一种检测农、兽药残留的装置制造方法
【专利摘要】本发明公开了一种检测农、兽药残留的装置，包括上样系统和量热免疫传感器，上样系统包括加样阀，加样阀通过管道分别与样品罐，底物罐，载液罐，再生液罐连接；量热免疫传感器包括HPLC泵，HPLC泵通过管道分别与第一、第二热调节器的上端口连接，第一、第二热调节器的下端口分别通过管道与第一、第二ProteinG琼脂糖凝胶柱14的下端口连接，第一、第二ProteinG琼脂糖凝胶柱的上端口分别通过管道与废液罐11连接，N2000色谱数据工作站10与惠斯通电桥7电连接，惠斯通电桥分别与第一、第二ProteinG琼脂糖凝胶柱电连接，加样阀4与HPLC泵6通过管道连接。本发明的装置高特异性快速检测农、兽药残留。
【专利说明】一种检测农、兽药残留的装置
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种检测农、兽药残留的装置。
【背景技术】
[0002]量热生物传感器探索的是生物反应中最基本的特性一吸热或产热。几乎所有的物理、化学、生物的反应，尤其在酶催化反应中都涉及热量交换。尤其在酶催化反应中，通常伴有20?IOOkJ moF1的热量变化。1962年Clark和Lyons首先提出酶电极概念并对酶催化反应进行量热研究。上世纪70年代人们制备出了如今我们称为量热生物传感器的装置。其共性之一就是使用固定化酶，一方面降低成本另一方面提高了反应效能。量热计的研究着力于量热装置的研发，主要检测经酶催化底物后流动相温度的变化。与其它分析方法相比较，固定化酶与量热技术的结合具有诸多优势，诸如:可对大多数生物样品进行分析、固定化酶可重复使用、检测不受样品光学或离子环境特性的干扰，可实现连续流动相下检测、检测过程简便、可引入参比部件等。酶量热传感器最先用于对葡萄糖及尿素的检测，然后逐渐应用于临床医学、环境监测、食品卫生、工业过程监测等领域。由于检测热信号反应总的放热量，因而缺乏检测特异性。对于由于载液与样品在PH及离子强度上的不匹配造成的非特异性信号响应可以通过对样品稀释加以克服，也可以在检测装置中放入惰性的参比柱进行信号差异性检测以去除非特异性信号。量热检测方法中由于上样量太少不足以产生放热信号的稳定态而是以峰的形式出现。在一定底物浓度下峰高正比于放热量。峰面积及峰上升斜率与底物浓度呈线性关系。
[0003]量热酶联免疫吸附检测(TELISA)是基于酶联免疫吸附检测方法基本原理并结合量热仪检测标记酶催化特异性底物产生的热信号的检测方法。
[0004]专利CN103134930A公开了一种“用于农药阿特拉津的量热酶联免疫吸附(TELISA)检测方法”，其固相载体采用表面氨基化修饰的可控多孔玻璃珠(CPG)。在应用这个仪器检测过程中需要使用戊二醛等化学试剂将抗体与固相载体偶联，偶联效果的不同，直接影响了检测的重复性。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测农、兽药残留的装置。
[0006]本发明的技术方案概述如下:
[0007]—种检测农、兽药残留的装置，包括上样系统和量热免疫传感器，上样系统包括加样阀4，加样阀4通过管道分别与样品罐1，底物罐2，载液罐3，再生液罐5连接；量热免疫传感器包括HPLC泵6，HPLC泵6通过管道分别与第一热调节器8的上端口和第二热调节器13的上端口连接，第一热调节器8的下端口通过管道与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱9下端口连接，第二热调节器13的下端口通过管道与第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱14的下端口连接,第一 ProteinG琼脂糖凝胶反应柱9上端口和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱的上端口 14分别通过管道与废液罐11连接，N2000色谱数据工作站10与惠斯通电桥7电连接，惠斯通电桥分别与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱电连接,所述加样阀4与HPLC泵6通过管道连接。
[0008]本发明的优点:本发明的一种检测农、兽药残留的装置中的Protein G琼脂糖凝胶能对小鼠源IgG抗体Fe片段特异结合，省去现有技术的化学偶联过程，避免CPG玻璃珠与抗体偶联效果不同对检测结果的影响，进一步增强了方法通用性的优势。本发明可以实现不同目标物的检测。发明的装置可以高特异性快速检测农、兽药残留，为其在食品安全检测领域的进一步应用奠定基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1本发明一种检测农、兽药残留的装置示意图。
[0010]图2检测阿特拉津(ATR)原理示意图。
[0011]图3羧基化阿特拉津_β -内酰胺酶质谱图。
[0012]图4本发明检测阿特拉津(ATR)标准曲线。
【具体实施方式】
[0013]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明。
[0014]一种检测农、兽药残留的装置，包括上样系统和量热免疫传感器，上样系统包括加样阀4，加样阀4通过管道分别与样品罐1，底物罐2，载液罐3，再生液罐5连接；量热免疫传感器包括HPLC泵6，HPLC泵6通过管道分别与第一热调节器8的上端口和第二热调节器13的上端口连接，第一热调节器8的下端口通过管道与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱9下端口连接，第二热调节器13的下端口通过管道与第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱14的下端口连接,第一 ProteinG琼脂糖凝胶反应柱9上端口和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱的上端口 14分别通过管道与废液罐11连接，Ν2000色谱数据工作站10与惠斯通电桥7电连接，惠斯通电桥分别与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱电连接,所述加样阀4与HPLC泵6通过管道连接。
[0015]本发明一种检测农、兽药残留的装置，包括上样系统和量热免疫传感器，经上样系统通入载液并平衡流动体系后，使用经过优化配比的β_内酰胺酶与羧基化抗原偶联物、抗体复合物，以及待测样品(样品罐)经孵育后，由上样系统进入量热免疫传感器的ProteinG琼脂糖凝胶上的识别位点，接下来通过上样系统加入氨苄西林溶液(底物罐)经酶催化产生热信号，并被惠斯通电桥收集、转化后在Ν2000色谱数据工作站(酶量热工作站)上，以峰信号显示并记录。检测完成后使用再生液(再生液罐)对量热免疫传感器中管路进行冲洗，对ProteinG琼脂糖凝胶进行再生。在检测过程中产生的废液进入废液罐。最终根据数据绘制检测标准曲线。
[0016]实施例1
[0017]以农药(除草剂)阿特拉津为目标物采用本发明的装置进行检测:
[0018]I实验方法
[0019]1.1 β -内酰胺酶与羧基化阿特拉津分子的偶联
[0020](I)将9.2mg羧基化阿特拉津溶于200 μ L N, N- 二甲基亚酰胺(DMF)中，震荡使其完全溶解；[0021](2)将6.0mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入步骤⑴的混合溶液中，溶解完全后搅拌下快速加入10.2mgl-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC-HCL)，室温避光搅拌反应8小时，得到溶液A ；
[0022](3)称取催化活性为IOku的内酰胺酶溶解溶于双蒸水6.5mL中，制备溶液B，
4°C保存；
[0023](4)室温下，500转/分钟搅拌下，将溶液A滴加到溶液B中，滴加完毕后置于4°C继续缓慢搅拌12小时；
[0024](5)将步骤(4)产物用0.02mol/L、pH = 7.0磷酸盐缓冲液4°C透析I天，期间换透析液4次，得羧基化阿特拉津-β -内酰胺酶，分装于EP管中，_20°C保存备用。对所得产物进行质谱鉴定(MALD1-T0F-MS)，结果图3。
[0025]由图3结果可知，β -内酰胺酶的分子量约为28678，如图3Β。偶联后羧基化阿特拉津-β-内酰胺酶分子量约为31783，如图3Α。羧基化阿特拉津分子量约为283.38。因此可知产物中蛋白-小分子摩尔比约为11:1，证明偶联成功。
[0026]1.2采用本发明的一种检测农、兽药残留的装置检测阿特拉津:
[0027](I)将经0.22 μ m针式滤器过滤及超声除气后的含质量浓度为2%的二甲基亚砜的0.02mol ?ΛρΗ = 7.0的PBS载液贮存于载液罐3中，通过加样阀4，以流速400 μ LmirT1作为载液平衡流动体系通过量热免疫传感器，获得稳定的基线信号；
[0028](2)以 0.02mol L—1，pH = 7.0 的 PBS 为溶剂配制梯度浓度为 OngmL'0.lQngmL、0.39ng mL \ 0.78ng mL \ 1.56ng mL \ 3.12ng mL \ 6.25ng mL \ 12.5ng mL \ 25ng mL 1的阿特拉津溶液，取上述的九个溶液各IOOmL中分别加入阿特拉津单克隆抗体(ATR-mAb)([8.F.20] (ab30533) abeam? 1:8000 稀释)12.5 μ L、羧基化阿特拉津-β -内酰胺酶(1.1获得用载液稀释，稀释1:100) 2.5 μ L和甘油，并使甘油的终浓度为0.5 % (v/v)，将上述各个混合溶液在37°C下孵育30分钟，依次放入样品罐(I)中待上样；
[0029](3)加样阀加入步骤(2)中获得的第一个混合液(其中阿特拉津浓度为OngmL—1)，通过量热免疫传感器，获得信号；(孵育过程中产生的抗原抗体复合物及酶标抗原抗体复合物竞争结合ProteinG琼脂糖凝胶上的识别位点)
[0030](4)使用加样阀加入贮存在底物罐2中的4mmol l-1的氨苄西林一载液溶液(1.2步骤(1)获得)通过量热免疫传感器，经酶催化产生热信号，并被惠斯通电桥收集、转化后在N2000色谱数据工作站(酶量热工作站)上以峰信号显示；
[0031](5)使用加样阀加入贮存于再生液罐5中再生液，再生液是以双蒸水为溶剂，加入DMSO(二甲基亚砜)使终质量浓度为1%，加入Triton X-100使终质量浓度为0.1%，加入氯化钠，使终摩尔浓度为0.5mol L—1，加入甘氨酸-盐酸(Gly-HCl)，使终摩尔浓度0.1molL—1，pH = 2.3，流速1200 μ LmirT1通过量热免疫传感器，再生12分钟；
[0032](6)将流速调整回400 μ L mirT1，体系用载液平衡，经约14分钟基线恢复；
[0033](7)重复步骤(2-6)直到第九个浓度的阿特拉津溶液样品的测试完成。[0034]反应原理如图2所示:
[0035]1.3用检测农、兽药残留的装置检测阿特拉津方法的建立
[0036]1.3.1标准曲线的获取:
[0037]在优化条件的基础上，将测得的信号值整理并绘制检测方法标准曲线，如图4所示。方法线性范围:0.728-4.831ng/mL，灵敏度(IC50) = 1.808ng/mL，最低检测限:0.728ng/
mLo
[0038]1.3.2方法特异性实验:
[0039]选用了与ATR结构类似的西玛津(Simazine，SIM)、三聚氰胺、三聚氰酸及结构差异较为明显的类似物毒死蜱测定方法的特异性，结果见表1:
[0040]表1.ATR结构及功能类似物交叉反应性
[0041]
【权利要求】
1.一种检测农、兽药残留的装置，包括上样系统和量热免疫传感器，上样系统包括加样阀(4)，加样阀(4)通过管道分别与样品罐(1)，底物罐(2)，载液罐(3)，再生液罐(5)连接；量热免疫传感器包括HPLC泵出)，HPLC泵(6)通过管道分别与第一热调节器(8)的上端口和第二热调节器(13)的上端口连接，第一热调节器(8)的下端口通过管道与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱(9)下端口连接，第二热调节器(13)的下端口通过管道与第二ProteinG琼脂糖凝胶柱(14)的下端口连接,第一 ProteinG琼脂糖凝胶反应柱(9)上端口和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱的上端口(14)分别通过管道与废液罐(11)连接，N2000色谱数据工作站(10)与惠斯通电桥(7)电连接，惠斯通电桥分别与第一 ProteinG琼脂糖凝胶柱和第二 ProteinG琼脂糖凝胶柱电连接，所述加样阀(4)与HPLC泵(6)通过管道连接。
【文档编号】G01N35/00GK104007275SQ201410279494
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月19日 优先权日:2014年6月19日
【发明者】宁保安, 孙思明, 高志贤, 彭媛, 白家磊, 郄志伟 申请人:中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所