本发明涉及光敏药物与光动力疗法领域，具体的说涉及一类四苯基亚甲基二氢卟吩化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
光动力疗法(PDT)是一种治疗肿瘤、视网膜黄斑变性、光化性角化病、鲜红斑痣、尖锐湿疣等疾病的新方法。自20世纪70年代进入临床研究以来，PDT在临床治疗中已取得了令人瞩目的成就，因其具有选择性好、毒副作用小、可重复性好、安全、微创性、可协同性和相对低成本等优点脱颖而出，显示出巨大的潜力和强大的生命力。
光动力疗法的原理是光敏剂进入机体后，随血液循环选择性地聚集于靶组织中，然后利用一定波长的激光直接照射到肿瘤组织上，光敏剂吸收光子能量后由基态变成不稳定的激发态，处于激发态的光敏剂与周围分子发生反应，产生高氧化活性的自由基(如单线态氧)，作用于靶细胞，引起细胞代谢紊乱，杀伤靶细胞。
在光动力治疗中，光敏药物(也称光敏剂或光动力药物)作为能量的载体、反应的桥梁而起着决定性的作用。第一代光敏剂是以1993年在荷兰上市的第一个光敏剂photofrin II为代表，它是组成复杂的血卟啉衍生物的混合物，在红光区的相对吸收较弱；第二代光敏剂以卟啉类衍生物为主，该类化合物的化学结构明确、组成成分单一、红光区的吸收较强、体内停留时间短，第二代光敏剂中二氢卟吩类衍生物的抗肿瘤效果更为显著。它是卟啉结构中吡咯环上的一个双键被还原后的产物，具有很好的光物理性质，在可见区的吸收波长长并且吸收强度大。从理论上讲，这类化合物表现出了理想的PDT药物的特性，具有开发成PDT药物的巨大潜力。目前PDT药物被广泛的应用于各种肿瘤疾病的治疗中，例如已经上市的光动力药物替莫泊芬(Temoporfin)在抗肿瘤治疗中取得了显著的社会效益与经济效益，应用前景十分可观。但这些四苯基二氢卟吩类药物尚存在某些缺点，如Temoporfin易被氧化、稳定性差、合成困难、价格昂贵等。
技术实现要素：
为了克服Temoporfin等四苯基二氢卟吩类光敏剂的缺陷，本发明创新性的设计了一类结构新颖的四苯基亚甲基二氢卟吩化合物，并且利用丙二酸二甲酯和四苯基卟吩化合物发生麦克加成反应，非常简便的合成了一类结构新颖的四苯基亚甲基二氢卟吩化合物。
本发明涉及一类四苯基亚甲基二氢卟吩化合物及其制备方法与应用。
本发明概述如下：
一类四苯基亚甲基二氢卟吩化合物具有下述结构(I)：
其中R1、R2处于苯环的邻位(o-)或间位(m-)或对位(p-)。
R1＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R2＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R3＝-OH，-OCH2CH2OH，-NHCH3，-NHCH2CH3，-NHCH2CH2CH3，-NHCH(CH3)2，
-NHCH2CH2CH2CH3，-NHCH(CH3)CH2CH3，-NHCH2CH(CH3)2，-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，
-N(CH2CH2CH3)2，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2OH，-N(CH2CH2OH)2，-NHCH2COOH，
-NHCH2CH2COOH，-NHCH2CH2CH2COOH，-NHCH(CH3)CH2COOH，
-NHCH2CH(CH3)COOH，-N(CH2COOH)2，-N(CH2CH2COOH)2，-N(CH2CH2CH2COOH)2，
-N(CH2CH(CH3)COOH)2，-NHC6H5，-NHCH2C6H5，-NHCH2CH2C6H5，-N(CH2CH2C6H5)2等。
四苯基亚甲基二氢卟吩化合物的制备方法，包括如下步骤：
将硝基卟啉化合物(II)(其合成方法参照文献Eur.J.Inorg.Chem.2005，3857-3874)和丙二酸二甲酯溶于有机溶剂，在碱性条件下加热反应，将反应液冷后却倒入水中，二氯甲烷萃取。有机相用无水硫酸钠干燥，柱层析分离得到二氢卟吩类衍生物(III)。
上述制得的二氢卟吩类衍生物(III)溶于有机溶剂中，加入氨基化合物或者碱，加热至回流，反应液用二氯甲烷萃取。有机相先用水洗涤后用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，柱层析分离即得四苯基亚甲基二氢卟吩化合物(I)：
其中R1、R2处于苯环的邻位(o-)或间位(m-)或对位(p-)。
R1＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R2＝-H，-OH，-Me，-OMe，-NMe2，-COOH，-F，-Cl或-Br。
R3＝-OH，-OCH2CH2OH，-NHCH3，-NHCH2CH3，-NHCH2CH2CH3，-NHCH(CH3)2，
-NHCH2CH2CH2CH3，-NHCH(CH3)CH2CH3，-NHCH2CH(CH3)2，-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，
-N(CH2CH2CH3)2，-N(CH2CH2CH2CH3)2，-NHCH2CH2OH，-N(CH2CH2OH)2，-NHCH2COOH，
-NHCH2CH2COOH，-NHCH2CH2CH2COOH，-NHCH(CH3)CH2COOH，
-NHCH2CH(CH3)COOH，-N(CH2COOH)2，-N(CH2CH2COOH)2，-N(CH2CH2CH2COOH)2，
-N(CH2CH(CH3)COOH)2，-NHC6H5，-NHCH2C6H5，-NHCH2CH2C6H5，-N(CH2CH2C6H5)2等。
所述步骤中，式(II)制备式(III)时所用的有机溶剂是N，N-二甲基甲酰胺、1，4-二氧六环、二甲基亚砜、乙腈、丙酮、四氢呋喃、乙醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一种或任意多种的混合物。
所述步骤中，式(II)制备式(III)时所用的碱是二异丙基乙基胺、三乙胺、吡啶、钠氢、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、甲酸钠、乙酸钠、甲醇钠、甲醇钾、乙醇钠、乙醇钾、正丙醇钠、正丙醇钾、异丙醇钠、异丙醇钾、叔丁醇钾、叔丁醇钠等中的任意一种或任意多种的混合物；反应温度为60～100℃；反应时间为4～8h。
所述步骤中，式(II)制备式(III)时柱层析分离所用的填充剂为硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶石油醚的混合溶液(1∶10～10∶1)。
所述步骤中，式(III)制备式(I)时所用的有机溶剂是甲醇、乙醇、乙二醇、乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、乙腈、四氢呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚、甲基叔丁基醚、乙二醇二乙醚、乙二醇二正丁醚等中的任意一种或任意多种的混合物。
所述步骤中，式(III)制备式(I)时氨基化合物是NH2CH3，NH2CH2CH3，NH2CH2CH2CH3，NH2CH(CH3)2，NH2CH2CH2CH2CH3，NH2CH(CH3)CH2CH3，NH2CH2CH(CH3)2，NH(CH3)2， NH(CH2CH3)2，NH(CH2CH2CH3)2，NH(CH2CH2CH2CH3)2，NH2CH2CH2OH，NH(CH2CH2OH)2，NH2CH2COOH，NH(CH2CH2COOH)2，NH2CH2CH2COOH，NH(CH2CH2COOH)2，NH2CH2CH2CH2COOH，NH(CH2CH2CH2COOH)2，NH2CH(CH3)CH2COOH，NH2CH2CH(CH3)COOH，NH(CH2CH(CH3)COOH)2，NH2C6H5，NH2CH2C6H5，NH2CH2CH2C6H5，NH(CH2CH2C6H5)2等。
所述步骤中，式(III)制备式(I)时所用的碱是二异丙基乙基胺、三乙胺、吡啶、钠氢、碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、磷酸氢钾、磷酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化锂、磷酸钾、磷酸钠、甲酸钠、乙酸钠、甲醇钠、甲醇钾、乙醇钠、乙醇钾、正丙醇钠、正丙醇钾、异丙醇钠、异丙醇钾、叔丁醇钾、叔丁醇钠等中的任意一种或任意多种的混合物。
所述步骤中，式(III)制备式(I)时柱层析分离所用的填充剂为硅胶，洗脱液为二氯甲烷∶甲醇的混合溶液(100∶1～5∶1)。
本发明所述的四苯基亚甲基二氢卟吩化合物作为光动力药物在肿瘤、视网膜黄斑变性、光化性角化病、鲜红斑痣、尖锐湿疣等疾病的光动力治疗中的用途。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[实施例1]
1、5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亚甲基]二氢卟吩的制备方法
在100mL的三口烧瓶中，加入碳酸钾(620mg，4.5mmol)、丙二酸二甲酯(0.64mL，6.8mmol)和20mL二甲基亚砜，氮气气氛下升温至60℃搅拌反应约1h；然后加入2-硝基-5，10，15，20-四苯基卟啉(400mg，0.606mmol)加热至100℃反应约8h，薄层层析监测至反应完全。待反应液冷却至室温，加入100mL水，用二氯甲烷(100mL×3)萃取水相，合并有机相。有机相用饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，对所得残留物进行柱层析(洗脱液为二氯甲烷∶石油醚＝1∶10)得到紫红色固体粉末5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亚甲基]二氢卟吩280mg，产率约为62％。
在50mL的三口烧瓶中，加入5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亚甲基]二氢卟吩(144mg，0.2mmol)，然后加入8mL四氢呋喃和3N NaOH溶液8mL，加热至回流，薄层层析监测至反应完全。待反应液冷却至室温，加入150mL二氯甲烷萃取。有机相用水(100mL×3)洗涤，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，对所得残留物进行柱层析(洗脱液为甲醇∶二氯甲烷＝1∶10)得到紫红色固体粉末5，10，15，20- 四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亚甲基]二氢卟吩96mg，产率约为68.1％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.67(d，J＝4.6Hz，2H)，8.49(d，J＝7.3Hz，2H)，8.41(d，J＝4.9Hz，2H)，8.37(s，2H)，8.09(dd，J＝16.8Hz，5.8Hz，4H)，7.88(d，J＝5.6Hz，2H)，7.75(m，12H)，4.55(s，2H)，2.31(s，3H)，-2.22(s，2H).MS(ESI)m/z：731.3[M+H]+。UV/Visλmax(CH2Cl2)nm：418(soret)，519，549，595，649。
2、对人食管癌细胞(Eca-109)的光动力抗增殖实验
受试细胞：人食管癌细胞(Eca-109)
受试药物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亚甲基]二氢卟吩(以下简称光敏剂1)，在无菌条件下将该药物溶于最小量吐温-8中，用生理盐水稀释至0.2mg/mL溶液备用；替莫泊芬(上海先辉医药科技有限公司)，配制方法同光敏剂1。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率仪：SD2490型激光功率测量仪。
光动力抗肿瘤细胞增殖作用实验：
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，随之将其接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％CO2培养箱培养，24h后加入浓度不同的光敏剂；12h换成新鲜培养基，然后进行光照(功率25mW/cm2、波长650nm、光剂量18J/cm2)；24h后进行MTT检测。培养终止前4h加入10μl 5mg/ml的MTT，吸弃培养液后加100μl DMSO终止反应，酶标仪570nm检测OD值。实验重复三次。实验结果见表1，结果表明光敏剂1对人食管癌细胞(Eca-109)有显著的光动力抗增殖作用。
表1光敏剂1对人食管癌细胞(Eca-109)增殖抑制作用
3、对裸鼠体内人食管癌细胞(Eca-109)移植瘤的光动力治疗实验
受试动物：BABL/c裸小鼠，平均体重15～20g(上海斯莱克实验动物有限责任公司)
受试药物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[(甲氧羰基，羧基)-亚甲基]二氢卟吩(以下简称光敏剂1)，在无菌条件下将该药物溶于最小量吐温-80中，用生理盐水稀释至0.2mg/mL溶液备用；替莫泊芬(上海先辉医药科技有限公司)，配制方法同光敏剂1。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率仪：SD2490型激光功率测量仪。
人食管癌细胞(Eca-109)移植瘤光动力损伤实验：
无菌条件下于小鼠前胸部皮下接种Eca-109细胞，待肿瘤长至直径5～7mm时，选取生长良好、无溃疡、具半球状单一肿瘤的裸鼠，按同窝同性别随机分组，每组8只，尾静脉注射给药，并以药物溶剂作为空白对照，将替莫泊芬配成相同浓度溶液作为阳性对照，给药后3h用功率密度为180mW/cm2的激光(波长650mm、光剂量100J/cm2)辐射肿瘤；光照后5天，处死小鼠，剥离肿瘤，称瘤重，计算抑制率。
肿瘤抑制率％＝(C-T)/C×100％
式中，T：给药组平均瘤重；C：对照组平均瘤重。
实验结果见表2，光敏剂1对肿瘤具有显著的光动力抑制作用。
表2光敏剂1对肿瘤的抑制效果
*P＜0.05与空白对照
[实施例2]
1、5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羟乙基)氨甲酰基]-亚甲基}二氢卟吩的制备方法
5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亚甲基]二氢卟吩的合成参照实施例1。
在100mL的三口烧瓶中，加入5，10，15，20-四苯基-[2：3]-[二(甲氧羰基)-亚甲基]二氢卟吩(372mg，0.5mmol)，然后加入20mL四氢呋喃，10mL乙醇胺，加热至回流，薄层层析监测至反应完全。待反应液冷却至室温，加入二氯甲烷150mL萃取。有机相用水(100mL×3)洗涤，饱和食盐水(100mL×3)洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤。将滤液减压浓缩，对所得残留物进行柱层析分离(洗脱液为二氯甲烷∶甲醇＝10∶1)得到紫红色固体粉末5，10，15，20- 四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羟乙基)氨甲酰基]-亚甲基}二氢卟吩263mg，产率约为68％。1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.68(d，J＝4.9Hz，2H)，8.51(s，2H)，8.48-8.42(m，4H)，8.13(dd，J＝12.9Hz，6.9Hz，4H)，7.83(d，J＝3.1Hz，2H)，7.77-7.64(m，12H)，7.19(t，J＝5.5Hz，1H)，4.82(s，2H)，3.81-3.77(m，2H)，3.53(dd，J＝10.2Hz，5.6Hz，2H)，2.12(s，3H)，-2.02(s，2H).MS(ESI)m/z：774.7[M+H]+。UV/Visλmax(CH2Cl2)nm：419(soret)，519，549，596，650。
2、对人食管癌细胞(Eca-109)的光动力抗增殖实验
受试细胞：人食管癌细胞(Eca-109)
受试药物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羟乙基)氨甲酰基]-亚甲基}二氢卟吩(以下简称光敏剂2)，在无菌条件下将该药物溶于最小量吐温-80中，用生理盐水稀释至0.2mg/mL溶液备用；替莫泊芬(上海先辉医药科技有限公司)，配制方法同光敏剂2。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率仪：SD2490型激光功率测量仪。
光动力抗肿瘤细胞增殖作用实验：
将处于对数生长期的细胞用胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，随之将其接种于96孔板，每孔100μl，置于37℃5％CO2培养箱培养，24h后加入浓度不同的光敏剂；12h换成新鲜培养基，然后进行光照(功率25mW/cm2、波长650nm、光剂量18J/cm2)；24h后进行MTT检测。培养终止前4h加入10μl 5mg/ml的MTT，吸弃培养液后加100μl DMSO终止反应，酶标仪570nm检测OD值。实验重复三次。实验结果见表3，结果发现光敏剂2对人食管癌细胞(Eca-109)有显著的光动力抗增殖作用。
表3光敏剂2对人食管癌细胞(Eca-109)增殖抑制作用
3、对裸鼠体内人食管癌细胞(Eca-109)移植瘤的光动力治疗实验
受试动物：BABL/c裸小鼠，平均体重15～20g(上海斯莱克实验动物有限责任公司)
受试药物：5，10，15，20-四苯基-[2：3]-{[甲氧羰基，(2-羟乙基)氨甲酰基]-亚甲基}二氢卟吩(以下简称光敏剂2)，在无菌条件下将该药物溶于最小量吐温-80中，用生理盐水稀释至0.2mg/mL溶液备用；替莫泊芬(上海先辉医药科技有限公司)，配制方法同光敏剂2。
光源：XD-650AB型激光器。
激光功率仪：SD2490型激光功率测量仪。
人食管癌细胞(Eca-109)移植瘤光动力损伤实验：
无菌条件下于小鼠前胸部皮下接种Eca-109细胞，待肿瘤长至直径5～7mm时，选取生长良好、无溃疡、具半球状单一肿瘤的裸鼠，按同窝同性别随机分组，每组8只，尾静脉注射给药，并以药物溶剂作为空白对照，将替莫泊芬配成相同浓度溶液作为阳性对照，给药后3h用功率密度为180mW/cm2的激光(波长650mm、光剂量100J/cm2)辐射肿瘤；光照后5天，处死小鼠，剥离肿瘤，称瘤重，计算抑制率。
肿瘤抑制率％＝(C-T)/C×100％
式中，T：给药组平均瘤重；C：对照组平均瘤重。
实验结果见表4，光敏剂2对肿瘤具有显著的光动力抑制作用。
表4光敏剂2对肿瘤的抑制效果
*P＜0.05与空白对照。