一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法及获得的指纹图谱与流程

本发明涉及药物领域，特别涉及一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法及获得的指纹图谱。

背景技术：

过敏性鼻炎颗粒主治证属风邪犯肺，鼻窍失畅，或因某些致敏因素导致过敏而见鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕，或因过敏性鼻炎发作，用于鼻鼽，即春季、秋冬季节性过敏性鼻炎，其功效为疏风宣肺、通利鼻窍。处方由辛夷、紫苏叶、荆芥、苍耳子、白芷等9味药材组成。

其中辛夷、紫苏叶、荆芥、苍耳子、白芷5味药材混合提取的挥发油后包合入药。辛夷挥发油具有明显抑制实验性哮喘豚鼠气道浸润eos细胞数,减轻哮喘气道的炎症反应的作用，表现出对气道炎症的抑制与改善；紫苏叶的挥发油是其重要的药理活性成分；荆芥挥发油具有镇痛、抗炎、扩张支气管和抗过敏等功效。

但是未见成品的指纹图谱，无法有效控制过敏性鼻炎颗粒的内在质量。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法及获得的指纹图谱。本发明建立了成品的挥发油的指纹图谱，以更为有效的控制过敏性鼻炎颗粒的内在质量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法，包括如下步骤：

供试品的制备；

对照品的制备；

气相色谱检测：分别取所述供试品和所述对照品进行气相色谱检测，获得指纹图谱；

其中，气相色谱的柱温采用程序升温，所述程序升温为初温40～60℃，以1～5℃/min升温至100～160℃，保持1～5min，再以5～15℃/min升温至180～250℃，保持1～5min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述程序升温为初温50℃，以3℃/min升温至140℃，保持2min，再以10℃/min升温至200℃，保持2min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述气相色谱柱的前进样口温度：200℃；压力10.631psi；自动进样，进样量1μl，分流进样，分流比5:1；柱流量：2.5ml/min；压力10.631psi。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述检测器为fid检测器，所述检测器的温度250℃；h2流量30ml/min；空气流量300ml/min；n2流量27.5ml/min；总流量18ml/min。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述色谱柱为hp-5phenylmethylsiloxane(固定液为5％甲基苯基硅氧烷)毛细管柱，30m×320μm×0.25μm，载气为氮气。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述供试品溶液的制备方法为取过敏性鼻炎颗粒与水混合，于90℃～100℃搅拌，冷却、离心，加乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，离心，获得供试品溶液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述制备方法中所述对照品溶液的制备方法为取胡薄荷酮与乙酸乙酯混合，获得对照品溶液。

本发明还提供了所述的制备方法获得的过敏性鼻炎颗粒的指纹图谱，其由12个共有指纹峰构成，第1～12号色谱峰分别依次对应β-檀香醇、桉叶素、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇、樟脑、左旋薄荷酮、松油烯-4-醇、α-松油醇、胡薄荷酮、2-乙酰基呋喃、4-(1,1二甲基丙基)苯酚、4-羟基-苯乙酸甲基酯和1-(2,4-二羟基苯基)-2-(4-甲氧基-3-硝基苯基)乙酮，所述指纹图谱的12个共有指纹峰的保留时间为：

在本发明的一些具体实施方案中，以保留时间为15.333min(胡薄荷酮)的峰为参照峰，所述指纹图谱的12个共有指纹峰的相对保留时间及相对保留时间标准偏差rsd如下：

在本发明的一些具体实施方案中，以保留时间为15.333min(胡薄荷酮)的峰为参照峰，所述指纹图谱的12个共有指纹峰的相对峰面积标准偏差rsd如下：

本发明提供了一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法，包括如下步骤：供试品的制备；对照品的制备；气相色谱检测：分别取所述供试品和所述对照品进行气相色谱检测，获得指纹图谱；其中，气相色谱的柱温采用程序升温，所述程序升温为初温40～60℃，以1～5℃/min升温至100～160℃，保持1～5min，再以5～15℃/min升温至180～250℃，保持1～5min。

本发明建立了过敏性鼻炎颗粒中挥发油的气相指纹图谱方法，确立了过敏性鼻炎颗粒中12个特征峰。10批成品指纹图谱相似度在0.90以上。建立的gc指纹图谱有较好的精密度、重复性和稳定性，适用于过敏性鼻炎颗粒的质量控制。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示精密度考察气相指纹图谱；

图2示稳定性考察气相指纹图谱；

图3示重复性考察气相指纹图谱；

图4示过敏性鼻炎颗粒对照指纹图谱；

图5示10批过敏性鼻炎颗粒指纹图谱；

图6示过敏性鼻炎颗粒总离子流色谱图；

图7示成品(s1)与苍耳子(s2)相关性指纹图谱；

图8示成品(s1)与荆芥(s2)相关性指纹图谱；

图9示成品(s1)与紫苏叶(s2)相关性指纹图谱；

图10示成品(s1)与辛夷(s2)相关性指纹图谱；

图11示成品(s1)与白芷(s2)相关性指纹图谱；

图12示色谱条件1下样品色谱图；

图13示色谱条件2下样品色谱图；

图14示色谱条件3下样品色谱图；

图15示色谱条件4下样品色谱图；

图16示水蒸气蒸馏法提取挥发油的气相色谱图；

图17示乙醇回流提取挥发油的气相色谱图；

图18示乙酸乙酯回流提取挥发油的气相色谱图；

图19示热水提取乙酸乙酯萃取挥发油的气相色谱图。

具体实施方式

本发明公开了一种过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法及获得的指纹图谱，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的指纹图谱的制备方法如下：

2.1色谱条件

色谱柱：hp-5phenylmethylsiloxane(固定液为5％甲基苯基硅氧烷)毛细管柱，30m×320μm×0.25μm。载气：氮气；前进样口温度：200℃；压力10.631psi；自动进样，进样量1μl，分流进样，分流比5:1；柱流量：2.5ml/min；压力10.631psi；fid检测器，检测器温度250℃；h2流量30ml/min；空气流量300ml/min；n2流量27.5ml/min。总流量18ml/min。柱温采取程序升温，升温程序初温50℃(40～60℃)，以3℃/min(1～5℃/min)升温至140℃(100-160℃)，保持2min(1-5min),再以10℃/min(5-15℃/min)升温至200℃(180～250℃)，保持2min(1-5min)。

2.2、参照物溶液的制备

分别取胡薄荷酮适量，加乙酸乙酯配成每1ml含50ug的溶液，作为对照品溶液。

2.3、供试品溶液的制备

取本品10g，加热水(温度>90℃)50ml搅拌使溶解，放冷离心，加乙酸乙酯10ml萃取，取乙酸乙酯层，离心，作为供试品溶液。

本发明提供的过敏性鼻炎颗粒指纹图谱的制备方法及获得的指纹图谱中所用原料及试剂均可由市场购得。

仪器：agilent7890a型气相色谱仪，fid检测器。胡薄荷酮对照品，批号：111706-201205，购自中国药品生物制品检定所提供,含量测定用)，水(超纯水)；其余试剂均为分析纯。

药材：过敏性鼻炎颗粒来自江苏康缘药业股份有限公司。批号为：150101、150102、150103、150201、150202、150203、150204、150401、150402、150403。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

2.1色谱条件

色谱柱：hp-5phenylmethylsiloxane(固定液为5％甲基苯基硅氧烷)毛细管柱，30m×320μm×0.25μm。载气：氮气；前进样口温度：200℃；压力10.631psi；自动进样，进样量1μl，分流进样，分流比5:1；柱流量：2.5ml/min；压力10.631psi；fid检测器，检测器温度250℃；h2流量30ml/min；空气流量300ml/min；n2流量27.5ml/min。总流量18ml/min。柱温采取程序升温，升温程序初温50℃，以3℃/min升温至140℃，保持2min,再以10℃/min升温至200℃，保持2min。

2.2、参照物溶液的制备

分别取胡薄荷酮适量，加乙酸乙酯配成每1ml含50ug的溶液，作为对照品溶液。

2.3、供试品溶液的制备

取本品10g，加热水(温度>90℃)50ml搅拌使溶解，放冷离心，加乙酸乙酯10ml萃取，取乙酸乙酯层，离心，作为供试品溶液。

实施例2

2.1色谱条件

色谱柱：hp-5phenylmethylsiloxane(固定液为5％甲基苯基硅氧烷)毛细管柱，30m×320μm×0.25μm。载气：氮气；前进样口温度：200℃；压力10.631psi；自动进样，进样量1μl，分流进样，分流比5:1；柱流量：2.5ml/min；压力10.631psi；fid检测器，检测器温度250℃；h2流量30ml/min；空气流量300ml/min；n2流量27.5ml/min。总流量18ml/min。柱温采取程序升温，升温程序初温40℃，以5℃/min升温至100℃，保持5min,再以5℃/min升温至180℃，保持1min。

2.2、参照物溶液的制备

分别取胡薄荷酮适量，加乙酸乙酯配成每1ml含50ug的溶液，作为对照品溶液。

2.3、供试品溶液的制备

取本品10g，加热水(温度>90℃)50ml搅拌使溶解，放冷离心，加乙酸乙酯10ml萃取，取乙酸乙酯层，离心，作为供试品溶液。

实施例3

2.1色谱条件

色谱柱：hp-5phenylmethylsiloxane(固定液为5％甲基苯基硅氧烷)毛细管柱，30m×320μm×0.25μm。载气：氮气；前进样口温度：200℃；压力10.631psi；自动进样，进样量1μl，分流进样，分流比5:1；柱流量：2.5ml/min；压力10.631psi；fid检测器，检测器温度250℃；h2流量30ml/min；空气流量300ml/min；n2流量27.5ml/min。总流量18ml/min。柱温采取程序升温，升温程序初温60℃，以1℃/min升温至160℃，保持1min,再以15℃/min升温至250℃，保持5min。

2.2、参照物溶液的制备

分别取胡薄荷酮适量，加乙酸乙酯配成每1ml含50ug的溶液，作为对照品溶液。

2.3、供试品溶液的制备

取本品10g，加热水(温度>90℃)50ml搅拌使溶解，放冷离心，加乙酸乙酯10ml萃取，取乙酸乙酯层，离心，作为供试品溶液。

实施例4指纹图谱方法学考察

3.1.1精密度试验

取批号为150201的过敏性鼻炎颗粒，按实施例1中2.3供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，照实施例1中2.1方法连续进样6次进行测定。考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.06％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值均rsd≤2.31％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，符合指纹图谱的技术要求。表明该方法精密度良好。(见图1)

特征峰的相对保留时间和相对峰面积

以保留时间15.328min(胡薄荷酮)的峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。(见表1、表2)

表1特征峰相对保留时间

表2特征峰的相对峰面积

用相似度软件计算，将s1作为参照谱，相似度如表3所示：

表3精密度考察图谱的相似度

结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.06％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值均rsd≤2.31％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，符合指纹图谱的技术要求。表明该方法精密度良好。按照实施例2或实施例3提供的色谱条件、参照物溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法进行上述实验，实验结果与上述结果无显著差异(p＞0.05)，表明本发明提供的方法的精密度好。

实施例5指纹图谱方法学考察

3.1.2稳定性试验

取批号为150201的过敏性鼻炎颗粒，按2.3供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，照2.1方法于0、3、6、9、12小时分别测定一次指纹图谱，共测5次考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值。结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.04％，相对峰面积＞3.06％的共有峰相对峰面积值均rsd≤9.45％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液12小时内成分是稳定的。(见图2)

特征峰的相对保留时间和相对峰面积：

以保留时间15.370min(胡薄荷酮)的峰为参照峰，,计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。(见表4、表5)

表4特征峰的相对保留时间

表5特征峰的相对峰面积

将s1作为参照谱，以相似度软件计算图谱间相似度，见表6。

表6稳定性考察图谱的相似度

结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.04％，相对峰面积＞3.06％的共有峰相对峰面积值均rsd≤9.45％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明供试品溶液12小时内成分是稳定的。

按照实施例2或实施例3提供的色谱条件、参照物溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法进行上述实验，实验结果与上述结果无显著差异(p＞0.05)，表明本发明提供的方法的稳定性好。

实施例6指纹图谱方法学考察

3.1.3重复性试验

取批号为150201的过敏性鼻炎颗粒，按2.3供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，平行制备6份，照2.1方法测定指纹图谱，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积＞3％的共有峰面积值，结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.05％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值均rsd≤3.71％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明该方法可较好重复。

根据以上方法学考察结果，表明该方法测定过敏性鼻炎颗粒指纹图谱，精密度、重复性、稳定性均较好，能够准确测定该制剂的指纹图谱。(见图3)。

以保留时间为15.333min(胡薄荷酮)的峰为参照峰，计算各共有峰相对保留时间和相对峰面积。(见表7、表8)

表7特征峰的相对保留时间

表8特征峰的相对峰面积

3.3.2相似度计算

以s1为参照峰，用相似度软件计算，见表9。

表9重复性考察图谱的相似度

结果各共有峰相对保留时间均rsd≤0.05％，相对峰面积＞3％的共有峰相对峰面积值均rsd≤3.71％，又以第1次进样所得指纹图谱作为参照计算后5次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度结果均不小于0.99，表明该方法可较好重复

按照实施例2或实施例3提供的色谱条件、参照物溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法进行上述实验，实验结果与上述结果无显著差异(p＞0.05)，表明本发明提供的方法的重复性好。

实施例7指纹图谱的建立

分别取10批不同批号的过敏性鼻炎颗粒，按实施例1供试品的制备方法制备，分别测定。将10批过敏性鼻炎颗粒指纹图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统的操作规范软件(版本2004a)，对色谱峰进行多点校正后，自动匹配，生成对照指纹图谱(见图4)，共标定12个共有峰，其中胡薄荷酮为参照峰(s)，各批过敏性鼻炎颗粒样品(见图5)与对照指纹图谱比较相似度在0.979～0.993。过敏性鼻炎颗粒样品的出峰时间见表10(该出峰时间为对照指纹图谱的12个色谱峰的出峰时间)。

表10各批过敏性鼻炎颗粒样品的出峰时间

按照实施例2或实施例3提供的色谱条件、参照物溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法进行上述实验，实验结果与上述结果无显著差异(p＞0.05)，表明本发明提供的方法的相似度好。

实施例8gc-ms指纹图谱

应用gc-ms联用技术，对过敏性鼻炎颗粒指纹图谱中的峰进行了初步定性。总离子流图见图6。

通过计算机内系统解卷积检索出图谱中可能存在的化合物，并根据nist系统质谱图库检索匹配，确认结构。参考标准质谱图集及有关文献，初步确

定该挥发油中12个特征峰化学成分及结构，见表11。

表11过敏性鼻炎颗粒gc共有峰化学成分归属

表1210批过敏性鼻炎颗粒指纹图谱相似度数据

10批过敏性鼻炎颗粒样品与对照指纹图谱比较相似度在0.979～0.993，10批样品的批间一致性良好。

按照实施例2或实施例3提供的色谱条件、参照物溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法进行上述实验，实验结果与上述结果无显著差异(p＞0.05)。

实施例9药材成品相关性研究

分别取过敏性鼻炎颗粒处方中各药材适量至1000ml圆底烧瓶中，加水至容器体积1/3，连接挥发油提取器和球形冷凝管，用电热套加热，回流提取6h，用乙酸乙酯溶解并分取挥发油至10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度。作为供试品溶液；按照成品指纹图谱方法测定。各味药材与成品相关性见图7～图11：

由相关性图谱可知，过敏性鼻炎颗粒指纹图谱中1、2、4、6、7号峰主要来源于辛夷；3号峰主要来源于紫苏叶、辛夷；8号峰主要来源于荆芥；9号峰主要来源于荆芥、紫苏叶、辛夷、白芷、苍耳子；10号峰主要来源于荆芥、紫苏叶。

实施例10色谱条件的筛选

色谱条件确认过程中，对色谱条件下4种升温程序及分流比进行了考察，以2.1色谱条件分离效果最好，因此选择用该条件作为过敏性鼻炎颗粒测定色谱条件。

色谱条件1：总流量30.5ml/min；分流比10:1，流速25ml/min；升温程序初温50℃，以10℃/min升温至200℃，保持5min,运行总时间20min。

色谱条件2：总流量18ml/min；分流比10:1，流速12.5ml/min；升温程序初温50℃，以5℃/min，升温至150℃，保持2min,再以10℃/min升温至200℃，保持3min，运行总时间30min。

色谱条件3：总流量18ml/min；分流比5:1，流速12.5ml/min；升温程序初温50℃，以4℃/min，升温至150℃，保持2min,再以10℃/min升温至200℃，保持3min，运行总时间35min.

色谱条件4：总流量18ml/min；分流比5:1，流速12.5ml/min；升温程序初温50℃，以3℃/min升温至140℃，保持2min,再以10℃/min升温至200℃，保持2min，运行总时间40min。

分别按2.2、2.3项下制得胡薄荷酮对照品溶液和供试品溶液。将各对照品溶液和供试品溶液在气相色谱仪上，按照不同的色谱条件，分别进样1μl，得到挥发油不同色谱条件下的气相色谱图如12～15。

通过对色谱图的分析比较，考察不同色谱方法下的峰分离效果，可以看出时间越长，得到色谱峰越多。色谱条件1下，部分色谱峰过为密集，如5.88～7.00min之间的峰，分离效果不佳。条件2下的色谱图较条件1图谱峰分得更开，减少了峰重叠，得到更多的单个完整色谱峰，色谱条件2中主要峰基本分开。条件3和条件4分析时间延长，分析时间条件4较条件3的色谱图更为清晰完整，峰分离得更好。色谱条件4可使样品挥发油中各组分得到较好的分离,基线平稳，谱图清晰，主要色谱峰分离良好，更加符合指纹图谱一般要求。所以最终选择了该条件为样品gmxby颗粒挥发油的气相指纹图谱条件。

根据指纹图谱建立的标准，色谱条件4下，将样品挥发油指纹图谱图谱与溶剂乙酸乙酯的指纹图谱对照分析表明,2.6min以前，样品图谱出现的为溶剂峰，35min前,样品中的有效成分已经完全得到分离,分析时间在40min以内。符合中药指纹图谱研究的技术相关要求。

为了能更好的建立指纹图谱，我们考察了4中提取方法下获得的挥发油指纹图谱，经比较分析，确定热水溶解乙酸乙酯萃取的提取方式最佳。该种方式提取方式简单，提取时间短，获得的挥发油成分丰富，收率高，指纹图谱中，除已知成分胡薄荷酮能够较好的辨别出外，其它成分指纹峰也能被较好地体现，且各峰分离度好，谱图清晰所以我们最终选择这种提取方式。

挥发油的不同提取方法：

直接提取挥发油：

水蒸气蒸馏法提取挥发油精密称取20.0ggmxby颗粒样品至500ml圆底烧瓶中，加水至容器体积1/3，连接挥发油提取器和球形冷凝管，用电热套加热，回流提取4h，用乙酸乙酯溶解并分取挥发油至10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，离心后作为供试品溶液。

有机溶剂提取挥发油：

乙醇回流提取挥发油精密称取5.0ggmxby颗粒样品至250ml圆底烧瓶中，加乙醇60ml,连接球形冷凝管，水浴回流提取30min,过滤，取滤液，离心后作为供试品溶液。

乙酸乙酯回流提取挥发油精密称取5.0ggmxby颗粒样品至至250ml圆底烧瓶中，加乙酸乙酯20ml,连接球形冷凝管，水浴回流提取30min,过滤，取滤液，离心后作为供试品溶液。

热水提取乙酸乙酯萃取挥发油：

精密称取10.0ggmxby颗粒样品置250ml锥形瓶中，加90℃以上热水搅拌使溶解，放冷后用10ml乙酸乙酯萃取，离心后取离心液至分液漏斗中，分取乙酸乙酯层，离心后作为供试品溶液。

挥发油气相指纹图谱的获得：

将各对照品溶液和各供试品溶液在气相色谱仪上，按照1.2.1下色谱条件1，分别进样1μl，得到各挥发油的气相色谱图(见图16～图19)。

不同提取方式提取的挥发油比较：

观察色谱图，并统计不同提取方式提取的挥发油色谱峰数。从图中可以看出，水蒸气蒸馏法和热水提取乙酸乙酯萃取的挥发油的气相色谱图主要色谱峰相似。用水蒸气蒸馏法提取挥发油耗时长，因加热温度高，且加热时间较长，混合提取的挥发油中对热不稳定的成分容易发生分解。用有机溶剂回流提取的方法提取的挥发油，从图上看得到的色谱峰过少，杂峰多。用热水溶解，乙酸乙酯萃取的方法提取的挥发油成分丰富，收率高，主要色谱峰分离较好，重叠少，杂峰少。峰形好，峰强度较高的几个主要峰峰面积占总峰面积达到较高比例，特征性强。且这种方法操作简单，提取时间短，综合考虑，选择这种方式为样品挥发油提取的最佳方式。

过敏性鼻炎颗粒挥发油样品对比各药材时，5味药材中荆芥、紫苏叶、辛夷挥发油含量较高，体现在指望图谱中有明显对应峰且强度较大。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。