基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法与流程

本发明涉及仪器分析技术领域，具体涉及一种基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法。

背景技术：

近几年研究发现，β-酪蛋白根据其结构的不同可分为a1、a2、b等多种类型。含有a2型β-酪蛋白的牛奶中不含有bcm7，这种牛奶叫做a2牛奶。a2β-酪蛋白是现代奶牛β-酪蛋白的天然原型。基于a2β-酪蛋白制成的配方奶粉，可能与母乳更接近，更有利于促进婴幼儿的生长发育。

β-酪蛋白是人乳和牛乳中的一种主要蛋白，且广泛存在于各种乳制品中。牛乳中的β-酪蛋白有两个主要的变异型，a1和a2。a1和a2β-酪蛋白的蛋白质结构存在差异，a1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，因此其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(bcm-7)。a2型的第67位则为脯氨酸，则不会生成bcm-7。正是这种结构差异,使a2β-酪蛋白比a1更接近天然母乳中的蛋白质。实验证明，a2β-酪蛋白有潜力改善宝宝的消化功能，促进宝宝对营养物质的吸收，呵护宝宝稚嫩的消化系统；含有a2β-酪蛋白的配方，从源头上最大程度地避免了(由a1酪蛋白引起的)不良的健康反应。这个观点已得到全球100多项科学论文的支持和认同。

技术实现要素：

为了对乳制品中的β-酪蛋白进行有效的分离，得到最有利于人体健康的产品，本发明提供了一种基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，包括如下步骤：

s1：制备β-酪蛋白标准品；

s2：制备β-酪蛋白样品；

s3：制备第一流动相和第二流动相；

s4：在液相色谱仪中进样样品后，在不同时间以不同浓度比例的第一流动相和第二流动相的混合液分别冲洗β-酪蛋白样品和β-酪蛋白标准品，根据β-酪蛋白标准品中β-酪蛋白两种不同结构样品的出峰时间，实现β-酪蛋白样品中不同结构样品的分离；

其中，所述第一流动相为三氟乙酸水溶液，第二流动相为乙腈溶液。

其中，所述步骤s4中，从β-酪蛋白样品中分离出的不同结构样品分别为a1型β-酪蛋白以及a2型β-酪蛋白。

其中，所述β-酪蛋白样品的制备方法包括：

s21：取冷冻奶样，加入第一工作液，使冷冻奶样融化后振荡混匀，室温静置得混合液；

s22：将混合液离心，去除表层乳脂，得底层溶液；

s23：将底层溶液以第二工作液稀释，混匀、过滤得β-酪蛋白样品。

其中，所述第一工作液为双-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、盐酸胍、柠檬酸钠以及二硫苏糖醇的混合液，其中，混合液中各物质的摩尔浓度分别介于：0.05-0.15mol/l、4-8mol/l、5-8mmol/l、15-25mmol/l；

所述第二工作液的溶剂为质量浓度介于0.5-1.5g/l的三氟乙酸溶液，溶质为盐酸胍，盐酸胍的浓度介于4-6mol/l。

其中，所述步骤s22中，相对离心力介于14000-20000g，离心时间介于2-6min，离心温度为介于2-6℃。

其中，所述步骤s21中，冷冻奶样与第一工作液的体积比为1：1。

其中，所述步骤s23中，底层溶液与第二工作液的体积比为1：3。

其中，所述第一流动相中，三氟乙酸的质量浓度介于0.5-1.5g/l。

其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：柱温介于40-50℃，吸收波长介于200-250nm，流速介于0.3-0.6ml/min，进样体积介于8-12ul。

其中，所述步骤s4中，所用的反相色谱柱为c83.5μm150mm×4.6mm或与其性能相当的色谱柱。

本发明提供的基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，简单易行、方便可靠、重现性好、准确度高，能够实现对样品的批量检测，大大减少分析时间。

附图说明

图1：本发明所制备的β-酪蛋白样品的液相色谱图；

图2：本发明所制备的β-酪蛋白样品的另一液相色谱图；

图3：根据本发明的方法得到的β-酪蛋白标准品的液相色谱图。

具体实施方式

为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面配合附图详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。

本发明提供了一种基于高效液相色谱的对乳制品中β-酪蛋白分型的方法，包括如下步骤：

s1：制备β-酪蛋白标准品；

s2：制备β-酪蛋白样品；

s3：制备第一流动相和第二流动相；

s4：在液相色谱仪中进样样品后，在不同时间以不同浓度比例的第一流动相和第二流动相的混合液分别冲洗β-酪蛋白样品和β-酪蛋白标准品，根据β-酪蛋白标准品中β-酪蛋白两种不同结构样品的出峰时间，实现β-酪蛋白样品中不同结构样品的分离；

较优的，所述第一流动相为三氟乙酸水溶液，第二流动相为乙腈溶液。

较优的，所述步骤s4中，从β-酪蛋白样品中分离出的不同结构样品分别为a1型β-酪蛋白以及a2型β-酪蛋白。

较优的，所述β-酪蛋白样品的制备方法包括：

s21：取冷冻奶样，加入第一工作液，使冷冻奶样融化后振荡混匀，室温静置得混合液；

s22：将混合液离心，去除表层乳脂，得底层溶液；

s23：将底层溶液以第二工作液稀释，混匀、过滤得β-酪蛋白样品。

较优的，所述第一工作液为双-三羟甲基氨基甲烷缓冲液、盐酸胍、柠檬酸钠以及二硫苏糖醇的混合液，其中，混合液中各物质的摩尔浓度分别介于：0.05-0.15mol/l、4-8mol/l、5-8mmol/l、15-25mmol/l；

所述第二工作液的溶剂为质量浓度介于0.5-1.5g/l的三氟乙酸溶液，溶质为盐酸胍，盐酸胍的浓度介于4-6mol/l。

较优的，所述步骤s22中，相对离心力介于14000-20000g，离心时间介于2-6min，离心温度介于2-6℃。

较优的，所述步骤s21中，冷冻奶样与第一工作液的体积比为1：1。

较优的，所述步骤s23中，底层溶液与第二工作液的体积比为1：3。

较优的，所述第一流动相中，三氟乙酸的质量浓度介于0.5-1.5g/l。

较优的，所述高效液相色谱的色谱条件为：柱温介于40-50℃，吸收波长介于200-250nm，流速介于0.3-0.6ml/min，进样体积介于8-12ul。

较优的，所述步骤s4中，所用的反相色谱柱为c83.5μm150mm×4.6mm或与其性能相当的色谱柱。

为进一步了解本发明的技术方案，下面结合具体的实施例加以说明。

本发明中，选用的液相系统为rigolcws，反相色谱柱为c83.5μm，150mm×4.6mm.(zorbax300sb-c8rp，agilenttechnologies)。

液相色谱仪的自动进样器设置为4℃，自动进样器配有100μl的定量环。

仪器的各参数设定如下：

流速：0.5ml/min

柱温：45℃

吸收波长：214nm

进样体积：10μl

s1：制备β-酪蛋白标准品：

标准品为：β-caseinformbovinemilk(sigma-aldrich，lotc6905，≥98％，page)

β-酪蛋白标准液的制备方法为：精密称取酪蛋白标准品0.5g于50ml容量瓶中，配成的10g/l的标准品储备液，-20℃保存备用。

s2：制备β-酪蛋白样品；

s21：取冷冻奶样500ul，加入等体积的第一工作液，样品融化后振荡10s混匀，室温静置1h，得混合液；其中，第一工作液为0.1mol/l双-三羟甲基氨基甲烷缓冲液，6mol/l盐酸胍，5.37mmol/l柠檬酸钠，19.5mmol/l二硫苏糖醇的混合溶液；

s22：将混合液在4℃的温度下，以16000的相对离心力离心5min，去除表层乳脂，得底层溶液；

s23：将底层溶液300μl于新的离心管中，加入第二工作液(体积比为1：3)稀释，混匀、过滤得β-酪蛋白样品，其中，第二工作液为以下述第一流动相为溶液的4.5mol/l盐酸胍溶液；

s3：制备第一流动相和第二流动相：第一流动相为质量浓度为1.0g/l的三氟乙酸溶液，第二流动相为乙腈溶液；

s4：在液相色谱仪中进样样品后，不同时间以不同浓度比例的第一流动相和第二流动相的混合液分别冲洗样品和标准品，根据标准品中β-酪蛋白两种不同结构样品的出峰时间，实现β-酪蛋白样品中不同结构样品的分离。

具体实施时，第一流动相及第二流动相的混合液的洗脱时间介于20-100min，溶液体积比介于1：1-3：1。

具体实施时，通过表1所述的不同时间对应的浓度梯度来实现冲洗，其中，所述的百分比表示体积比，第一流动相和第二流动相的体积比介于1：1-3：1。

标准品在同样的液相系统操作条件以及同样的流动相浓度梯度下进行冲洗。

表1液相色谱流动相梯度表

每批样品进样前进行60min初始平衡，保证检测线和压力线均在平稳状态进样，先检测一针标准样品，再进一针空白a液进行空白清洗，确保正常的情况下进行正常样本的检测。每三个样品进行一针空白清洗，每针进完样后，进样针进行三次冲洗，每15个样品左右加一个标准品检测。

如图1-3所示，其中，图1-图2为本发明中的两个β-酪蛋白样品的液相色谱图，图3为本发明的β-酪蛋白标准品的液相色谱图，经对比，a1-β酪蛋白、a2-β酪蛋白出峰顺序为：a1-β酪蛋白、a2-β酪蛋白。

采用归一化法计算a1-β酪蛋白、a2-β酪蛋白的含量，结果显示a1与a2-β酪蛋白分离度能达到1.2，而且结果重现性好。

表2：β酪蛋白分离归一化法计算结果

本发明所能实现的有益效果是：

1、建立了一种基于高效液相色谱法对a1-β酪蛋白、a2-β酪蛋白进行分型的方法。

2、操作简单易行、方便可靠。

3、重现性好、准确度高，能实现对样品的批量检测。

虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。