本发明涉及一种用于银杏叶提取物中有机酸含量的测定方法。
背景技术：
：银杏叶为银杏科植物银杏(GinkgobilobaL.)的干燥叶，味微苦，性平，具有益心、活血止痛、敛肺平喘、化湿止泻的功效。银杏叶提取物临床上用于治疗心脑血管疾病和神经系统疾病。银杏叶提取物成分复杂，目前的质量控制指标仅有两类成分：黄酮醇苷类和内酯类，两者总含量为30％。另有7成成分未被列入质量标准中。已有文献报道，银杏叶提取物除了黄酮醇苷和内酯成分外，还含有原花青素、有机酸、双黄酮、异黄酮等成分。因此，为了逐步增加银杏叶提取物中的可测成分，逐步提高和完善银杏叶提取物的质量标准，对除黄酮醇苷和内酯成分之外的其他成分进行研究，就显得尤为重要。文献“高效液相色谱法测定银杏果中有机酸的含量”(分析科学学报,2011,27(3):336-338.)报道了白果中含有草酸、酒石酸、苹果酸、抗坏血酸、乳酸、乙酸、柠檬酸，并用一种色谱条件同时测定了这7种小分子有机酸。色谱条件流动相为3％甲醇-0.01mol/LK2HPO4，即用到了缓冲盐体系。本发明人团队在研究中发现，虽然白果中含有上述7种小分子有机酸，但银杏叶提取物中却不含这些有机酸，但含有至少5种其他的有机酸类成分，包括莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)和对羟基苯甲酸。这些有机酸类成分均具有较好的生物活性：莽草酸具有抗炎镇痛、抗肿瘤、抗血栓、抗HIV等作用，是合成抗禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒药物“达菲”的重要原料；没食子酸具有抗肿瘤、保肝、抗真菌感染等作用；原儿茶酸具有抗炎、保护神经细胞、抗病毒、促进干细胞增殖分化等多种功效；6-HKA是高效的谷氨酸受体拮抗剂，对神经兴奋性损伤具有很好的保护作用；对羟基苯甲酸具有抗菌消炎的作用。在测定银杏叶提取物中的有机酸含量时，发现干扰测定最主要的成分是原花青素。因此，准确测定有机酸含量的前提是对有机酸类成分进行纯化。有机酸常用的纯化方式有两种，一是用碱水提取，提取液调酸性后用有机溶剂萃取；另一种是用阴离子交换树脂进行纯化。两者方法都用到了腐蚀性溶剂或毒性溶剂，前者包括氢氧化钠、乙酸乙酯，后者包括氢氧化钠、甲醇等。并且这两种方法都不能有效的去除银杏叶提取物中的原花青素，并且有机酸也有损失。去除原花青素最佳的方法是用聚酰胺树脂，可以完全吸附这类成分，但同时，也会损失部分有机酸，如6-羟基犬尿喹啉酸(6-HKA)。专利“一种天然6-羟基犬尿喹啉酸提取物的制备方法及其应用”(CN201410007590.0)说明了6-HKA必须要用含酸的70％乙醇才能将吸附在聚酰胺树脂上的6-HKA完全洗脱下来，而此时，部分原花青素成分也会被洗脱下来，从而干扰测定。大孔树脂纯化法是一种常用的纯化原花青素的方法，但原花青素的极性跨度很大，单体成分，如儿茶素微溶于冷水，而高聚体原花青素，易溶于冷水，并且原花青素的聚合度越高，极性越大，因此大孔树脂可以用于吸附原花青素，但极性较大的高聚体原花青素和有机酸成分用水或低浓度乙醇水溶液就可以洗脱下来，仍然无法完全去除干扰。综上所述，准确测定银杏叶提取物中的有机酸含量对于控制银杏叶提取物的质量，提高银杏叶提取物的标准，有着重大的意义；而找到一种去除原花青素，准确测定银杏叶提取物中有机酸的方法是目前医药行业人员极为关心的问题。技术实现要素：本发明提供了一种银杏叶提取物中有机酸含量测定方法，目的在于能够定量测定银杏叶提取物中有机酸的含量，以达到银杏叶提取物的质量更加可控的目标。本发明所采用的技术方案具体如下：一种银杏叶提取物中有机酸含量测定方法，包括如下步骤：(1)银杏叶提取物的前处理方法：取银杏叶提取物，用含牛血清白蛋白的水溶液超声提取，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；(2)供试品溶液的制备：有机酸提取物用含0.05～0.4％磷酸的水溶液溶解定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(3)对照品溶液的制备：精密称取莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-羟基犬尿喹啉酸、对羟基苯甲酸的标准品适量，用流动相(乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5)溶解，即得；(4)高效液相色谱分析：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按如下色谱条件测定，得五种有机酸的对照品色谱图和供试品的色谱图；色谱条件为：固定相是以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；紫外检测器，检测波长0～6min为215nm，6～25min为254nm；柱温为30℃；进样量为10ul；流速为1.0ml/min；采用等度洗脱，流动相A的体积分数为3.5％，流动相B的体积分数为96.5％。本发明制备方法中：步骤1)中，银杏叶提取物的前处理方法为，取银杏叶提取物100mg，用含0.1～10g/L牛血清白蛋白的水溶液5～100ml，20～70℃超声提取5min～3h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物。步骤1)中银杏叶提取物最佳前处理方法优选为，取银杏叶提取物100mg，用含1g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超声提取1h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物。步骤2)中供试品溶液的制备方法优选为，有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。本发明提供的一种银杏叶提取物中有机酸含量测定方法，具有如下优势：1.本发明与常用的纯化有机酸的方法相比，未用到强腐蚀性和毒性的溶剂，整个前处理过程只用乙醇和水，环保无污染。2.本发明用牛血清白蛋白来去除原花青素，用含磷酸的水溶液来制样，充分去除了干扰有机酸主峰色谱行为的杂质，大大改善了色谱峰的色谱行为和分离效果，从而达到了准确定量有机酸的目的。3.本发明测定方法使用的色谱条件中的流动相为乙腈:0.1％磷酸水溶液(V/V)：3.5:96.5，未用到缓冲盐体系，更有利于色谱柱的平衡、后处理和保存。附图说明：图1为混合对照品色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图2为纯化方法1(本发明方法)制备的样本色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图3为纯化方法2制备的样本色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图4为纯化方法3制备的样本色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图5为不用牛血清白蛋白前处理的样本色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图6为用0.3g/L牛血清白蛋白前处理的样本色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图7为用70％甲醇制样样本的色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸图8为用含0.05％磷酸的水溶液制样样本的色谱图，1号峰为莽草酸、2号峰为没食子酸、3号峰为原儿茶酸、4号峰为6-羟基犬尿喹啉酸、5号峰为对羟基苯甲酸具体实施方式实施例1不同纯化方法对有机酸测定的影响纯化方法1：100mg银杏叶提取物，用含1g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超声提取60min，过滤；滤液用HPD5000大孔树脂吸附，水洗、10％乙醇洗脱，收集合并吸附残液、水洗部位和10％乙醇洗脱部位，浓缩干燥，用0.1％磷酸溶解残渣，并定容至10ml。纯化方法2：100mg银杏叶提取物，用10mlpH值13的水溶液提取，提取液用浓盐酸调pH值至1，再用100ml乙酸乙酯萃取2次。合并两次乙酸乙酯溶液，浓缩干燥，用0.1％磷酸溶解残渣，并定容至10ml。纯化方法3：100mg银杏叶提取物，用10ml水提取，提取液用阴离子交换树脂吸附，水洗后，用1mol/L氢氧化钠70％甲醇溶液洗脱，收集洗脱溶液，浓缩干燥，用0.1％磷酸溶解残渣，并定容至10ml。色谱条件为：固定相是以辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A为乙腈，流动相B为0.1％磷酸水溶液；紫外检测器，检测波长0～6min为215nm，6～25min为254nm；柱温为30℃；进样量为10ul；流速为1.0ml/min；采用等度洗脱，流动相A的体积分数为3.5％，流动相B的体积分数为96.5％。结果见附图1～4，附图1为混合对照品色谱图，5个主峰峰型良好，无杂峰干扰；图2为纯化方法1(本发明方法)制备的样本色谱图，5个主峰峰型良好，无杂峰干扰；图3为纯化方法2制备的样本色谱图，1号峰几乎没有，2号峰有杂峰干扰并且峰面积明显小于图2中的2号峰面积，4号峰峰面积也明显减小，说明用纯化方法2制备样本，莽草酸、没食子酸和6-HKA有损失；图4为纯化方法3制备的样本色谱图，1号峰有杂峰干扰，5号峰消失，4号峰面积减小，说明用纯化方法2制备样本，6-HKA和对羟基苯甲酸有损失。实施例2银杏叶提取物中有机酸类成分的定性和定量取银杏叶提取物100mg，分别用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超声提取1h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。上述方法进行方法学验证，包括仪器精密度，重复性，中间精密度，线性，加样回收率，耐用性。结果发现，银杏叶提取物中含有莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-HKA、对羟基苯甲酸，不含阿魏酸、绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸B、异绿原酸C、咖啡酸、对香豆酸、香草酸、抗坏血酸、D-葡萄糖醛酸、奎宁酸。由表1～表4结果说明，本发明方法可以同时定量测定银杏叶提取物中5种有机酸的含量，方法学验证所有指标均符合药典规定，该方法准确、可靠。由表5结果说明，不同批次的银杏叶提取物均含有莽草酸、没食子酸、原儿茶酸、6-HKA、对羟基苯甲酸这5种有机酸，5种有机酸总含量约为2.2％～3.0％。表15种有机酸回归方程表2加样回收试验结果表3精密度实验结果表4耐用性实验结果表510批次银杏叶提取物有机酸含量测定结果批号莽草酸没食子酸原儿茶酸6-HKA对羟基苯甲酸总含量1403280.942％0.103％0.827％0.321％0.092％2.285％1305131.235％0.109％1.135％0.276％0.110％2.865％1502011.057％0.126％0.941％0.283％0.095％2.502％1406210.826％0.104％1.249％0.313％0.105％2.597％1409020.994％0.093％1.472％0.294％0.113％2.966％1401011.026％0.117％0.923％0.300％0.107％2.473％1308120.918％0.101％0.837％0.285％0.102％2.243％1501080.938％0.115％1.540％0.299％0.109％3.001％1310100.947％0.109％1.313％0.306％0.096％2.771％1209220.953％0.124％0.930％0.288％0.117％2.412％实施例3牛血清白蛋白用量的考察取银杏叶提取物100mg，分别用含0、0.1、0.3、1.0、3.0、10g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超声提取1h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。结果见附图2、附图5和附图6。附图2为用1.0g/L牛血清白蛋白前处理的样本色谱图，5个主峰峰型良好，无杂峰干扰，用3.0或10g/L牛血清白蛋白前处理的样本色谱图同附图2。附图5为不用牛血清白蛋白前处理的样本色谱图，1、2、4号峰有明显的杂峰干扰；附图6为用0.3g/L牛血清白蛋白前处理的样本色谱图1和2号峰有明显的杂峰干扰，用0.1g/L牛血清白蛋白前处理的样本色谱图基本同附图6。说明牛血清白蛋白用量在1.0g/L以上，才能去除1～4号峰的杂峰干扰。实施例4提取溶剂量的考察取银杏叶提取物100mg，分别用5、10、20、50、100ml含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液，50℃超声提取1h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。表6结果说明，提取溶剂量为5ml，仍有部分有机酸未能提取出来，因此，选择提取溶剂量为10ml。表6提取溶剂量的考察提取溶剂量(ml)5种有机酸总含量(％)52.029102.285202.288502.2861002.290实施例5提取温度的考察取银杏叶提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，分别在20、30、40、50、60、70℃超声提取1h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。表7结果说明，提取温度低于50℃时，部分有机酸未能提取出来，因此，选择提取温度50℃。表7提取温度的考察提取温度(℃)5种有机酸总含量(％)201.863301.906402.080502.285602.281702.283实施例6提取时间的考察取银杏叶提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃分别超声提取0.5、1、2h、3h，过滤；滤液浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物用含0.1％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。表8结果说明，提取时间为0.5h时，部分有机酸未能提取出来，因此，选择提取时间1h。表8提取时间的考察提取时间(h)5种有机酸总含量(％)0.51.64212.28622.29032.285实施例7制备供试品溶液的磷酸浓度考察取银杏叶提取物100mg，用含1.0g/L牛血清白蛋白的水溶液10ml，50℃超声提取1h，过滤；滤液用HPD5000大孔树脂吸附，水洗，10％乙醇洗脱，收集合并吸附残液、水洗部位和10％乙醇洗脱部位，浓缩干燥，得有机酸提取物；有机酸提取物分别用70％甲醇、水、含0.05、0.1、0.2、0.4％磷酸的水溶液溶解并定容至10ml，摇匀，滤过，取续滤液；续滤液按实施例1色谱条件进行测定。结果见附图2、附图7和附图8。附图2为用含0.1％磷酸的水溶液制样样本的色谱图，5个主峰峰型良好，无杂峰干扰，用0.2或0.4％磷酸的水溶液制样样本的色谱图同附图2。附图7为用70％甲醇制样样本的色谱图，4号峰有明显的杂峰干扰；附图8为用含0.05％磷酸的水溶液制样样本的色谱图，1号峰有杂峰干扰，用水制样样本的色谱图同附图8。当前第1页1 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