一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下：(1)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液为母液，将核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，水浴20～40分钟，得成膜液；(2)将制得的成膜液于相对湿度为50％～80％的条件下，在固体基底上制备蜂窝状多孔薄膜；(3)将蜂窝状多孔薄膜从固体基底上剥离并置于荧光标记配对链溶液中，于3～5℃恒温条件下振荡孵化反应60～80分钟，然后用水冲洗3～5次，用氮气吹干，即得。本发明基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法操作简单，成本低廉，尺度可控，解决了常规方法一般需要较昂贵的仪器设备、特殊的掩膜或印章材料的问题。
【专利说明】—种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，属于生物检测【技术领域】。
【背景技术】
[0002]自1994年Frangois等通过呼吸图案法(又称水滴模板法)成功制备蜂窝状薄膜以来，蜂窝状有序多孔薄膜的制备和理论研究发展迅速。蜂窝状有序多孔薄膜是指孔径大小均一且排列有序的薄膜材料。通过对湿度、气温、溶剂、成膜材料的选择可制备孔径从几个纳米到几十个微米的薄膜。众所周知，有序空间结构材料通常比无序结构具有更优良的性能，如单晶硅在半导体方面的应用，石墨烯材料的开发以及超顺磁性在超导材料方面的应用等。
[0003]突光分析法(fluorescence analysis)是某些物质的分子能吸收能量而发射出突光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法。荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少、可测参数多和方法简便等优点，它在生化分析中的应用较广泛。在此基础上，与生物免疫学结合，荧光免疫传感器获得迅猛发展。荧光免疫传感器是利用免疫试剂作为分子识别单元，以荧光试剂或酶为标记物，通过抗体与抗原之间的特异性反应从而达到对抗原或抗体的测定。
[0004]适配体具有与抗体相类似的性质，但是在许多方面还体现出了优于抗体的特点。由于其分子量较小，可化学合成、稳定性好、没有毒性等优点，在许多方面体现了传统的免疫学与化学分子识别无可比拟的优势，近年来受到化学家的广泛关注。尤其在分析化学学科，核酸适配体的基础研究及应用研究均呈现了快速发展的趋势，已成为分析化学进展最迅速的学科前沿之一。经过20多年的研究发展，它在国内外化学、生物学、纳米材料、蛋白质科学、物理和数学等多种研究领域得到极大的发展。尤其在生物学领域，适配体作为一种识别元素，对蛋白质(抗原、肿瘤标志物)检测，重金属离子检测，细胞成像，小分子检测等方面，有其特殊贡献。
【发明内容】
[0005]针对现有技术的不足，本发明提供一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法。
[0006]术语说明:
[0007]水滴模板法:利用凝结并自组织有序排列的水滴为模板，从而构筑有序蜂窝状多孔薄膜的一种方法，此方法具有方便、快速和廉价等优点，作为模板的水滴可以自然蒸发而除去，且孔洞的尺寸可以通过改变相关的实验参数进行方便地调控，所以，水滴模板法在多孔薄膜材料的构筑中被广泛应用。
[0008]本发明的技术方案如下:
[0009]一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0010](I)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液为母液，将核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在60?80°C条件下水浴20?40分钟，得成膜液；
[0011]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为1.0?5.0mg.ml/1,所述的聚乙二醇浓度为0.1?2.0mg.mL—1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠浓度为0.1?5mg.mL—1,所述的核酸适配体浓度为5?50 μ mo I.L-1 ；
[0012](2)将步骤(I)制得的成膜液于相对湿度为50%?80%的条件下，利用水滴模板法在固体基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0013](3)将步骤(2)制得的蜂窝状多孔薄膜从固体基底上剥离并置于荧光标记配对链溶液中，于3?5°C恒温条件下振荡孵化反应60?80分钟，然后用水冲洗3?5次，用氮气吹干，即得基于核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0014]所述的荧光标记配对链溶液的浓度为0.01?0.1 μ mo I.L—1，ρΗ6.9?7.I ;
[0015]所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中核酸适配体相配对的链。
[0016]本发明制备的核酸适配体薄膜外观呈薄膜状态。
[0017]根据本发明，优选的，步骤(I)中所述的聚苯乙烯的分子量为150000?500000，所述的聚乙二醇的分子量为200?400 ；
[0018]所述的核酸适配体为凝血酶适配体、可卡因适配体、腺苷适配体、血红素适配体或赭曲霉素适配体。
[0019]根据本发明，优选的，步骤(2)中所述的固体基底为硅片、玻璃片、钢铁片或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄片(PET)。
[0020]根据本发明，优选的，步骤(3)中所述的荧光标记配对链溶液的溶剂为pH 7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲溶液。
[0021]根据本发明，一种利用上述基于核酸适配体薄膜的荧光传感器对生物及无机小分子进行检测的方法，所述的生物及无机小分子为凝血酶、可卡因、腺苷、血红素或赭曲霉素；
[0022]步骤如下:
[0023](I)配制不同浓度的检测目标物的标准溶液，将核酸适配体薄膜加入到检测目标物标准溶液中，3?5°C恒温条件下振荡孵化60?80分钟，然后倒入比色皿中，去除核酸适配体薄膜；
[0024](2)用荧光分光光度计扫描步骤(I)所得溶液的荧光强度，根据所得响应信号与检测目标物的标准溶液浓度之间的关系，绘制检测目标物浓度与荧光强度的对应的标准工作曲线；
[0025](3)将待测样品超声粉碎为样品溶液，将核酸适配体薄膜加入到样品溶液中，3?5°C恒温条件下振荡孵化60?80分钟，然后倒入比色皿中，去除核酸适配体薄膜；
[0026](4)用荧光分光光度计扫描步骤(3)所得溶液的荧光强度，将得到的荧光强度对应标准工作曲线，得到待测样品的浓度。
[0027]根据本发明，优选的，步骤(I)中去除核酸适配体薄膜的方式为:倾倒振荡孵化后的溶液，留核酸适配体薄膜于比色皿中。
[0028]根据本发明，优选的，步骤(2)中荧光分光光度计扫描的具体参数为:Ex = 440nm、狭缝宽 5nm, Em = 517.53nm、狭缝宽 18nm。
[0029]本发明检测目标物标准工作曲线范围的变化可通过调节检测目标物标准溶液中的核酸适配体的浓度来实现。同时可通过改变二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠的用量、相对湿度、温度、溶液蒸发速度等条件来控制蜂窝状多孔薄膜的孔径的大小，实现在一个微区上的形貌调控。
[0030]本发明通过大量实验对荧光标记配对链与核酸适配体之间相互作用的条件进行优化选择(pH和饱和时间)；通过荧光分析法，对待测目标物与核酸适配体薄膜作用过程的条件进行优化选择，快速便捷的得到检测目标物浓度与荧光强度的线性范围。
[0031]本发明突出的特点和有益效果是:
[0032]1、本发明基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法操作简单，成本低廉，尺度可控，解决了常规方法一般需要较昂贵的仪器设备、特殊的掩膜或印章材料的问题。
[0033]2、本发明通过一步法合成了具有生物活性的核酸适配体蜂窝状多孔薄膜，拓宽了蜂窝状多孔薄膜的应用领域。
[0034]3、本发明制得的基于核酸适配体薄膜的荧光传感器，可实现对多种目标物的检测，可在生物芯片、组织工程材料、细胞工程和生物传感器等领域得到广泛的应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为本发明实施例1制得的凝血酶核酸适配体薄膜的明场图片。
[0036]图2为本发明实施例1制得的凝血酶核酸适配体薄膜的荧光图片。
[0037]图3为本发明实施例2中凝血酶浓度与荧光强度对应的标准工作曲线。
【具体实施方式】
[0038]下面通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。
[0039]实施例中所用原料均为常规原料，市购产品，所用设备均为常规设备。
[0040]其中，核酸适配体(Apt)、荧光标记配对链(6-羧基荧光素[简称6-FAM]对部分配对的寡核苷酸片段进行标记得到)，色谱纯，宝生物工程(大连)有限公司有售；二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠、凝血酶，Sigma中国有限公司有售。
[0041]实施例中水滴模板法制备蜂窝状多孔薄膜的具体方法为:用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液为母液，将核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在60?80°C条件下水浴20?40分钟，得成膜液；待成膜液冷却至室温，在相对湿度为50%?80%的条件下，用微量注射器移取6 μ L成膜液滴加到处理干净的基底材料上。溶剂挥发使成膜液表面的水蒸气发生冷凝形成水滴进入到溶液中，压缩的水滴在对流和毛细管力等的作用下发生自组装，在此过程中起到多孔结构形成的模板，溶剂和水滴继挥发完毕后，原来水滴所处的位置便形成空洞，最终导致有序多孔材料的形成。
[0042]实施例1、凝血酶核酸适配体薄膜荧光传感器的制备
[0043]凝血酶适配体总链:H00C-GGTTGGTG TGG TTGG CTCT CTCT CTCT。
[0044]荧光标记的配对链-.CCkk GGTG TGG AACC_6_FAM。其中，荧光标记的配对链是部分配对，通过互补配对作用对凝血酶适配体薄膜进行荧光标记，在对凝血酶检测过程中，部分配对的荧光标记的配对链由于不如凝血酶与凝血酶适配体的作用强烈从而被取得发生脱落，继而导致溶液中荧光标记配对链变化，荧光分析表现为荧光强度的变化，通过凝血酶浓度与溶液荧光强度的关系来检测凝血酶。
[0045]一种基于凝血酶核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0046](I)用聚苯乙烯(分子量为150000)/聚乙二醇(分子量为200)的甲苯溶液为母液，将凝血酶核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在80°C条件下水浴30分钟，得成膜液；
[0047]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为2.0mg.πι?Λ所述的聚乙二醇浓度为0.5mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠浓度为0.1mg.ml/1,所述的凝血酶核酸适配体浓度为10 μ mo I.L—1 ；
[0048](2)将步骤⑴制得的成膜液于相对湿度为60%的条件下，利用水滴模板法在硅片基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0049](3)将步骤(2)制得的蜂窝状多孔薄膜从硅片基底上剥离并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mo 1-Γ1荧光标记配对链溶液中振荡孵化反应70分钟，恒温4°C，然后用水冲洗5次，用氮气吹干，即得基于凝血酶核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0050]所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中凝血酶核酸适配体相配对的链。
[0051]本实施例制得的凝血酶核酸适配体薄膜的荧光显微镜明场图片，如图1所示，由图1可知，本实施例成功制备了凝血酶核酸适配体蜂窝状薄膜材料；如图2所示，经凝血酶核酸适配体的荧光标记配对链孵化后，由于碱基互补相互作用，适配体与配对链特异性结合，从而得到了荧光多孔薄膜材料。
[0052]实施例2、凝血酶的检测
[0053]一种利用实施例1制得的基于凝血酶核酸适配体薄膜的荧光传感器对凝血酶进行检测的方法，步骤如下:
[0054](I)配制浓度为 0mol/L、0.43 X 10 10mol/L、0.85 X 10 10mol/L、1.7 X 10 10mol/L、
2.55X l(Tlclmol/L、3.4X l(Tlclmol/L、4.25X l(Tlclmol/L、5.1 X l(Tlclmol/L、6.8X l(T10mol/L、
8.5X10-10mol/L的凝血酶的标准溶液，将实施例1制得的凝血酶核酸适配体薄膜加入到SmL凝血酶的标准溶液中，振荡孵化70分钟，恒温4°C，然后倒入比色皿中，去除核酸适配体薄膜；
[0055](2)用荧光分光光度计扫描步骤(I)所得溶液的荧光强度，根据所得响应信号与凝血酶的标准溶液浓度之间的关系，绘制凝血酶浓度与荧光强度的对应的标准工作曲线，如图3所示；凝血酶浓度在0.85X 10_1QmOl/L?5.1 X 10?I/L范围内孵化溶液的荧光强度与凝血酶浓度呈正线性相关，其检测限为0.28 X 1^moI/L ；
[0056](3)将凝血酶待测样品超声粉碎为样品溶液，将凝血酶核酸适配体薄膜加入到样品溶液中，振荡孵化70分钟，恒温4°C，然后倒入比色皿中，去除凝血酶核酸适配体薄膜；
[0057](4)用荧光分光光度计扫描步骤(3)所得溶液的荧光强度，将得到的荧光强度对应标准工作曲线，得到待测样品的浓度。
[0058]因此，凝血酶浓度的检测范围为0.85X 10-1Qmol/L?5.1 X 10-lclmol/L，其检测限为
0.28 X I(TicW)I/L。
[0059]实施例3、可卡因核酸适配体薄膜荧光传感器的制备
[0060]一种基于可卡因核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0061](I)用聚苯乙烯(分子量为200000)/聚乙二醇(分子量为400)的甲苯溶液为母液，将可卡因核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在75°C条件下水浴20分钟，得成膜液；
[0062]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为1.0mg.ι?ΙΛ所述的聚乙二醇浓度为
0.1mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠浓度为0.2mg.ml/1,所述的可卡因核酸适配体浓度为20 μ mo I.L—1 ；
[0063](2)将步骤(I)制得的成膜液于相对湿度为60%的条件下，利用水滴模板法在玻璃片基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0064](3)将步骤⑵制得的蜂窝状多孔薄膜从玻璃片基底上剥离并置于2mL、pH6.9、
0.05 μ mo 1-Γ1荧光标记配对链溶液中振荡孵化反应70分钟，恒温4°C，然后用水冲洗5次，用氮气吹干，即得基于可卡因核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0065]所述的荧光标记配对链溶液为经荧光素标记后的与步骤(I)中可卡因核酸适配体相配对的链。
[0066]实施例4、血红素核酸适配体薄膜荧光传感器的制备
[0067]一种基于血红素核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0068](I)用聚苯乙烯(分子量为200000)/聚乙二醇(分子量为400)的甲苯溶液为母液，将血红素核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在85°C条件下水浴40分钟，得成膜液；
[0069]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为3.0mg 所述的聚乙二醇浓度为Img *mL_1,所述的二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠浓度为Img 所述的血红素核酸适配体浓度为 40 μ mo I.L-1 ；
[0070](2)将步骤⑴制得的成膜液于相对湿度为50%的条件下，利用水滴模板法在玻璃片基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0071](3)将步骤⑵制得的蜂窝状多孔薄膜从玻璃片基底上剥离并置于2mL、pH7.1、
0.05 μ mo 1-Γ1荧光标记配对链溶液中振荡孵化反应75分钟，恒温5°C，然后用水冲洗5次，用氮气吹干，即得基于血红素核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0072]所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中血红素核酸适配体相配对的链。
[0073]实施例5、腺苷核酸适配体薄膜突光传感器的制备
[0074]一种基于腺苷核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0075](I)用聚苯乙烯(分子量为250000)/聚乙二醇(分子量为400)的甲苯溶液为母液，将腺苷核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在80°C条件下水浴30分钟，得成膜液；
[0076]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为5.0mg iL4,所述的聚乙二醇浓度为2mg *mL_1,所述的二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠浓度为3mg 所述的腺苷核酸适配体浓度为30 μ mol.L 1 ；
[0077](2)将步骤(I)制得的成膜液于相对湿度为80%的条件下，利用水滴模板法在钢铁片基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0078](3)将步骤(2)制得的蜂窝状多孔薄膜从钢铁片基底上剥离并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mol.ml/1荧光标记配对链溶液中振荡孵化反应70分钟，恒温4°C，然后用水冲洗4次，用氮气吹干，即得基于腺苷核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0079]所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中腺苷核酸适配体相配对的链。
[0080]实施例6、赭曲霉素核酸适配体薄膜荧光传感器的制备
[0081]一种基于赭曲霉素核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下:
[0082](I)用聚苯乙烯(分子量为500000)/聚乙二醇(分子量为300)的甲苯溶液为母液，将赭曲霉素核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在80°C条件下水浴30分钟，得成膜液；
[0083]成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为3.0mg.πι?Λ所述的聚乙二醇浓度为
0.8mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠浓度为4mg.ml/1,所述的赭曲霉素核酸适配体浓度为50 μ mol.L—1 ；
[0084](2)将步骤(I)制得的成膜液于相对湿度为60%的条件下，利用水滴模板法在硅片基底上制备蜂窝状多孔薄膜；
[0085](3)将步骤⑵制得的蜂窝状多孔薄膜从硅片基底上剥离并置于2mL、pH7.0、
0.05 μ mol -Γ1荧光标记配对链溶液中振荡孵化反应70分钟，恒温4°C，然后用水冲洗4次，用氮气吹干，即得基于赭曲霉素核酸适配体薄膜的荧光传感器；
[0086]所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中赭曲霉素核酸适配体相配对的链。
【权利要求】
1.一种基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，步骤如下: (1)用聚苯乙烯/聚乙二醇的甲苯溶液为母液，将核酸适配体、二(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠与母液混合，在75?85°C条件下水浴20?40分钟，得成膜液； 成膜液中，所述的聚苯乙烯浓度为1.0?5.0mg.ml/1,所述的聚乙二醇浓度为0.1?2.0mg.ml/1,所述的二(2-乙基己基)琥拍酸酯磺酸钠浓度为0.1?5mg.ml/1,所述的核酸适配体浓度为5?50 μ mo I.L—1 ； (2)将步骤(I)制得的成膜液于相对湿度为50%?80%的条件下，利用水滴模板法在固体基底上制备蜂窝状多孔薄膜； (3)将步骤(2)制得的蜂窝状多孔薄膜从固体基底上剥离并置于荧光标记配对链溶液中，于3?5°C恒温条件下振荡孵化反应60?80分钟，然后用水冲洗3?5次，用氮气吹干，即得基于核酸适配体薄膜的荧光传感器； 所述的荧光标记配对链溶液的浓度为0.01?0.1 μ mo I.L—1，pH6.9?7.1 ; 所述的荧光标记配对链为经荧光素标记后的与步骤(I)中核酸适配体相配对的链。
2.根据权利要求1所述的基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述的聚苯乙烯的分子量为150000?500000，所述的聚乙二醇的分子量为200 ?400。
3.根据权利要求1所述的基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述的核酸适配体为凝血酶适配体、可卡因适配体、腺苷适配体、血红素适配体或赭曲霉素适配体。
4.根据权利要求1所述的基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的固体基底为硅片、玻璃片、钢铁片或聚对苯二甲酸乙二醇酯薄片。
5.根据权利要求1所述的基于核酸适配体薄膜的荧光传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的荧光标记配对链溶液的溶剂为pH 7.0的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液。
6.—种利用权利要求1-5任一项所述的基于核酸适配体薄膜的突光传感器对生物及无机小分子进行检测的方法，所述的生物及无机小分子为凝血酶、可卡因、腺苷、血红素或赫曲霉素； 步骤如下: (1)配制不同浓度的检测目标物的标准溶液，将核酸适配体薄膜加入到检测目标物标准溶液中，3?5°C恒温条件下振荡孵化60?80分钟，然后倒入比色皿中，去除核酸适配体薄膜； (2)用荧光分光光度计扫描步骤(I)所得溶液的荧光强度，根据所得响应信号与检测目标物的标准溶液浓度之间的关系，绘制检测目标物浓度与荧光强度的对应的标准工作曲线.-^4 ， (3)将待测样品超声粉碎为样品溶液，将核酸适配体薄膜加入到样品溶液中，3?5°C恒温条件下振荡孵化60?80分钟，然后倒入比色皿中，去除核酸适配体薄膜； (4)用荧光分光光度计扫描步骤(3)所得溶液的荧光强度，将得到的荧光强度对应标准工作曲线，得到待测样品的浓度。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(I)中去除核酸适配体薄膜的方式为:倾倒振荡孵化后的溶液，留核酸适配体薄膜于比色皿中。
8.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中荧光分光光度计扫描的具体参数为:Ex = 440nm、狭缝宽 5nm, Em = 517.53nm、狭缝宽 18nm。
【文档编号】G01N21/64GK104198455SQ201410475213
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年9月17日 优先权日:2014年9月17日
【发明者】范大伟, 夏秀龙, 魏琴 申请人:济南大学