本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种抑制类风湿因子干扰的d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂。
背景技术：
d-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子xiii交联后，再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物，是一个特异性的纤溶过程标记物。d-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块。血浆d-二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。样本中d-二聚体与结合在胶乳颗粒上的相应抗体(鼠抗人d-二聚体单克隆抗体)在液相中相遇，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度，与通过同样处理的校准品比较，即可计算出样本中d-二聚体含量。
d-二聚体主要反映纤维蛋白溶解功能。增高或阳性见于继发性纤维蛋白溶解功能亢进，如高凝状态、弥散性血管内凝血、肾脏疾病、器官移植排斥反应、溶栓治疗等。只要机体血管内有活化的血栓形成及纤维溶解活动，d-二聚体就会升高。心肌梗死、脑梗死、肺栓塞、静脉血栓形成、手术、肿瘤、弥漫性血管内凝血、感染及组织坏死等均可导致d-二聚体升高。特别对老年人及住院患者，因患菌血症等病易引起凝血异常而导致d-二聚体升高。因此，d-二聚体检测最主要的临床价值是用于排除静脉血栓性疾病(如dvt和pe等)；d-二聚体可作为血栓性疾病溶栓治疗的特异性监测指标。在弥散性血管内凝血、重症肝炎等疾病中升高，也可作为溶栓治疗有效的观察指标。常用的检测方法有胶乳凝集法、酶联免疫吸附法(elisa)、自身红细胞凝集法、胶体金显色层析法、胶乳免疫比浊法。
胶乳增强免疫比浊法常规检测的一个限制是易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰。类风湿因子(rheumatoidfactor,rf)是在类风湿性关节炎(ra)病人血清中发现，是一种以变性igg为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性igg的抗体，属igm型。可与iggfc段结合。ra病人和约50％的健康人体内都存在有产生rf的b细胞克隆，在变性igg(或与抗原结合的igg)或eb病毒直接作用下，可大量合成rf。在商业免疫类检测试剂中所采用的抗体大多是动物来源的igg类抗体，fc段与人igg的fc段具有较高的同源性，能被rf识别并结合，所以在待测物质为阴性、rf阳性的检测样本中，免疫检测试剂有可能被rf捕获产生信号，从而导致假阳性结果。
目前在现有的免疫检测试剂研制中，减少类风湿因子或异嗜性干扰的方法通常有：(1)从样品中去除干扰性的免疫球蛋白或使其失活。比如使用igg固相吸附剂吸附样本中的类风湿因子，或使用含有2-巯基乙醇的稀释液稀释样本，以降解igm型类风湿因子，但这会使检测操作复杂化，并且有可能在去除干扰蛋白的同时也减少了待测物质的含量或活性。(2)使用减少干扰的封闭剂，大多为igg，市场上有许多商品化的封闭剂。但由于类风湿因子或异嗜性抗体的多样化，以及各种产品所使用的抗体不同，目前尚未有一种产品可以有效消除所有干扰，通常需要使用不同产品进行组合、筛选，不但增加工作量、挺高试剂成本，另一方面由于使用多种不明成分的封闭剂，也不可控制地引入新的干扰检测结果的因素。(3)修饰测定抗体以使其更不易与类风湿因子反应。目前最常使用的一种方法是将检测igg抗体酶切去除fc片段，用f(ab’)2替代完整的igg，既保留其识别结合抗体的活性，又消除fc的干扰，减少试剂的非特异性反应。但在igg的酶切、纯化制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，提高试剂成本，更重要的是试剂制备过程进一步复杂，对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍，从而限制了此类试剂在临床上的推广。
现有的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，一般包括试剂1和试剂2，试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液，试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒组成简单，针对胶乳增强免疫比浊试剂具有广泛的通用性，可以有效地消除类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性。
本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的d-二聚体胶乳增强免疫比浊试剂，它包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，所述试剂2为包被有抗体致敏的胶乳颗粒分散液，所述试剂1中包含1-40g/l的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，优选地为5-30g/l、10-20g/l、10-30g/l或20-40g/l的n-羟基琥珀酰亚胺。在一些实施方式中，试剂1中n-羟基琥珀酰亚胺的量可以是1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、21g/l、22g/l、23g/l、24g/l、25g/l、26g/l、27g/l、28g/l、29g/l、30g/l、31g/l、32g/l、33g/l、34g/l、35g/l、36g/l、37g/l、38g/l、39g/l或40g/l。
在一种实施方式中，所述试剂1中包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂、促凝剂和igm抗体；和所述试剂2中包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂、封闭剂和稳定剂。
缓冲液可以为本领域中常规使用的缓冲溶液。在一些实施方式中，所述缓冲溶液可以各自独立地为mops、good's缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液以及其任意组合。
在一些实施方式中，所述促凝剂是聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯吡络烷酮中的任一种或其组合。通过在d-二聚体检测试剂盒加入促凝剂，使得d-二聚体检测试剂盒不仅可以促进抗原抗体的结合，使其快速形成复合物，又能抑制免疫复合物的解离，使沉淀出现快，提高了检测的速度；而且还不会因此而扩大非特异性范围，使得d-二聚体检测试剂盒保持一个宽的线性范围。另外，促凝剂可将d-二聚体抗体固定在乳胶微粒上，可特异性的增强浊度的变化，从而提高试剂盒的检测灵敏度。
在一些实施方式中，所述生物防腐剂可以为二氯乙酰胺、咪唑烷基脲、生物防腐剂proclin系列、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金酯等或其任意组合。
在一些实施方式中，所述表面活性剂可以是可以为tween、span、triton、emulgen系列表面活性剂，例如吐温20、吐温40、tx100、表面活性剂709等等。
封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-cooh位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂2中封闭剂可以是各种蛋白质，优选bsa蛋白作为封闭剂。
稳定剂的主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等。在一些实施方式中，稳定剂为糖类，例如蔗糖或海藻糖。
在一种实施方式中，述试剂1中包括25-200mmol/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-4g/l聚乙烯吡络烷酮、0.5-200mg/l抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin950和1-20g/l的表面活性剂709。。
在一些实施方式中，试剂1中磷酸盐缓冲液浓度可以为25-100mmol/l或100-200mmol/l。在一些实施方式中，试剂1中氯化钠的量是0.9-30g/l、30-120g/l、30-60g/l或60-80g/l。在一些实施方式中，试剂1中抗人igm抗体的量是0.5-50mg/l、50-100mg/l、100-200mg/l或50-200mg/l。在一些实施方式中，试剂1中生物防腐剂的量是0.1-1g/l、1-3g/l、或1-5g/l。在一些实施方式中，试剂1中促凝剂的量是0.5-1g/l、1-2g/l、或2-4g/l。在一些实施方式中，试剂1表面活性剂的量是1-3g/l、1.5-3g/l、1.5-20g/l或3-20g/l。
在一种实施方式中，所述试剂1中包括100mmol/l磷酸盐缓冲液、60g/l的氯化钠、50mg/l抗人igm抗体、0.5g/l生物防腐剂proclin950和10g/l的表面活性剂709。
在一种实施方式中，所述试剂2中包括20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-10g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂709、1-10g/l牛血清白蛋白、1-300g/l山梨醇和0.2-5g/l的抗体致敏的胶乳颗粒。
在一些实施方式中，试剂2中甘氨酸缓冲液浓度可以为20-50mmol/l、50-200mmol/l或100-200mmol/l。
在一些实施方式中，试剂2中稳定剂的量是1-3g/l、1-150g/l、3-150g/l、150-200g/l或200-300g/l。在一些实施方式中，试剂2中生物防腐剂的量是0.1-1g/l、1-3g/l、或1-5g/l。在一些实施方式中，试剂2中表面活性剂剂的量是1-3g/l、1.5-3g/l、1.5-20g/l或3-20g/l。在一些实施方式中，试剂2中封闭剂的量是1-2g/l、1-3g/l、2-5g/l、3-5g/l或5-10g/l。在一些实施方式中，试剂2中抗体致敏的胶乳颗粒的浓度为0.2-0.5g/l或0.5-5g/l。
在一种实施方式中，所述试剂2中包括50mmol/l甘氨酸缓冲液、5g/l的生物防腐剂proclin300、2g/l的表面活性剂709、5g/l牛血清白蛋白、20g/l山梨醇和1g/l的抗体致敏的胶乳颗粒。
在一种实施方式中，所述胶乳增强免疫比浊试剂盒致敏胶乳上包被的是动物抗人igg多克隆或单克隆抗体。
在一种实施方式中，所述动物的种属包括兔、山羊、绵羊、鸡和鼠。
在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒的应用，样品的体积与试剂的体积比为1:10-1:150；样品是血清或血浆。
本发明采用在试剂1中添加nhs，加入nhs后，样品中rf因子与抗人igg结合的能力减低，而标记抗体与待测抗原的结合能力不受影响。加入促凝剂后，与nhs相结合进一步增强了抗rf因子干扰的能力。此外，试剂1中的抗人igm抗体，能够与减活后的rf因子结合，从而彻底消除rf因子对测定结果的干扰。因此，本发明的试剂盒能够提高检测结果的特异性和准确性；另外本试剂盒组成简单，具有较高的灵敏度，具有广泛的通用性。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
实施例一:含有不同nhs量的d-二聚体测定试剂实验
1.含有不同nhs量的d-二聚体测定试剂1
d-二聚体测定试剂1-a：100mmol/l磷酸盐缓冲液，60g/l的氯化钠，50mg/l鼠igg,0g/lnhs，生物防腐剂proclin9500.5g/l，表面活性剂70910g/l，0g/lnhs；
d-二聚体测定试剂1-b、c、d、e、f、g、h和i中各组分与试剂1-a相同，除了nhs浓度不同，它们分别为1g/lnhs、5g/lnhs、10g/lnhs、20g/lnhs、30g/lnhs、40g/lnhs、45g/lnhs和50g/lnhs。
2.d-二聚体测定试剂2：50mmol/l甘氨酸缓冲液，1g/l抗人d-二聚体单克隆抗体致敏的胶乳颗粒，5g/l生物防腐剂proclin300，2g/l表面活性剂709，5g/l牛血清白蛋白，200g/l山梨醇。
3.含有不同类风湿因子含量的d-二聚体样本制备：在含有1.53g/l的d-二聚体纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的九种d-二聚体测定试剂(1-a，1-b，1-c，1-d，1-e，1-f，1-g，1-h，1-i，各试剂的nhs量不同)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的d-二聚体样本进行检测。
表1：d-二聚体测定试剂盒试验结果
以上数据可知：试剂1中无nhs时，测定结果明显随着rf因子含量增加而升高，由最初的1.53mg/l升高到4.25mg/l，试剂1中添加nhs可以明显减少rf因子的干扰，当nhs含量为20g/l时，rf因子对测定结果影响基本没有。但当nhs量逐渐增加到45g/l、50g/l时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。
实施例二:含有不同促凝剂的d-二聚体测定试剂实验
1.含有不同促凝剂的d-二聚体测定试剂1
d-二聚体测定试剂2-a：100mmol/l磷酸盐缓冲液，60g/l的氯化钠，50mg/l鼠igg，0.5g/l生物防腐剂proclin950，10g/l表面活性剂709，10g/lnhs；
d-二聚体测定试剂2-b、c、d和e中各组分与试剂2-a相同，除了加入促凝剂不同，它们分别为1g/l聚乙二醇4000、1g/l聚乙二醇6000、1g/l聚乙二醇8000和1g/l聚乙烯吡络烷酮。
2.d-二聚体测定试剂2：50mmol/l甘氨酸缓冲液，1g/l抗人d-二聚体单克隆抗体致敏的胶乳颗粒，5g/l生物防腐剂proclin300，2g/l表面活性剂709，5g/l牛血清白蛋白，200g/l山梨醇。
3.含有不同类风湿因子含量的d-二聚体样本制备：在含有1.53g/l的d-二聚体纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的五种d-二聚体测定试剂(2-a，2-b，2-c，2-d，2-e)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的d-二聚体样本进行检测。
表2：d-二聚体测定试剂盒试验结果
以上数据可知：当加入促凝剂聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙烯吡络烷酮后，测定结果显示加入促凝剂的b/c/d/e组的结果由于没有加入促凝剂的a组，消除rf因子干扰的效果更好，说明在试剂1中同时加入了nhs和促凝剂后消除rf因子干扰的效果比单独加入nhs的效果更好；另外，在不同的促凝剂聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙烯吡络烷酮之间，不同分子量之间的聚乙二醇效果差别不大，而聚乙烯吡络烷酮的效果最好。
实施例三:含有不同浓度促凝剂的d-二聚体测定试剂实验
1.含有不同促凝剂的d-二聚体测定试剂1
d-二聚体测定试剂3-a：100mmol/l磷酸盐缓冲液，60g/l的氯化钠，50mg/l鼠igg,0g/lnhs，0.5g/l生物防腐剂proclin950，10g/l表面活性剂709，10g/lnhs，1g/l聚乙烯吡络烷酮；
d-二聚体测定试剂3-b、c、d、e、f中各组分与试剂3-a相同，除了加入促凝剂浓度不同，它们分别为0.1、0.5、2、4和8g/l聚乙烯吡络烷酮。
2.d-二聚体测定试剂2：50mmol/l甘氨酸缓冲液，1g/l抗人d-二聚体单克隆抗体致敏的胶乳颗粒，5g/l生物防腐剂proclin300，2g/l表面活性剂709，5g/l牛血清白蛋白，200g/l山梨醇。
3.含有不同类风湿因子含量的d-二聚体样本制备：在含有1.53g/l的d-二聚体纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的六种d-二聚体测定试剂(3-a，3-b，3-c，3-d，3-e，3-f)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的d-二聚体样本进行检测。
表3：d-二聚体测定试剂盒试验结果
以上数据可知：当加入不同浓度的聚乙烯吡络烷酮后，在0.1-8mg/l的浓度范围中，在0.5-4mg/l范围内测定结果效果更好，说明在试剂1中同时加入了nhs和0.5-4mg/l促凝剂聚乙烯吡络烷酮后消除rf因子干扰的效果比单独加入nhs的效果更好。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。