本发明涉及免疫比浊的检测方法，尤其涉及检测脂蛋白(a)的胶乳增强免疫比浊方法的试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：脂蛋白(a)是一种特殊独立的血浆脂蛋白，是1963年挪威遗传学家berg在研究低密度脂蛋白的遗传变异时发现的。20世纪80年代末，人们发现脂蛋白(a)与动脉粥样硬化有关。脂蛋白(a)是一种与ldl(低密度脂蛋白)结构相近的人体血清中的蛋白，密度介于hdl(高密度脂蛋白)与ldl之间。脂蛋白(a)核心部分为中性脂质和apob100分子，其外围包绕着亲水性的apoa，二者以二硫键共价连接；其中apoa是脂蛋白(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一种称为kringle的特征性结构构成，kringle由80一114个氨基酸残基组成，依靠三个内部二硫键稳定。脂蛋白(a)主要是在肝脏合成，主要的生理功能可能是阻止血管内血块溶解，病理上可促进动脉粥样硬化形成。脂蛋白水平持续升高与心绞痛、心肌梗死、脑溢血有密切关系。是脑卒中和冠心病的独立危险因子。目前，检测脂蛋白(a)的检测方法有放射免疫法(ria)、酶联免疫吸附法(elisa)、胶乳颗粒增强比浊法，ria虽然灵敏度高，但不稳定，重复性比elisa差，而且存在放射性污染的危险；elisa方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。胶乳颗粒增强比浊法(particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,petia)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。其原理是在高分子胶乳微球的表面交联单克隆或多克隆抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性,在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。此技术通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了elisa和ria方法的缺点，已越来越广泛应用于临床上各种微量蛋白的定量检测。日前，颗粒增强免疫透射比浊法广泛用于肾功能检测、心脑血管功能检测检测、糖尿病检测和脂类检测等，取得了良好的社会效益。技术实现要素：本发明的目的是提供一种检测脂蛋白(a)的胶乳增强免疫比浊试剂盒及其制备方法，它通过化学交联法把多克隆抗体标记在表面带羧基的聚苯乙烯胶乳颗粒上，具有检测灵敏度高，准确度高，精密度好，检测范围内线性好，稳定性好，生产成本低，且抗干扰性能较强的优点。本发明的目的通过以下技术方案来实现：检测脂蛋白(a)的胶乳增强免疫比浊试剂盒，特点是：包括盒体、试剂r1、试剂r2，所述试剂r1和试剂r2放置于盒体内，所述试剂r1的组分及其浓度为：tris缓冲液15-250mmol/l、氯化钠1-20g/l、聚乙二醇-600020-50g/l、叠氮钠0.5-1g/l、烷基酚聚氧乙烯醚0.5-2g/l；所述试剂r2中装有包被脂蛋白(a)单克隆抗体的乳胶悬液，试剂r2组分及其浓度为：tris缓冲液15-250mmol/l、tween-201-10ml/l、edta·2na0.5-20g/l、海藻糖10-300mg/l、叠氮钠0.5-1g/l、烷基酚聚氧乙烯醚0.5-2g/l、胶乳包被抗人脂蛋白(a)抗体0.5-2g/l。作为优选，所述试剂r1为tris缓冲液15-100mmol/l、氯化钠5-15g/l、聚乙二醇-600020-30g/l、叠氮钠0.5-1g/l。进一步地，所述试剂r1为tris缓冲液25mmol/l、氯化钠11g/l、聚乙二醇-600030g/l、叠氮钠1g/l。作为优选，所述试剂r2为tris缓冲液15-100mmol/l、tween-202-5ml/l、edta·2na0.5-5g/l、海藻糖200-300mg/l、叠氮钠0.5-1g/l。进一步地，所述试剂r2为tris缓冲液25mmol/l、tween-205ml/l、edta·2na1g/l、海藻糖300mg/l、叠氮钠1g/l。进一步地，所述的试剂r1为ph5.5-8.5。进一步地，所述的试剂r2为ph5.5-8.5。进一步地，所述试剂r1和试剂r2的体积比为4:1。进一步地，所述的试剂r1中，所述烷基酚聚氧乙烯醚用量为0.5-2g/l。进一步地，所述的试剂r2中，所述烷基酚聚氧乙烯醚用量为0.5-2g/l。进一步地，所述试剂r2中聚苯乙烯胶乳颗粒混合物的平均粒径为30-200nm。更进一步地，所述抗人脂蛋白(a)抗体为羊抗人脂蛋白(a)多克隆抗体。本发明检测脂蛋白(a)的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)制备脂蛋白(a)抗体胶乳微球的方法：在mes缓冲液中将聚苯乙烯微球与脂蛋白(a)抗体混匀，室温下搅拌偶联过夜，用清洗缓冲液进行清洗，而后加入保存缓冲液(试剂r2)得到乳胶悬液，置于4度环境下保存。2)制备试剂r1：将缓冲液，稳定剂，加速剂，防腐剂溶于纯水，得到试剂r1。更进一步地，上述的检测脂蛋白(a)的胶乳增强免疫比浊试剂盒的制备方法，在步骤1)中，聚苯乙烯微球的粒径为80-200nm；所述mes缓冲液的ph为5.8-6.0，浓度为20-100mmol/l；所述清洗缓冲液ph为7.0-8.0，清洗缓冲液的组分及其浓度为：tris缓冲液15-100mmol/l；所述保存缓冲液(试剂r2)ph为7.0-7.8，保存缓冲液(试剂r2)的组分及浓度为：tris缓冲液25mmol/l、tween-205ml/l、edta·2na1g/l、海藻糖300mg/l、叠氮钠1g/l、烷基酚聚氧乙烯醚1g/l。所述聚苯乙烯微球与脂蛋白(a)抗体混合是等体积混合。本发明技术方案突出的实质性特点和显著的进步主要体现在：通过颗粒增强的方式，放大了抗原抗体反应，弥补了普通透射比浊法灵敏度不够的缺点，同时又继承了透射比浊法稳定性好、方便快速的优点，克服了elisa和ria方法的缺点，实现人血清脂蛋白(a)在生化仪上大批量定量检测,操作简单，灵敏度高，不易受人为因素干扰，检测稳定性和重复性好，能真实反映被检测物的含量，能利用生化分析仪进行检测，容易实现自动化，适于临床推广应用。附图说明图1为本发明实施例2的脂蛋白(a)试剂盒与对照试剂盒检测样本相关性实验结果示意图。具体实施方式以下结合具体实施例进一步说明，但本发明并不仅限于这些实施例。实施例1脂蛋白(a)试剂盒的制备和使用方法1、脂蛋白(a)抗体胶乳微球的制备：用50mmol/l的mes(ph5.8)缓冲液将粒径为30-200nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含的聚苯乙烯微球的质量浓度为1％-5％的溶液；向胶乳微球溶液中，每毫升中加入0.5mgedac，室温下搅拌30min；加入等体积脂蛋白(a)抗体，室温下搅拌偶联过夜；在15000rpm/min的转速下离心40分钟，弃去上清；将沉淀置于bsa溶液(1％)中，冰浴超声悬浮；室温下搅拌封闭30分钟；在15000rpm/min的转速下离心40分钟，弃去上清；将沉淀置于50mmol/l的tris(ph7.5)缓冲液中，冰浴超声悬浮；在15000rpm/min的转速下离心40分钟，弃去上清；重复步骤7)，8)。将沉淀置于50mmol/l的r2缓冲液中，冰浴超声悬浮得成品。试剂r1：ph7.8试剂r2：ph7.8其溶剂为纯化水。全自动生化分析仪参数设置1、检测工具：日立7600型自动分析仪(a)检测温度：37℃；(b)测定方法：两点终点法；(b)检测波长：主波长600nm；(c)反应时间:10min，其中，孵育时间5min，加入试剂r2后立即测定读取吸光度al，5min后读取吸光度a2，计算吸光度变化|△a|＝|a2-a1|；(d)反应方向：正反应。2、检测步骤(a)取280ul试剂r1与5ul待测样本混匀；(b)混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min；(c)加入70ul试剂r2，立即测定读取吸光度al，5min后读取吸光度a2，计算吸光度变化|△a|＝|a2-a1|；(d)脂蛋白(a)浓度＝(△a样本/△a校准)×校准液浓度。实施例2脂蛋白(a)检测试剂盒在日立7600分析仪上各项性能指标测试。1、分析灵敏度评估采用5％牛血清白蛋白溶液作为空白样本，空白样本应不含被测物。在生化分析仪上连续检测20次，计算20次结果的均值与标准差sd。以空白均值加两倍标准差(+2sd)作为报告方法的检测限。表1测定次数均值(mg/l)sdx+2sd205.130.315.93从表1可见，本发明试剂盒灵敏度为5.93mg/l。2、线性实验评估将1份高值血清(1000mg/l)加纯水按1∶7、1∶3、1∶1、3∶1、4∶0稀释(样本顺序编号为1-5号)，制备出5个不同浓度样本，每个样本重复测定3次。从表2可看出本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到1000mg/l，判定依据r2为0.9997。表2样本号理论值(mg/l)实测值(mg/l)1125106.32250210.03500459.74750704.351000938.6从表2可看出本发明检测试剂盒的最高检测范围可达到1000mg/l，判定依据r2为0.9997。3、精密度评估使用2个不同lp(a)含量的人血清样品，测定本发明检测试剂盒的批内精密度。表3样本1样本2测定次数2020平均数260.8457.1最小值(mg/l)251.7446.5最大值(mg/l)271.7474.3标准差(sd)6.377.40变异系数(cv％)2.441.62结果表明：本发明检测试剂盒的批内精密度cv值＜5％，符合产品注册标准要求。4、准确性(回收实验)评估选择合适浓度的常规检测样本，分为体积相同的3份。在其中2份样本中加入不同量的待测物标准，制成2个不同加入浓度的回收样本，计算加入的待测物的浓度。在另一份样本中加入同样量的无被测物的溶剂，制成基础样本。对回收样本和基础样本进行3次重复测定分析，取其均值进行计算(见表4)。表4通过回收实验可以看出，本发明试剂盒测定样本准确度较好。5、相关性实验使用本发明脂蛋白a检测试剂盒和国外著名厂家的胶乳增强型脂蛋白a检测试剂盒，采用日立7600全自动生化分析仪对50份人血清(包含正常的异常标本)按各自设定的参数同时进行测定，结果见附图。两种试剂的相关系数为r2＝0.9697，结果表明本发明中的试剂盒与国外著名厂家的试剂盒测定血清标本中脂蛋白a浓度的相关性良好，测定样本结果可靠。6、干扰试验在同一份人血清样品中分别加入不同含量的干扰物质后进行测定。加入干扰物质后的测定值除以加入干扰物质前的测定值即为回收率。表5试验结果表明胆红素、血红蛋白、甘油三酯以及类风湿性因子的添加量在一定浓度以下时，对检测结果无显著干扰(以lp(a)的回收率在90％-110％之间为准)。(见表5)。本发明的优点和有益效果：1、本发明的试剂盒具有检测简单而快速、灵敏度高、准确性好、抗干扰能力强及生产成本低的优点；2、本发明采用的lp(a)检测方法为胶乳增强免疫比浊法，该方法使得lp(a)的检测更为经济、方便和快速，适用于绝大多数医院的全自动生化分析仪，特别是对急诊能实现快速定量检测。以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12