一种电化学酶传感器的制备方法
【专利摘要】一种电化学酶传感器的制备方法，涉及食品检测、药物、环境分析以及工业控制的【技术领域】，也涉及特别涉及聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的应用【技术领域】，通过聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子来固载生物酶而制备得到。该电化学酶传感器制备简单，重现性好，性能稳定，用于生物分子的电化学检测分析具有分析时间短、操作简单、较高的特异性和灵敏度等特点，可用于生物分子的定量检测。
【专利说明】一种电化学酶传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品检测、药物、环境分析以及工业控制的【技术领域】，也涉及特别涉及聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的应用【技术领域】。
【背景技术】
[0002]生物传感器通常由生物识别元件和信号转换器件两个部分组成。生物传感器可按照生物特异性授予机制或信号转换模式分类。按照生物化学受体的不同，可将生物传感器分为酶传感器、微生物传感器、免疫传感器、组织传感器和细胞传感器等。生物酶传感器是以酶作为敏感膜，通过换能器将待测物在敏感膜表面上发生的一系列生化反应，然后由化学信号转换为电信号输出并记录。由于酶具有高度的专一性及催化性能，从而实现对目标物的准确检测。具有操作简单，污染少等优点，是比较理想的生物传感器。
[0003]但是，现有的生物酶传感器在使用时媒介体存在电极制作过程复杂、易污染电极、干扰测定、生物相容性差等缺点。
[0004]石墨烯具有优异的电学、热学和力学性能，它可以被广泛应用于超级电容器、电池、能量储存器件、纳米复合材料和生物传感器等。近年来，由于纳米技术逐步进入生物传感器领域，并引发突破性的进展。
[0005]为了充分地发挥石墨烯在功能和性能上的优势，克服其易聚集的弱点，将石墨烯片包裹在形态均匀、规则的高分子微球上形成高分子/石墨烯复合粒子。采用石墨烯与聚苯乙烯进行共混制备石墨烯基聚苯乙烯复合纳米粒子，该复合纳米粒子比表面积大、导电性好、生物相容性高等优点。
[0006]生物分子被固定在纳米尺寸的界面上，其固定密度可提高几个数量级，有利于拓宽检测的线性范围。将纳米材料与高分子材料结合制成复合纳米材料，该复合纳米粒子具有比表面积大、导电性好、生物相容性高等优点增加了生物活性物质的固定量、表面活性位点，提供了良好的反应微环境，加快了电子传递过程，缩短了信号的响应时间，使生物传感器的灵敏度、检测范围、重复性得到了明显增强。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服上述生物大分子检测方法的缺陷，建立一种充分利用聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子优势的电化学酶传感器的制备方法。
[0008]以聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子固载生物酶，制得电化学酶传感器。
[0009]具体地:先将聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子分散于壳聚糖溶液中，再与生物酶混合，形成混合溶液；然后将混合溶液滴涂于洁净的玻碳电极表面，再将电极置于低温条件下干燥，制得电化学酶传感器。
[0010]本发明以聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子固载生物酶，制得电化学酶传感器，构建了一个高灵敏的自动化的生物酶电化学酶传感器，将制得的电化学酶传感器置于检测体系中，用电化学工作站，经过前处理的玻碳电极作为工作电极，饱和甘汞电极作为辅助电极，钼片电极作为对电极，采用该三电极体系检测其电流信号。聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子能充分发挥石墨烯良好导电性的优势，克服其易聚集的弱点。聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子具有很大的比表面积，为促进生物分子和电极表面之间的直接电子传递提供了一个有利的微环境。该方法利用聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子与生物酶结合，制得的电化学酶传感器可以是葡萄糖传感器、乙酰胆碱传感器以及乙醇传感器等，利用生物酶具有高度的专一性及催化性能，从而实现对目标物的准确检测，所制备的电化学酶传感器具有灵敏度高，检测限低，重复性和稳定性较好等优点，是比较理想的生物传感器，可在食品检测、药物、环境分析以及工业控制等领域得到应用。
[0011]本发明先将生物酶与水混合形成生物酶的水溶液，然后再将生物酶的水溶液与分散有聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的壳聚糖溶液混合，得到混合均匀的聚苯乙烯/石墨烯-壳聚糖-生物酶混合溶液。
[0012]另外，所述生物酶的水溶液中生物酶的质量分数与分散在壳聚糖溶液中的聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的质量分数相同。此混合比不仅有利于有利于电子的传输，而且有利于壳聚糖溶液成膜。
[0013]在壳聚糖溶液中的聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的质量分数为2.0 mg/mL。该浓度最有利于电子的转移，浓度太大或太小都不利于电子的传输。
[0014]为了得到洁净的玻碳电极，在滴涂前，先将玻碳电极用中位粒径为0.05 μ m的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，然后放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。清除电极表面上的氧化性或还原性的物质，得到重现好的电极表面。如不进行该操作，则会影响实验结果，或降低实验结果的可信性，甚至得到错误的结论。
[0015]所述稀硝酸水溶液由体积比为1:1的硝酸和水混合组成。该混合比有利于电极表面氧化性或还原性物质的溶解，从而清除残留的杂质。
[0016]本电化学酶传感器，具体有以下优点:
(I)聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子能充分发挥石墨烯良好导电性的优势，克服其易聚集的弱点，具有比表面积大、生物相容性好、吸附能力强、表面活性高等优点，用于生物分子的固定，可以增加固定的分子数量，从而增强反应信号。
[0017](2)聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子具有良好的导电性，将其用来固载生物酶，制得的传感器为促进酶和电极表面之间的直接电子传递提供一个有利的微环境。具有线性关系好，检测限低，稳定性和重复性好等优点。
[0018](3)由于酶具有高度的专一性及催化性能，从而实现对目标物的准确检测。具有操作简单，污染少等优点，是比较理想的生物传感器。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为葡萄糖氧化酶电化学生物传感器制备及工作原理示意图。
[0020]图2为葡萄糖氧化酶电化学生物传感器对葡萄糖测定的计时电流曲线关系图。
[0021]图3为葡萄糖氧化酶电化学生物传感器在磷酸缓冲溶液中加入葡萄糖后的1-T曲线关系图。【具体实施方式】
[0022]电化学酶传感器可以是葡萄糖传感器、乙酰胆碱传感器以及乙醇传感器等。
[0023]配制稀硝酸水溶液:以硝酸和去离子水以体积比为1:1的比例混合，待用。
[0024]一、实施例1:
1、制备葡萄糖氧化酶电化学生物传感器。
[0025](I)将玻碳电极用中位粒径为0.05 μ m的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0026](2)取聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子2.0 mg，将其分散于I mL壳聚糖溶液中，配成2.0 mg/mL的聚苯乙烯/石墨烯的壳聚糖溶液，然后与等浓度的葡糖糖氧化酶混合，形成聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子与葡萄糖氧化酶的混合溶液。
[0027](3)取聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子与葡萄糖氧化酶的混合溶液滴涂于预处理电极表面，将电极放置于冰箱中于4 °C的低温条件下干燥12小时，制得葡萄糖氧化酶传感器。
[0028]2、应用:
将制得的葡萄糖酶传感器置于检测体系中，用电化学工作站，采用三电极体系，检测其电流信号。
[0029]三电极体系是以经过前处理的玻碳电极作为工作电极，以饱和甘汞电极作为辅助电极，以钼片电极作为对电极。
[0030]如图1所示，当样品中的待分析物扩散至修饰了聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子-葡萄糖氧化酶的电极表面，在电极表面发生以下反应:
GOD (FAD) +2e +2H+ GOD (FADH2)(I)
GOD (FADH2) +O2 — GOD (FAD) +H2O2(2)
Glucose+GOD (FAD)+O2 — Gluconolactone+GOD (FADH2) (3)
经由电极将化学信号转换为电信号输出并记录，从得出待测物浓度。
[0031]如图2所示的是葡萄糖氧化酶电化学生物传感器对葡萄糖测定的计时电流曲线，是指在饱和的空气条件下，于0.1MpH 7.0磷酸缓冲溶液中持续搅拌，连续滴加葡萄糖溶液得到的电流响应曲线。修饰电极在9 s内达到90 %的稳定电流,这个响应是随葡萄糖溶度的增加线性增加，通过计算得到线性响应范围为1.0X10 4M-3.2X10 3 M，灵敏度为
5.067 mAM 1Cm 2，检测限为 2.89X 10 6M (S/N=3)。
[0032]如图3所示为葡萄糖氧化酶电化学生物传感器的电极在pH 7.0磷酸缓冲溶液中，加入I mM葡萄糖后的1-T曲线。当电位为-0.5 V时，研究了葡萄糖氧化酶电化学生物传感器对葡萄糖测定的稳定性，在不断搅拌条件下，向pH 7.0磷酸缓冲溶液中加入I mM葡萄糖后，电流急剧上升，经过2000 s后电流稳定，说明制备葡萄糖氧化酶电化学生物传感器有良好的稳定性。
[0033]通过葡萄糖氧化酶电化学生物传感器对0.1 mM葡萄糖的电流响应可考察传感器测定的精密度。平行进行5次测定，相对标准偏差为0.69%，在最优化条件下重复制作3个葡萄糖传感器，分别加入0.1 mM葡萄糖测定5次，相对标准偏差为0.69%，表明该传感器有较好的重现性。
[0034]以上的电化学测试表明，所制备的生物酶电极具有对葡萄糖快速的电化学响应能力，较宽的线性范围，低检测线，较高的选择性以及良好的重复性和稳定性。
[0035]二、实施例 2:
1、制备乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器。
[0036](I)取聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子2.0 mg,将其分散于I mL壳聚糖溶液中，配成2.0 mg/mL的聚苯乙烯/石墨烯溶液，超声分散，用该溶液与金胶，配制成1:1的聚苯乙烯/石墨烯-金胶溶液，超声分散，然后与等浓度的乙酰胆碱酯酶混合。
[0037](2)所用玻碳电极用中位粒径为0.05 μ m的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0038](3)取聚苯乙烯/石墨烯复合材料与乙酰胆碱酯酶的混合溶液滴涂于预处理电极表面，将电极放置于冰箱中于4 °C的低温条件下干燥12小时，制得乙酰胆碱酯酶传感器。
[0039]2、应用:
将制得的乙酰胆碱酯酶传感器置于检测体系中，用电化学工作站，采用三电极体系，检测其电流信号。
[0040]通过与上例的相同试验同样证明所制备的电化学传感器具有较高的灵敏度、较好的稳定性和重复性、低的检测限以及对乙酰胆碱酯酶的快速响应性能。
[0041]三、实施例3:
1、制备乙醇氧化酶电化学生物传感器:
(I)将玻碳电极用中位粒径为0.05 μ m的氧化铝粉抛光，用去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面。
[0042](2)取聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子2.0 mg，将其分散于I mL壳聚糖溶液中，配成约2.0 mg/mL的聚苯乙烯/石墨烯的壳聚糖溶液，然后与等浓度的乙醇氧化酶混合，形成聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子与乙醇氧化酶的混合溶液。
[0043](3)取聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子与乙醇氧化酶的混合溶液滴涂于预处理电极表面，将电极放置于冰箱中于4 °C的低温条件下干燥12小时，制得乙醇氧化酶传感器。
[0044]2、应用:
将制得的乙醇氧化酶电化学生物传感器置于检测体系中，用电化学工作站，采用三电极体系，检测其电流信号。
[0045]通进与例I的同样试验也能证明所制备的传感器检测快速，精密度高，抗干扰能力好。同时该传感器所用材料简单易得，制作方法简单，成本低廉，能够对乙醇进行准确地检测，因此有望能在食品等快速酒精检测领域得以应用。
【权利要求】
1.一种电化学酶传感器的制备方法，其特征在于以聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子固载生物酶，制得电化学酶传感器。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于先将聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子分散于壳聚糖溶液中，再与生物酶混合，形成混合溶液；然后将混合溶液滴涂于洁净的玻碳电极表面，再将电极置于低温条件下干燥，制得电化学酶传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于先将生物酶与水混合形成生物酶的水溶液，然后再将生物酶的水溶液与分散有聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的壳聚糖溶液混八口 ο
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述生物酶的水溶液中生物酶的质量分数与分散在壳聚糖溶液中的聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的质量分数相同。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于在壳聚糖溶液中的聚苯乙烯/石墨烯复合纳米粒子的质量分数为2.0 mg/mL。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于在滴涂前，先将玻碳电极用中位粒径为0.05 μ m的氧化铝粉抛光，再以去离子水冲洗掉残留的氧化铝粉，然后放入稀硝酸水溶液中超声清洗，最后依次用乙醇和二次蒸馏水清洗电极表面，得到洁净的玻碳电极。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于所述稀硝酸水溶液由体积比为1:1的硝酸和水混合组成。
【文档编号】G01N27/26GK103926280SQ201410175555
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月29日 优先权日:2014年4月29日
【发明者】李娟 , 刘亭亭 申请人:扬州大学