β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了用于β-肾上腺素受体激动剂多残留检测的多簇抗原、抗体及其制备方法。本发明包括八种β-激动剂多簇抗原，分别为克伦特罗-莱克多巴胺-牛血清白蛋白、克伦特罗-沙丁胺醇-牛血清白蛋白、沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白、克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白、克伦特罗-莱克多巴胺-卵清蛋白、克伦特罗-沙丁胺醇-卵清蛋白、沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白及克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白，并采用所述的多簇抗原通过动物免疫制备了四种可用于β-肾上腺素受体激动剂多残留检测的宽谱特异性抗体。
【专利说明】β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备
【技术领域】
[0001]本发明属于免疫化学和分析【技术领域】，具体涉及一种β-肾上腺素受体激动剂(以下简称β-激动剂)多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备。
【背景技术】
[0002]β_肾上腺素受体激动剂，简称β_激动剂，是动物源性食品中检出率最高、危害最严重的化学性残留危害物，其中最著名的就是克伦特罗(clenbuterol，CL)，俗称“瘦肉精”。上世纪80年代，美国脂胺公司的科研人员意外发现，“瘦肉精”能增强动物脂肪分解，促进蛋白质合成，大大缩短肉品上市周期，显著提高胴体瘦肉率、饲料回报率和经济效益。随后在世界各地迅速推广，80年代后期，传入我国并在许多地区的饲料加工企业和养殖业推广使用，很快成为养殖业应用最广泛的“添加剂”。
[0003]“瘦肉精”除克伦特罗外，还包括沙丁胺醇(salbutamoI，SAL)、莱克多巴胺(ractopamine, RAC)等20多个结构和性质相类似的化合物。这类化合物进入体内后选择性作用于腺苷酸环化酶，导致人体产生低敏感现象，哮喘发生率和发病程度升高；还可导致内分泌紊乱，诱发染色体畸变及恶性肿瘤，严重时可致人死亡。因此我国和世界上大多数国家都明文禁止“瘦肉精”用作饲料添加剂。
[0004]目前，β-激动剂类兽药残留的检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、酶联免疫法(ELISA)和荧光免疫法(FIA)等。
[0005]色谱法是β_激动剂兽药残留的主要检测方法，但是色谱法检测成本高、操作复杂、大量的阴性样品重复检测；而酶联免疫法具有特异性强、样品前处理简单等优点，但特异性强的特点同时也决定了它的致命缺点:一种酶联免疫试剂盒或试纸条只能检测一种兽药残留，而无法检测其它的同类兽药残留，这就是容易出现漏检的原因(如2011年轰动全国的“双汇瘦肉精”事件)；此外，随着β_激动剂多种替代品的出现，如果进行完全检测，一个样品需要使用多种检测产品，大大提高了检测成本和工作时间，失去了快速筛选的意义。
[0006]多残留免疫分析能同时检测一类药物残留，其低成本、高通量、快速现场的优点是现有的色谱法和特异性免疫方法无法比拟的，是未来食品安全检测领域的关键技术之一，逐渐引起人们的重视。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于提供一种β -肾上腺素受体激动剂多簇抗原及宽谱特异性抗体及其制备方法。
[0008]本发明采用以下技术方案:
[0009]一种β_肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于，所述的多簇抗原是两种以上β_肾上腺素受体激动剂与载体蛋白的偶联物，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β-肾上腺素受体激动剂选自克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺。
[0010]本发明所述的多簇抗原是在载体蛋白上，依次偶联两种以上的β -肾上腺素受体激动剂半抗原得到，半抗原选自克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺，其中克伦特罗半抗原采用重氮法偶联，沙丁胺醇和莱克多巴胺采用混合酸酐法偶联。
[0011]本发明所述多簇抗原包括八种β -激动剂多簇抗原，具体为克伦特罗-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)、克伦特罗-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)、沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)、克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)、克伦特罗-莱克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)、克伦特罗-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)、沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)及克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-0VA)。
[0012]其中，克伦特罗-沙丁胺醇-牛血清白蛋白(CL-SAL-BSA)或克伦特罗-沙丁胺醇-卵清蛋白(CL-SAL-OVA)是以克伦特罗和沙丁胺醇为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到:
[0013]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶联克伦特罗半抗原，再进行纯化:
[0014]将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0015]2)在步骤I)的产物上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇半抗原，再进行纯化:
[0016]将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯,继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克伦特罗-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0017]克伦特罗-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-RAC-BSA)或克伦特罗-莱克多巴胺-卵清蛋白(CL-RAC-OVA)是以克伦特罗和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到:
[0018]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶联莱克多巴胺半抗原，再进行纯化:
[0019]将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0020]2)在步骤I)的产物上以重氮法偶联克伦特罗半抗原，再进行纯化:
[0021]将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0022]沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(SAL-RAC-BSA)或沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白(SAL-RAC-0VA)是以沙丁胺醇和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到:
[0023]I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇半抗原，再进行纯化:
[0024]将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2 mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯,继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到沙丁胺醇-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0025]2)在步骤I)的产物上继续以混合酸酐法偶联莱克多巴胺半抗原，再进行纯化:
[0026]将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2 mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0027]克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白(CL-SAL-RAC-BSA)或克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白(CL-SAL-RAC-OVA)是以克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，可按以下步骤中任意一种制备得到:
[0028]I)在克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇，再进行纯化:
[0029]将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0030]2)在克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物上以混合酸酐法偶联莱克多巴胺，再进行纯化:
[0031]将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2 mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0032]3)在沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物上以重氮法偶联克伦特罗，再进行纯化:
[0033]将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h,将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
[0034]本发明还提供了所述的多簇抗原制得的β -肾上腺素受体激动剂宽谱特异性抗体；特别是四种β_激动剂宽谱特异性抗体，所述宽谱特异性抗体分别为由β_肾上腺素受体激动剂多簇抗原 CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA, SAL-RAC-BSA 或 CL-SAL-RAC-BSA 通过动物免疫获得的。
[0035]本发明的有益效果:本发明成功地合成了八种β_激动剂多簇抗原，并基于动物免疫方法制备得到β_激动剂宽谱特异性抗体。所述的β_激动剂多簇抗原可用于构造免疫电化学传感器，基于β_激动剂宽谱特异性抗体对β_激动剂的交叉免疫反应，能实现对包括克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、特步他林、马布特罗及妥布特罗在内的多种β_激动剂的检测。由于采用的β_激动剂宽谱特异性抗体对多种β_激动剂都具有较高交叉反应率，因而能实现对β_激动剂的共同检测，且多残留免疫分析具有快速、高效、灵敏度高的优点。
[0036]下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。本发明的保护范围并不以【具体实施方式】为限，而是由权利要求加以限定。
【专利附图】
【附图说明】
[0037]图1为CL、BSA以及CL-BSA偶联物的紫外可见光谱图。
[0038]图2为SAL、CL-BSA偶联物以及CL-SAL-BSA偶联物的紫外可见光谱图。
[0039]图3为SAL、BSA以及SAL-BSA偶联物的紫外可见光谱图。
[0040]图4为RAC、SAL-BSA偶联物以及SAL-RAC-BSA偶联物的紫外可见光谱图。
[0041]图5为RAC、OVA以及RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图。
[0042]图6为CL、RAC-OVA偶联物以及CL-RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图。
[0043]图7为SAL、CL-RAC-OVA偶联物以及CL-SAL-RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图。
【具体实施方式】
[0044]实施例1CL-SAL-BSA偶联物的制备
[0045]I)在BSA上以重氮法偶联CL半抗原，再进行纯化:
[0046]将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml BSA的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到CL-BSA偶联物冻干粉。根据CL、BSA以及CL-BSA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图1)计算可得偶联比，BSA: CL=1: 28。
[0047]2)在步骤I)的产物上以混合酸酐法偶联SAL半抗原，再进行纯化:
[0048]将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlCL-BSA偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到CL-SAL-BSA偶联物冻干粉。根据SAL、CL_BSA偶联物以及CL-SAL-BSA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图2)计算可得偶联比，BSA: CL: SAL=1: 28: 17。
[0049]实施例2SAL-RAC-BSA偶联物的制备
[0050]I)在BSA上以混合酸酐法偶联SAL半抗原，再进行纯化:
[0051]将0.2 mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯,继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/mlBSA的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到SAL-BSA偶联物冻干粉。根据SAL、BSA以及SAL-BSA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图3)计算可得偶联比，BSA: SAL = I: 8.5。
[0052]2)在步骤I)的产物上继续以混合酸酐法偶联RAC半抗原，再进行纯化:
[0053]将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?1mg/mlSAL-BSA偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到SAL-RAC-BSA偶联物冻干粉。根据RAC、SAL-BSA偶联物以及SAL-RAC-BSA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图4)计算可得偶联比，BSA: SAL:RAC = 1: 8.5: 30。
[0054]实施例3CL-RAC-0VA偶联物的制备
[0055]I)在OVA上以混合酸酐法偶联RAC半抗原，再进行纯化:
[0056]将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N, N- 二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将上述反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml0VA的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到RAC-OVA偶联物冻干粉。根据RAC、OVA以及RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图5)计算可得偶联比，OVA =RAC= I: 20。
[0057]2)在步骤I)的产物上以重氮法偶联CL半抗原，再进行纯化:
[0058]将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?10mg/ml RAC-OVA偶联物的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得CL-RAC-OVA偶联物冻干粉。根据CL、RAC-OVA偶联物以及CL-RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图6)计算可得偶联比，OVA: RAC: CL = I: 20: 16。
[0059]实施例4CL-SAL-RAC-0VA偶联物的制备
[0060]将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心。将下层固体溶于5?1ml N, N-二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h。将反应液缓慢加入到5?1ml含有5?I Omg/ml CL-RAC-OVA偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜。将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到CL-SAL-RAC-OVA偶联物冻干粉。根据SAL、CL-RAC-OVA偶联物以及CL-SAL-RAC-OVA偶联物的紫外可见吸收光谱图(见附图7)计算可得偶联比，OVA:RAC: CL: SAL = I: 20: 16: 21。
[0061]按照与实施例1-4相似的方法可分别制备CL-RAC-BSA、CL-SAL-OVA、SAL-RAC-0VA和 CL-SAL-RAC-BSA 偶联物。
[0062]实施例5 抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA抗体的制备
[0063]用合成的偶联物(CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或 CL-SAL-RAC-BSA 中的一种)作为免疫原免疫体重约2kg的健康大白兔。首次免疫时将0.25mg免疫原与等量弗氏完全佐剂混合并充分乳化，背部皮下多点注射。两周后用同样剂量免疫原与等量弗氏不完全佐剂进行乳化并进行加强免疫，每两周加强免疫一次，共加强三次。最后一次免疫10天后对大白兔进行颈静脉采血，放在4°C环境下静置30min，再用硫酸铵多级沉淀法进行纯化，即可得到抗 CL-RAC-BSA、抗 CL-SAL-BSA、抗 SAL-RAC-BSA 以及抗 CL-SAL-RAC-BSA 多克隆抗体。
[0064]实施例6抗体效价测定
[0065]将纯化后的的血清稀释不同的倍数，用间接ELISA法分别对抗CL-RAC-BSA、抗CL-SAL-BSA、抗SAL-RAC-BSA以及抗CL-SAL-RAC-BSA抗体进行效价测定，结果如下:
[0066]CL-SAL-BSA抗血清的效价为1: 1600，CL-SAL-RAC-BSA的抗血清效价为I: 6400，CL-RAC-BSA 抗血清的效价为 I: 12800，SAL-RAC-BSA 的抗血清效价为 I: 3200。
【权利要求】
1.一种β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于，所述的多簇抗原是两种以上β-肾上腺素受体激动剂与载体蛋白的偶联物，所述的载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白，所述的β -肾上腺素受体激动剂选自克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺。
2.根据权利要求1所述的β_肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于:系克伦特罗-沙丁胺醇-牛血清白蛋白或克伦特罗-沙丁胺醇-卵清蛋白偶联物，以克伦特罗和沙丁胺醇为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以重氮法偶联克伦特罗半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h ;将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-载体蛋白偶联物冻干粉； 2)在步骤I)的产物上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心,将下层固体溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?1mg/ml克伦特罗-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物冻干粉。
3.根据权利要求1所述的β_肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于:系克伦特罗-莱克多巴胺-牛血清白蛋白或克伦特罗-莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物，以克伦特罗和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到: 1)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶联莱克多巴胺半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉； 2)在步骤I)的产物上以重氮法偶联克伦特罗半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h后将反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的碳酸钠缓冲溶液中，再继续反应3?5h ;将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
4.根据权利要求1所述的β_肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于:系沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白或沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物，以沙丁胺醇和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下步骤制备得到: I)在牛血清白蛋白或卵清蛋白上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心,将下层固体溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml载体蛋白的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到沙丁胺醇-载体蛋白偶联物冻干粉； 2)在步骤I)的产物上继续以混合酸酐法偶联莱克多巴胺半抗原，再进行纯化: 将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?1mg/ml沙丁胺醇-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
5.根据权利要求1所述的β-肾上腺素受体激动剂多簇抗原，其特征在于:系克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-牛血清白蛋白或克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物，以克伦特罗、沙丁胺醇和莱克多巴胺为半抗原，以牛血清白蛋白或卵清蛋白为载体，按以下任意一种方法制备得到: 1)在克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物上以混合酸酐法偶联沙丁胺醇，再进行纯化: 将0.2mmol硫酸沙丁胺醇溶于5?1ml无水乙醇中，加入0.2mmol戍二酸酐,室温下反应3?5h,离心,将下层固体溶于5?1ml N,N- 二甲基甲酰胺,加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克伦特罗-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉； 2)在克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物上以混合酸酐法偶联莱克多巴胺，再进行纯化: 将0.2mmol戊二酸酐溶于5ml吡啶中，加入0.2mmol盐酸莱克多巴胺，室温反应10?20h，蒸干溶剂，将所得油状物溶于5?1ml N，N-二甲基甲酰胺，加入0.2mmol三正丁胺和0.2mmol氯甲酸异丁酯，继续反应I?3h ;将上述反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml克伦特罗-沙丁胺醇-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉； 3)在沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物上以重氮法偶联克伦特罗，再进行纯化: 将0.2mmol盐酸克伦特罗于溶于I?5ml稀盐酸中，缓慢加入0.2?2mol/L的亚硝酸钠溶液至淀粉碘化钾试纸变为紫色，继续反应I?3h，将反应液加入到5?1ml含有5?10mg/ml沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物的磷酸缓冲溶液中，室温反应过夜；将上述反应液用磷酸缓冲溶液透析3?6次，冷冻干燥即可得到克伦特罗-沙丁胺醇-莱克多巴胺-载体蛋白偶联物冻干粉。
6.根据权利要求1所述的多簇抗原制得的β_肾上腺素受体激动剂宽谱特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的β_肾上腺素受体激动剂宽谱特异性抗体，其特征在于，所述的宽谱特异性抗体由β -肾上腺素受体激动剂多簇抗原CL-RAC-BSA、CL-SAL-BSA、SAL-RAC-BSA或CL-SAL-RAC-BSA通过动物免疫获得。
【文档编号】G01N33/531GK104280541SQ201410563668
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】邵科峰, 赵波, 张红琳, 任鹏飞, 常其沛 申请人:南京师范大学