本发明涉及一种肉制品中兽药残留的检测方法，具体涉及一种以磁性石墨烯为吸附剂的固相萃取结合液质联用仪来检测肉制品中兽药残留的方法，属于食品安全检测
技术领域：
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背景技术：
：现有技术中对于肉制品中兽药残留的检测，都需要进行样品前处理，而样品前处理是消除基质干扰、保护仪器的关键步骤，主要包括提取、分离、净化、浓缩等过程，能有效提高方法的准确度、精密度和灵敏度。通常，样品前处理约占整个分析时间的一半以上，是整个分析检测过程的关键，也是食品安全检测的难点和热点问题之一。近年来，在样品前处理上普遍被关注的新方法、新技术主要有凝胶渗透色谱、加速溶剂提取、微波辅助溶剂萃取和固相萃取。凝胶渗透色谱适用于富含脂肪、色素等大分子的样品；加速溶剂提取广泛应用于各领域的样品前处理过程，特别是农药残留的分析，但是由于该方法的设备价格昂贵，其应用受到一定的限制；微波辅助溶剂萃取主要用于提取植物中的天然成分；固相萃取所采用的吸附材料有碳纳米管、活性炭、C18硅胶等，由于这些吸附材料的吸附能力有限，导致其萃取效率低，增加了溶剂的使用量，加大了处理成本，耗时长，导致后续分析检测结果的准确度、精密度和灵敏度降低。技术实现要素：针对现有技术存在的不足，本发明提供了一种磁性石墨烯固相萃取结合液质联用仪检测肉制品中兽药残留的方法，先以磁性石墨烯为吸附剂进行固相萃取，然后再进行HPLC-MS/MS测定分析，该方法具有成本低、易操作、耗时短、重现性好的特点。一种磁性石墨烯固相萃取结合液质联用仪检测肉制品中兽药残留的方法，所述方法包括，先以磁性石墨烯为吸附剂进行固相萃取，然后再进行HPLC-MS/MS测定分析；所述兽药为金刚烷类化合物或卡巴氧类化合物或磺胺类化合物或二氧嘧啶类化合物或喹诺酮类化合物或大环内酯类化合物中的一种或几种；所述磁性石墨烯由石墨烯与磁性纳米粒子复合而成，所述磁性石墨烯为市售产品，采购于南京先丰纳米材料科技有限公司。本发明之所以采用磁性石墨烯作为吸附剂进行前处理，是根据样品的性质进行选择的，因为在样品中的杂质主要是色素、油脂、极性和非极性非目标化合物，而磁性石墨烯的比表面积较大，能有效吸附这些杂质，降低基质干扰作用，提高目标化合物回收率。由于样品前处理是检测分析的关键点之一，所以只有把样品处理好，才能有效提高检测方法的准确度、精密度和灵敏度，本发明采用磁性石墨烯作为吸附剂进行前处理，萃取效率高，大大减少了溶剂的使用，耗时减少，大大降低了处理成本。一种磁性石墨烯固相萃取结合液质联用仪检测肉制品中兽药残留的方法，具体步骤包括：(1)标准溶液的配置标准储备溶液的配置：准确称取各标准品分别用乙腈或甲醇溶解并定容至100mL，混匀，配置成浓度为100μg/mL的标准储备溶液，并将该溶液放在0～4℃冰箱中保存；中间标准储备溶液的配置:准确移取上述各标准储备溶液，分别用乙腈或甲醇定容至100mL，混匀，配置成浓度为1.0μg/mL的中间标准储备溶液；(2)待测样品的制备从所取原始肉样品中取出部分样品，经高速组织捣碎机捣碎均匀，充分混匀，用四分法缩分出不少于200g的待测样品，装入清洁容器内，加封后，表明标记，放入冰箱内；(3)净化取上述待测样品，解冻，准确称取2.00士0.02g置于50mL离心管中，加入2mL水和10mL乙腈/甲醇(80/20，v/V)，均质器均质2min，然后加入4.0g无水硫酸镁和1.0g氯化钠，再涡旋振荡提取2min，5000r/min离心10min，得到上清液；(4)萃取称取10mg磁性石墨烯和150mg无水硫酸镁于50mL离心管中，加入上述上清液，置于振荡器上振荡2min，再用磁铁将磁性石墨烯聚集到离心管底部，将上清液转入10mL离心管中，氮气吹干，流动相定容至1mL，过0.22μm滤膜，再进行HPLC-MS/MS测定分析；所述兽药为金刚烷胺或痢菌净或磺胺嘧啶或磺胺噻唑或磺胺甲噻二唑或甲氧苄啶或环丙沙星或恩诺沙星或氧氟沙星或替米考星中的一种或几种，所述兽药纯度均大于98％，均采购于美国Sigma公司。金刚烷胺，又称1-金刚烷胺，分子式为C10H17N，CAS号为768-94-5，属于金刚烷类化合物；痢菌净，又名乙酰甲喹，3-甲基-2-乙酰基-1,4-二氧喹啉，CAS号为16915-79-0，分子式为C10H10N2O3，属于卡巴氧类化合物；磺胺嘧啶，分子式C10H10N4O2SCAS号为68-35-9；磺胺噻唑，分子式C9H9N3O2S2CAS号为72-14-0；磺胺甲噻二唑，分子式C9H10N4O2SCAS号为144-82-1；均属于磺胺类化合物；甲氧苄啶，又名甲氧苄氨嘧啶，CAS号为738-70-5，属于二氨嘧啶类化合物；分子式C14H18N4O3环丙沙星分子式C17H18FN3O3，恩诺沙星分子式C19H22FN3O3与氧氟沙星分子式C18H20FN3O4，均属于喹诺酮类化合物；替米考星分子式C46H80N2O13，属于大环内酯类化合物。所述HPLC-MS/MS测定分析的条件为：色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18，1.8μm，3.0×100mm；柱温：40℃；进样量：20μL；流动相：A体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B乙腈；HPLC梯度洗脱条件为：离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测；离子源温度(GASTemp)：350℃；气体流速(GASFlow)：10L/min；雾化器压力(Nebulizer)：40psi。所述兽药的质谱参数：鉴于同时测定分析本文所述的兽药，所以在HPLC-MS/MS测定分析过程中，选用了柱长为3.0×100mmC18色谱柱，同时选用1.8um的填料，使得柱体单位体积内的表面积大大增加，柱效显著提高；并且根据本文所述兽药的性质，使用0.3mL/min的柱流速与电喷雾离子化方式的流速具有良好的匹配，进一步有效提高检测方法的准确度、精密度和灵敏度。本发明所述设备均为市售设备。所述的肉制品为鸡肉或猪肉的一种。步骤(3)中所述的无水硫酸镁和氯化钠均是以固体形式加入的，无水硫酸镁起吸水作用，氯化钠起盐析作用。步骤(4)中所述的无水硫酸镁是以固体形式加入的，无水硫酸镁起吸水作用。步骤(3)中所述均质器的转速为10000转/min。步骤(4)中所述流动相为乙腈/甲酸水溶液，20％V/80％V，其中甲酸水溶液中甲酸的体积分数为0.1％。本发明所述磁性石墨烯固相萃取结合液质联用仪检测肉制品中兽药残留的方法，所述方法包括，先以磁性石墨烯为吸附剂进行固相萃取，然后再进行HPLC-MS/MS测定分析。所述方法与现有技术相比，(1)采用磁性石墨烯为吸附剂进行固相萃取，操作简单，快速高效，大大的节约了样品前处理的时间；(2)磁性石墨烯作为吸附剂经过清洗后可以循环利用，节约成本；(3)以磁性石墨烯为吸附剂进行固相萃取，回收率高，然后结合HPLC-MS/MS测定分析，可以同时提供目标化合物的保留时间和分子结构信息，灵敏度高，并且可以进行定量分析与定性确证，具有重复性好、操作性好、简单、经济等优点，适合于日常检测。附图说明图1是本发明所述兽药样品金刚烷胺的质谱图；图2是本发明所述兽药样品痢菌净的质谱图；图3是本发明所述兽药样品磺胺嘧啶的质谱图；图4是本发明所述兽药样品磺胺噻唑的质谱图；图5是本发明所述兽药样品磺胺甲噻二唑的质谱图；图6是本发明所述兽药样品甲氧苄啶的质谱图；图7是本发明所述兽药样品环丙沙星的质谱图；图8是本发明所述兽药样品恩诺沙星的质谱图；图9是本发明所述兽药样品氧氟沙星的质谱图；图10是本发明所述兽药样品替米考星的质谱图；本发明所有检测均是在潍坊出入境检验检疫局完成。具体实施方式实施例1样品来源：购于潍坊市南下河市场冷冻鸡胸肉5份，每份500g。分别经高速组织捣碎机捣碎均匀，充分混匀。(1)标准溶液的配制将10种所述兽药标准储备液稀释至相应浓度的标准工作液，见表1。表1各化合物的标准品浓度梯度表(2)提取取上述待测样品，解冻，准确称取2.00士0.02g置于50mL离心管中，加入2mL水和10mL乙腈/甲醇(80/20，v/v)，均质器均质2min，然后加入4.0g无水硫酸镁和1.0g氯化钠，再涡旋振荡提取2min，5000r/min离心10min，得到上清液；(3)净化称取10mg磁性石墨烯和150mg无水硫酸镁于50mL离心管中，加入上述上清液，置于振荡器上振荡2min，再用磁铁将磁性石墨烯聚集到离心管底部，将上清液转入10mL离心管中，氮气吹干，流动相定容至1mL，过0.22μm滤膜，再进行HPLC-MS/MS测定分析；(4)液相色谱条件色谱柱：ZORBAXEclipsePlusC18，1.8μm，3.0×100mm；柱温：40℃；进样量：20μL；流动相：A体积分数为0.1％的甲酸水溶液，B乙腈；HPLC梯度洗脱条件为：时间(min)流速(μL/min)A(％)B(％)0.0030090103.0030070307.0030020807.1300901010.03009010(5)质谱条件离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多重反应监测；GASTemp：350℃；GASFlow：10L/min；Nebulizer：40psi；所述兽药的质谱参数：结果与分析线性范围、定量限、回收率和精密度用基质提取液配制一系列不同浓度的化合物混合标准溶液，依次进样，以响应峰面积为纵坐标Y，对相应浓度X(μg/kg)进行线性回归分析，由工作站可直接计算回归方程及相关系数，见表2。10种所述兽药在5-80μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9950，该标准曲线可靠。用空白样品加标方法进行回收率和精密度实验。分别对鸡肉进行三个不同水平的加标，每个水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表2。从表2可以看出，各种化合物在L1，L3，L5加标水平的回收率在73.9％～112.8％之间，相对标准偏差(RSD)在10.3％～13.7％之间。表2鸡肉添加样品的平均回收率(基质校正和标准品)及精密度(基质校正)应用本实验建立的方法对市售的5份鸡肉样品进行定性定量检测，每个样品均按照上述方法进行样品前处理，之后采用HPLC-MS/MS测定分析，采用基质匹配校准曲线定量计算。结果显示，只有两个样品中有微量的药物残留检出，分别为替米考星和恩诺沙星，其余未检出。实施例2样品来源：购于潍坊市南下河市场生猪肉5份，每份500g。分别经高速组织捣碎机捣碎均匀，充分混匀。按实施例1所述步骤进行。结果与分析线性范围、定量限、回收率和精密度用基质提取液配制一系列不同浓度的化合物混合标准溶液，依次进样，以响应峰面积为纵坐标Y，对相应浓度X(μg/kg)进行线性回归分析，由工作站可直接计算回归方程及相关系数，见表3。10种所述兽药在5-80μg/kg范围内线性关系良好，相关系数均大于0.9960，该标准曲线可靠。用空白样品加标方法进行回收率和精密度实验。分别对生猪肉进行三个不同水平的加标，每个水平平行测定6次，计算回收率和相对标准偏差，结果见表3。从表3可以看出，各种化合物在L1，L3，L5加标水平的回收率在80.5％～100.8％之间，相对标准偏差(RSD)在7.3％～12.7％之间。表3生猪肉添加样品的平均回收率(基质校正和标准品)及精密度(基质校正)应用本实验建立的方法对市售的5份生猪肉样品进行定性定量检测，每个样品均按照上述方法进行样品前处理，之后采用HPLC-MS/MS测定分析，采用基质匹配校准曲线定量计算。结果显示，10种药物均未检出。当前第1页1 2 3