一种检测氯二甲基砷的方法与流程

本发明涉及一种检测方法，具体而言，涉及一种检测氯二甲基砷的方法。
背景技术：
：砷有黄、灰、黑褐三种同素异形体。自然界中主要存在于砷矿及稀有的砷铋矿和灰砷矿中。砷有不同的化合物形式及价态分布，主要分无机形态和有机形态。其中无机形态的砷(ias)主要有砷氧化物、碑硫化物、亚砷酸盐、砷酸盐等，主要存在于地壳、淤泥沉淀物、矿物及地下水等。有机形态的砷主要有单甲基砷化物(monomethylarsoiiousacidmma，monomethylarsonicacidmmav)、二甲基砷化物(dimethylarsinousaciddma，dimethylarsinicaciddma、三甲基砷化物(trimethylarsineoxidetmao)、含硫甲基砷化物、胆减砷、甜菜喊砷等，是ias进入生物体内进行代谢转化而成，也可经化学手段合成(无机砷甲基化及人砷甲基化催化机制，宋晓丽)。砷中毒可引起多种健康损害作用。砷被认为是一种环境有毒物，长期饮水砷暴露的人群会导致诸多健康危害效应(chakrabortid，rabmanmm，paulk，etal.arseniccalamityintheindiansubcontinent:whatlessonshavebeenlearned[j].talanta.20()2，58:3-22.)。慢性砷暴露可以引起不同的皮肤损伤表现，如掌趾部的皮肤角化，胸部、后背的色素脱失和色素沉着，重度病人还会发生皮肤癌。有研究表明，通常在首次暴露到发生皮肤损伤有10年的潜伏期，但也有潜伏期只有6个月的报道(haquer，mazumderdn，samantas，etal.arsenicindrinkingwaterandskinlesions:dose-responsedatafromwestbengalindia[j].epidemiology.2003，14:174-182)，这与水中的砷浓度、人的摄入剂量、健康状况和营养条件等因素有关。另外，慢性砷中毒在临床上除了皮肤损伤典型表现外，还有报道认为砷中毒还会出现外周血管疾病、外周神经性疾病、呼吸 困难、结膜炎、不同程度的生殖畸形、皮肤、肺、膀胱、肝脏等部位的恶性肿瘤(guhamazumderdn.2003.chronicarsenictoxicity:clinicalfeatures，epidemiology，andtreatment:experienceinwestbengal[j].jenvironscihealthatoxhazardsubstenvironeng38:141-163.)。然而，有趣的是砷对某些动物的生长却具有营养价值。如在鼠、鸡及羊等动物中进行研究发现，砷缺乏可导致动物皮毛粗糖、生长缓慢、繁殖力下降等。在我国，砒霜(as2o3)和雄黄(as4s4)作为中药使用已有近千年的历史；在西方国家三氧化二砷(as2o3)制剂也被用来治疗传染性疾病等。近年来，我国学者采用注射as2o3治疗急性早幼粒细胞白血病取得了令人瞩目的成绩。因此一直以来被认为有剧毒的砷化物又引起了人们特别是国内外肿瘤研究学者们的关注，广泛开展了砷化物治疗血液肿瘤和实体瘤的研究。同时，砷的双重生物效用也成了各领域学者研究的热点。ias甲基化是砷在生物体内的主要代谢方式。ias甲基化的发现开始于十九世纪关于微生物的研究。科学家在研究微生物的过程中发现了一种具有大蒜气味的物质，经研究确定这种物质是一种挥发性的砷代谢物，三甲基化砷氧化物(tmao)(w.r.cullen，r.bentley，j.environ.monit.7(2005)11-15.)。进一步的广泛研究发现，人在摄取ias之后也会呼出一种大蒜的气味，表明人体中能够产生砷甲基化物。此后，braman和foreback等人(r.s.bratnan，c.c.foreback，science182(1973)1247-1249.)在人尿液中发现了ias，mma及dma；crecelius(e.a.crecelius，environ.healthperspect.19(1977)147-150.)第一次证实在饮用含砷(iasⅲ或者iasv)水和酒的志愿者的尿液中也发现了这些砷化物的存在。这些结果表明在人体内存在一个代谢过程将ias转化成了砷甲基化物。大量充分的实验数据表明ias的甲基化代谢过程包含多步反应，如tmao的确证表明其它的砷甲基化物可能是该过程的中间产物，从而表明该过程是多步反应。在此过程中，某些步骤是严格的化学反应，某些步骤是酶催化反应。然而，目前关于该过程的更多细节和每一步的真实情况仍然不明确(h.v.aposhian，m.m.aposhian，chem.res.toxicol.19(2006)1-15.)。目前仅仅确定了as3mt是参与催化的生物酶，砷甲基化酶(as3mt)通过 催化无机砷(ias)甲基化在砷元素的解毒过程中起着关键的作用(j.x.li，s.b.waters，z.drobna，v.devesa，m.styblo，d.j.thomas，toxicol.appl.pharmacol.204(2005)164-169.)。人砷甲基化酶(has3mt)中有十四个半胱氨酸(cys)残基，研究表明cys残基对酶的功能有至关重要的作用，如维持酶的结构和调节酶的活性(j.x.li，s.b.waters，z.drobna，v.devesa，m.styblo，d.j.thomas，toxicol.appl.pharmacol.204(2005)164-169.)。hayakawa等对于ias的甲基化提出了可能的模型(t.hayakawa，y.kobayashi，x.cui，s.hirano，arch.toxicol.79(2005)183-191.):asⅲo33-+sh+-asⅲ(sh)3+me+→masⅲ(sh)2+me+-dmasⅲ(sh)在此模型中，含硫三价砷化物(asⅲ-thiol)作为底物进行连续的甲基转移反应而不是氧化甲基化机制，中间不涉及价态的变化。同时ias必须以含硫砷化物的形式作为底物才能进行甲基化代谢。此外三价砷甲基化和运输经常会涉及到硫醇和含有硫醇蛋白质，这反映了砷有极强的亲硫性(d.scottbohleandyuxuanguorg.biomol.chem.，2013，11，2578)。有文献报道darinaparsin(dar；zio-101；s-dimethylarsino-glutathione)被开发成创新的线粒体靶向的有机砷药物用于治疗多种血液和实体肿瘤，在美国已进入二期临床试验(molpharmacol85:576–585，april2014)。其中darinaparsin的合成途径如下(patent；ziopharmoncology，inc.；us2007/183972；(2007)；(a1)english)：其反应中间物氯二甲基砷是一个非常活泼的三价砷化合物，极易与巯基结合；相比以前在砷相关的蛋白结构与功能研究中使用过的砷化合物氯二甲基砷可能会在相关蛋白研究中产生意想不到的效果。但是，关于砷的检测方法，目前，所使用最为广泛的检测砷的技术为电感耦合等离子如电感耦合等离子体原子发射光谱法(icp-aes)，电感耦合等离子体质谱(icpms)，以及原子吸收光谱法如石墨炉原子吸收光 谱法(gf-aas)和氢化物发生原子吸收光谱法(hg-aas)。电感耦合等离子法-需要与其它方法联用，常见的有电感稱合等离子体发射光谱法以及电感稱合等离子体质谱法。这两个方法进样方便、灵敏度高、干扰少，近年来发展非常迅速。原子吸收光谱法-利用原子特有的吸收光谱进行检测，该法只能测定总砷，不能直接用于砷的形态分析，需要同其他分离技术结合才能有效检测砷的不同形态且灵敏度低、检出限高，难以用于环境样品中痕量砷的检测。这些方法往往是以复杂和昂贵的实验室为基础的测试，且要耗费大量的时间。技术实现要素：针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种检测氯二甲基砷的方法。该方法，包括：配置不同浓度的氯二甲基砷溶液；使所述不同浓度的氯二甲基砷溶液分别与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应，以生成5-硫基-2-硝基苯甲酸；测定5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度；绘制5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度相对于不同浓度的氯二甲基砷溶液的标准曲线；使待测样品与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应以得到最终反应物5-硫基-2-硝基苯甲酸；以及测定最终反应物5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度以根据所述标准曲线得到所述待测样品中氯二甲基砷的浓度。在上述方法中，在405-420nm下测定5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度。在上述方法中，所述配置不同浓度的氯二甲基砷溶液的步骤进一步包括：取1微升12.1摩尔/升的氯二甲基砷溶液，并用二甲基亚砜(dmso)稀释成100毫摩尔/升；用ph为8.0的100毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液将100毫摩尔/升的氯二甲基砷溶液稀释成五组浓度分别为1.00毫摩尔/升毫、0.75摩尔/升毫、0.50摩尔/升毫、0.25摩尔/升、0.00毫摩尔/升的氯二甲基砷。在上述方法中，使所述不同浓度的氯二甲基砷溶液分别与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)反应，以得到5-硫基-2-硝基苯甲酸的步骤进一步包括：在96孔板的不同孔板中分别加入250微升的磷酸钠缓冲液，25微升的所述不同浓度的氯二甲基砷，5微升10毫摩尔/升的dtnb溶液；使所述不同 孔板中的溶液充分混匀，室温放置30-45分钟。在上述方法中，所述磷酸钠缓冲液为ph为7.5-8.0的100毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液。在上述方法中，用ph为7.5-8.0的100毫摩尔/升的磷酸钠缓冲液配制所述dtnb溶液。在上述方法中，在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪以及酶标仪下测定5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度。在上述方法中，所述最终反应物5-硫基-2-硝基苯甲酸在405-420nm处有吸收峰。本发明采用dtnb紫外吸收检测法，实验操作简单方便，所用试剂以及检测仪器价格十分低廉，且没有苛刻实验条件要求。用dtnb检测氯二甲基砷，在96孔板中完成反应及检测过程，实现了对某一种三价砷化合物的高效、快速、微量的检测。此外，本发明提供的检测氯二甲基砷的方法具有以下有利特征：1、采用dtnb检测，没有使用精密仪器的繁琐，且检测时间大大缩短；2、反应直接在96孔板中进行，缩短了检测周期；3、采用dtnb检测法，所需样品及试剂消耗减少。附图说明图1为5-硫基-2-硝基苯甲酸相对于不同浓度的氯二甲基砷溶液(mm)的标准曲线。图2为5-硫基-2-硝基苯甲酸相对于不同浓度的氯二甲基砷溶液(mm)的另一标准曲线。具体实施方式下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。发明人在研究rpb时使用氯二甲基砷作为底物研究其与沼泽红假单胞菌rhodopseudomonaspalustrishaa2的2-氨基-5-氯粘糠酸脱氨酶(rpb)唯一一个暴露的半胱氨酸的结合情况，并使用dtnb作为检测rpb半胱氨酸的个数的方法时发现在空白组(dtnb+me2ascl)也有很大的紫外吸收。而三价砷又有极强硫性，所以猜测dtnb与me2ascl存在某种线性关系。将dtnb与me2ascl室温孵育30-45分钟，测定在不同浓度me2ascl(x)下，5-硫基-2-硝基苯甲酸在405-420nm处的吸光值(y)，结果如下，基于该实验结果，绘制了me2ascl标准曲线结果如附图1所示。x(mm)1.000.750.500.250.00y(吸光值)1.19200.85610.60120.35020.1075根据实验结果，推定氯二甲基砷与dtnb的反应机理和巯基与dtnb类似并且dtnb具有检测一般三价砷浓度的作用。其中，dtnb测定蛋白巯基机理dtnb将被转变成黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸。由于5-巯基-2-硝基苯甲酸在412nm处具有最大吸收，dtnb的吸收光谱并不干扰巯基的测定。应用举例：半胱氨酸中自由巯基的定量检测方法：一、试剂的配制：1、三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液(0.25m)：ddw准确配制后，用盐酸调节ph＝8.0；2、半胱氨酸标准溶液(1mm)：准确称取0.017563g，l-半胱氨酸(175.63)，用1ml甲酸溶解，以双蒸水定容至100ml；3、dtnb(分子量：396.35)标准溶液(10mm)：准确称取0.198175gdtnb用50mmna2hpo4(ph＝7.0)配制成50ml溶液，存放于棕色瓶中，于暗处低温保存备用4、dtnb分析溶液(0.1mm)：由1体积10mmdtnb标准液加99体积0.25m 的triss-hcl缓冲液配制而成，现用现配。二、标准曲线的制作：1、25℃条件下，用tris缓冲液稀释半胱氨酸标准液配成梯度的稀释液(5.0ml)，其浓度分别为：0.00mm、0.025mm、0.05mm、0.1mm、0.15mm、0.2mm；2、取上述各浓度溶液1ml分别加入到5ml预先恒温于25℃水中的dtnb分析溶液，摇匀，准确静止10分钟，立即于波长412nm处测定吸光度值(a)。根据目的蛋白的吸光度在标准曲线上读出对应的浓度即可。基于此，本发明提供了利用dtnb检测氯二甲基砷的方法：实施例1下面以合成的氯二甲基砷测定为例对本发明的技术方案进行说明：方法原理如下：将最终反应物5-硫基-2-硝基苯甲酸(5-thio-2-nitrobenzoate)置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪以及酶标仪下，在405-420nm的波长下检测5-硫基-2-硝基苯甲酸的吸光度。1)取1微升氯二甲基砷(12.1摩尔/升)，并用dmso稀释成100毫摩尔/升。用磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，ph8.0)稀释成五组浓度分别为1.00毫摩尔/升毫、0.75毫摩尔/升毫、0.50毫摩尔/升毫、0.25毫摩尔/升、0.00毫摩尔/升的氯二甲基砷溶液，其中，每组浓度平行设置三份。2)在96孔板的15个孔板中分别加入250微升的磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，ph8.0)，25微升的五组(每组三份)不同浓度的氯二甲基砷溶液，5微升10毫摩尔/升的dtnb溶液(用磷酸钠缓冲液配制)五组试剂加完后使之充分混匀，室温放置30分钟。3)设置酶标仪参数，测量405-420nm处五组不同浓度的反应产物的吸光度值。4)分别对每一组对应的3个吸光度值求其平均值。5)基于不同浓度的氯二甲基砷溶液和反应产物的吸光度平均值，作标准曲线，标准曲线如附图1所示。实施例2待测样品中氯二甲基砷的含量测定：下面以氯二甲基砷与二甲基亚砜(dmso)配成0.2毫摩尔/升毫测定为例对本发明的技术方案进行说明：1)取1微升氯二甲基砷(12.1摩尔/升)，并用dmso稀释成100毫摩尔/升。用磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，ph8.0)稀释成五组浓度分别为1.00毫摩尔/升毫、0.75毫摩尔/升毫、0.50毫摩尔/升毫、0.25毫摩尔/升、0.00毫摩尔/升的氯二甲基砷溶液，其中，每组浓度平行设置三份。2)在96孔板的15个孔板中分别加入250微升的磷酸钠缓冲液(100毫摩尔/升，ph8.0)，25微升的五组(每组三份)不同浓度的氯二甲基砷溶液，5微升10毫摩尔/升的dtnb溶液(用磷酸钠缓冲液配制)五组试剂加完后使之充分混匀，室温放置30分钟。3)设置酶标仪参数，测量405-420nm处五组不同浓度的反应产物的吸光度值。4)分别对每一组对应的3个吸光度值求其平均值。5)基于不同浓度的氯二甲基砷溶液和反应产物的吸光度平均值，作标准曲线，标准曲线如附图2所示。6)如上操作测定氯二甲基砷浓度为0.2000毫摩尔/升毫的吸光值，吸光值的平均值为0.1769。7)将结果代入方程式中计算的到氯二甲基砷浓度为0.1991。8)误差计算实际相对误差定义式为：δ＝δ/lx100％式中:δ-实际相对误差，δ-绝对误差(绝对误差是测量值(x)与真值(l)间的差值)，l-真值；δ＝|x-l|＝|0.1991-0.2000|＝0.0009；δ＝δ/l＝0.0009/0.2000*100％＝0.45％。由此，本发明提供了一种采用dtnb紫外吸收检测氯二甲基砷的方法，该方法实验操作简单方便，所用试剂以及检测仪器价格十分低廉，且没有 苛刻实验条件要求。用dtnb检测氯二甲基砷，在96孔板中完成反应及检测过程，实现了对某一种三价砷化合物的高效、快速、微量的检测。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12