一种蛋白基溶酶体荧光指示剂及其应用的制作方法

本发明属于荧光指示剂技术领域，具体涉及一种蛋白基溶酶体荧光指示剂及其应用。

背景技术：

随着生命科学的发展，细胞以及亚细胞结构已经被人们所熟知。溶酶体是存在于细胞结构中的一种单层膜的囊状细胞器，起到消化细胞内无用异物的作用，其在细胞的活动中扮演者重要的作用，所以对于溶酶体的定位与追踪，有着重要的意义。目前对于溶酶体的标记，大多是利用抗体以及荧光染料，并且已经达到商业化的程度，但是这些指示剂都有其不同的缺点，不容易改进，例如抗体的价格昂贵，并且储存条件苛刻，在使用过程中容易失活；而荧光染料大多是一些有机的小分子，这些分子对于细胞本身就有一定的毒性，而且多数染料水溶性不好，需要有机溶剂助溶，有机溶剂对于细胞的生长影响也较大，造成了荧光染料用于溶酶体指示剂的限制，并且由于溶酶体内的低pH环境，这些分子的稳定性也有很大程度的影响。所以设计并且合成具有良好的生物相容性，合成方法简单，原料价格低廉等优良性质的新型的溶酶体指示剂势在必行。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种新型的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB(BSA：牛血清白蛋白；BPB：溴酚蓝)及其应用。该指示剂制备方法简单，原料价格低廉，具有良好的水溶性和生物相容性。为实现以上目的，本发明所述的蛋白基溶酶体荧光指示剂，由如下步骤制备得到：

步骤1，分别配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚蓝水溶液；

步骤2，将牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水按照10％:10～50％:40～80％的体积百分比混合均匀，得到混合溶液；其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水的体积百分比之和为100％；将所得混合溶液在100℃水浴条件下加热2～10min，得到蛋白基溶酶体荧光指示剂胶体溶液。

本发明还提供了一种上述新型蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB在细胞溶酶体荧光标记中的应用。

与现有技术相比，本发明所述的新型蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB具有以下有益效果：

(1)合成方法简单，原料成本低廉，可大量制备。

(2)此蛋白质基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB水溶性好，在水中分散性好，不影响细胞的生长环境，适用于细胞溶酶体标记(SEM照片中样品可以看出分散性好，并且制样的样品是水溶液，也能间接说明其水溶性)。

(3)蛋白质基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB对于细胞的毒性低，生物相容性好，适合应用于细胞溶酶体标记。(图2与大肠杆菌毒性实验可以证明)。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB的扫描电子显微镜图；从图中可以看出，其分散性良好，尺寸在300nm左右。

图2为本发明实施例1制备的的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB相对于大肠杆菌的细胞毒性实验的生长曲线图；黑色为正常大肠杆菌(DH5菌)生长，灰色为在培养基中加入1mg/mL的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB后大肠杆菌的生长，从图中看，两者生长趋势相同，说明本发明实施例1制备的的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB不影响大肠杆菌的生长。

图3为本发明实施例1制备的蛋白基溶酶体指示剂BSA-BPB与商业的LysoGreen(溶酶体绿色荧光探针，KeyGEN BioTECH,Cat#:KGMP006-2)在Hela细胞中共定位的荧光共聚焦倒置显微镜的图片。(Bright：明场，lysosome：商业的溶酶体探针，BSA-BPB：溶酶体荧光指示剂BSA-BPB，Merge：重叠图像)，从图中可以看出，蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB与商业的溶酶体绿色荧光探针发光的位置几乎重叠，说明蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB具有作为溶酶体荧光探针的功能。

图4为本发明实施例1制备的蛋白基溶酶体指示剂BSA-BPB与商用溶酶体指示剂的荧光定位与BPB的荧光定位进行共定位分析后计算Pearson correlation coefficient的散点图，两者之间的Pearson correlation coefficient＝0.86，两者显著共定位，说明BPB的确是一个很好的溶酶体指示剂。

图5为不同的溴酚蓝比例制备蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB的荧光光谱，激发波长为540nm，在10～50％范围内(BSA为10％，相应调整水的比例，保证总体系100％)，该图表明，在上述原料配比情况下都可以制备出蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB。

图6为制备蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB时，100℃加热不同时间的荧光光谱，激发波长为540nm，在2～10min内，都可以制备效果优良的蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB。

具体实施方式

以下对本发明做进一步说明：

一、蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB制备与应用

实施例1：

步骤1，分别配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚蓝水溶液；

步骤2，将牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水按照10％:10％:80％的体积百分比混合均匀，得到混合溶液，其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水的体积百分比之和为100％。将所述原料混合物溶液置于水浴中，100℃加热2min(如图6所示)，得到纳米粒子胶体溶液，即蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB；

步骤3，蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB染色溶酶体的方法是在常规DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium的缩写，改良版的伊格尔培养基)中定期培养(参考文献：M.Wei,Y.Zhou,A.Sun,G.Ma,L.He,L.Zhou,S.Zhang,J.Liu,S.L.Zhang,D.L.Gill,Y.Wang,Pflugers Arch.2016,468,2061)接种在盖玻片上的HeLa细胞，然后将上述细胞在含有1mg/mL蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB的DMEM培养基中培养12小时，将细胞(Hela细胞)生长在盖玻片上，用HBSS(Hank's平衡盐溶液)洗涤盖玻片上的细胞两次并将盖玻片保持在HBSS中，激光共聚焦倒置显微镜下观察。

实施例2：

步骤1，分别配制0.1mmol/L的牛血清白蛋白水溶液和0.1mmol/L的溴酚蓝水溶液；

步骤2，将牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水按照10％:50％:40％的体积百分比混合均匀，得到混合溶液，其中，牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水的体积百分比之和为100％。将所述原料混合物溶液置于水浴中，100℃加热10min(如图6所示)，得到纳米粒子胶体溶液，即蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB；

步骤3，蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB染色溶酶体的方法是在常规DMEM培养基(dulbecco's modified eagle medium的缩写，改良版的伊格尔培养基)中定期培养(参考文献：M.Wei,Y.Zhou,A.Sun,G.Ma,L.He,L.Zhou,S.Zhang,J.Liu,S.L.Zhang,D.L.Gill,Y.Wang,Pflugers Arch.2016,468,2061)接种在盖玻片上的HeLa细胞，然后将上述细胞在含有1mg/mL蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB的DMEM培养基中培养12小时，将细胞(Hela细胞)生长在盖玻片上，用HBSS(Hank's平衡盐溶液)洗涤盖玻片上的细胞两次并将盖玻片保持在HBSS中，激光共聚焦倒置显微镜下观察。

实施例3：

改变实施例1步骤中的牛血清白蛋白水溶液、溴酚蓝水溶液和超纯水的体积比，或改变步骤2中水浴下的加热时间，均可以制备得到蛋白基溶酶体荧光指示剂BSA-BPB。其结果见图5、图6。