗体结合至少15种肺炎链球菌 (Ytre/?乙OCOCCW51 白勺血i青型。
2. 权利要求1的抗体组，其中所述组中的抗体结合至少18种肺炎链球菌血清型。
3. 权利要求2的抗体组，其中所述组中的抗体结合21种肺炎链球菌血清型。
4. 权利要求3的抗体组，其中至少15种抗体是血清型特异性的。
5. 权利要求4的抗体组，其中至少17种抗体是血清型特异性的。
6. 权利要求5的抗体组，其中19种抗体是血清型特异性的。
7. 权利要求1的抗体组，其中所述抗体组连接至支持物。
8. 权利要求7的抗体组，其中所述支持物是珠、浸渍片、滤器、膜、板、或芯片。
9. 权利要求1的抗体组，其中所述血清型选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、 17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5。
10. 权利要求1的抗体组，其中至少一种抗体与两种血清型反应。
11. 评估主体中的肺炎链球菌的方法，其包括从所述主体中获得第一含抗体的样品，并 评估所述样品中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体组的结合，其中所述组中的抗体结 合至少15种肺炎链球菌的血清型。
12. 权利要求11的方法，其中所述组中的抗体结合至少18种肺炎链球菌血清型。
13. 权利要求12的方法，其中所述组中的抗体结合21种肺炎链球菌血清型。
14. 权利要求13的方法，其中至少15种抗体是血清型特异性的。
15. 权利要求14的方法，其中至少17种抗体是血清型特异性的。
16. 权利要求15的方法，其中19种抗体是血清型特异性的。
17. 权利要求11的方法，其中所述抗体组连接至支持物。
18. 权利要求17的方法，其中所述支持物是珠、浸渍片、滤器、膜、板、或芯片。
19. 权利要求11的方法，其中所述血清型选自1、2、3、4、5、6B、8、9N、9V、11B、14、15B、 17卩、18(：、19六、19卩、20、22卩、23卩、33卩和(：耶5。
20. 权利要求11的方法，其中至少一种抗体与两种血清型反应。
21. 权利要求11的方法，其中所述主体是无免疫应答的和/或60岁龄或更老。
22. 权利要求11的方法，其中所述主体怀疑具有肺炎链球菌。
23. 权利要求11的方法，其进一步包括如果发现所述第一含抗体的样品对一种或多种 血清型是阳性的，则用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。
24. 权利要求11的方法，其进一步包括如果发现所述第一含抗体的样品对血清型19A 和/或19F是阳性的，则用万古霉素或左氧氟沙星治疗所述主体。
25. 权利要求11的方法，其中所述第一含抗体的样品是血液、血清、血浆、痰或唾液。
26. 权利要求11的方法，其进一步包括从所述主体中获得第二含抗体的样品，并评估 所述第二样品中的抗体与包含多种抗体的人单克隆抗体组的结合，其中所述组中的抗体结 合至少15种肺炎链球菌的血清型。
27. 权利要求26的方法，其中所述第二含抗体的样品是血液、血清、血浆、痰或唾液。
28. 权利要求26的方法，其中在确定所述第一含抗体的样品对于一种或多种血清型是 阳性后用抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价 的降低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是有效的。
29. 权利要求26的方法，其中在确定所述第一含抗体的样品对于一种或多种血清型是 阳性后用抗生素治疗所述主体，并且对来自所述第一样品的血清型的抗体效价中不存在降 低表明所述抗肺炎链球菌疗法对治疗肺炎链球菌是无效的。
30. 权利要求29的方法，其进一步包括用不同的抗肺炎链球菌疗法治疗所述主体。
31. 抗体，其选择性结合肺炎链球菌，其中所述抗体具有如表2中所述的重链和轻链 CDR。
32. 权利要求31的抗体，其中所述抗体为单链抗体。
33. 权利要求31的抗体，其中所述抗体为单结构域抗体。
34. 权利要求31的抗体，其中所述抗体为嵌合抗体。
35. 权利要求31的抗体，其中所述抗体为Fab片段。
36. 权利要求31的抗体，其中所述抗体为IgG。
37. 权利要求31的抗体，其中所述抗体进一步包含与其连接的抗生素。
38. 权利要求37的抗体，其中所述抗生素经光不稳定的接头连接至所述抗体。
39. 权利要求37的抗体，其中所述抗生素经酶促切割的接头连接至所述抗体。
40. 权利要求31的抗体，其中所述抗体缀合至纳米颗粒或脂质体。
41. 治疗主体中的肺炎链球菌感染的方法，其包括向所述主体施用权利要求31的抗 体。
42. 权利要求41的方法，其进一步包括向所述主体施用第二抗肺炎链球菌治疗。
43. 权利要求42的方法，其中所述第二抗肺炎链球菌治疗与所述抗体同时给予。
44. 权利要求42的方法，其中所述第二抗肺炎链球菌治疗在所述抗体之前和/或之后 给予。
45. 权利要求41的方法，其中所述抗体为单链抗体。
46. 权利要求41的方法，其中所述抗体为单结构域抗体。
47. 权利要求41的方法，其中所述抗体为嵌合抗体。
48. 权利要求41的方法，其中所述抗体为Fab片段。
49. 权利要求41的方法，其中所述抗体为IgG。
50. 权利要求41的方法，其中所述抗体进一步包含与其连接的抗生素。
51. 权利要求41的方法，其中所述抗生素经光不稳定的接头连接至所述抗体。
52. 权利要求41的方法，其中所述抗生素经酶促切割的接头连接至所述抗体。
53. 权利要求41的方法，其中所述抗体缀合至脂质体或纳米颗粒。
54. 权利要求41的方法，施用多抗肺炎链球菌抗体。
55. 权利要求54的方法，其中所述多抗肺炎链球菌抗体结合2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、 65、70、75、80、85、90、95或100种肺炎链球菌血清型。
【文档编号】G01N33/53GK104364650SQ201380017988
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2013年1月14日 优先权日:2012年2月1日
【发明者】K.史密斯 申请人:俄克拉荷马医学研究基金会