本发明属于废水处理领域，具体是一种酚类化合物对硝化细菌电子传递体系影响的检测方法。
背景技术：
目前我国能源的基本格局为“富煤、少油、有气”，为了满足了人们益增长的物质需要，种类繁多的化工产品依赖煤化工被大量的生产出来，因此在我国工业发展中煤化工占很大比例。当前国内煤化工行业在为我们带来洁净能源的同时，也造成了严重的环境污染，尤其是生产过程排出废水对环境的恶劣影响，对社会的可持续发展造成了严重威胁。煤化工生产过程中排放的废水成分复杂，属难生化降解的高浓度工业废水，其中所含的酚类化合物由于其特有的化学结构通过生物的外表皮或呼吸系统进入到体内，对其周围生活的人群和动、植物都有严重的危害作用。
硝化细菌较异养细菌对有毒有害物质更加敏感，硝化细菌一旦受到有毒有害物质抑制以后，很难在短期内恢复到正常的水平，由于硝化细菌世代时间比较漫长，硝化活性的恢复是一个比较缓慢的过程，虽然在工程领域采用增加污泥龄的方法来增加硝化细菌的数量，但研究表明硝化反应的抑制作用很难通过控制污泥龄被解除。酚类化合物通过与硝化细菌酶的活性中心或非活性中心结合使其失去活性,从而影响硝化反应的效果。脱氢酶能使被氧化有机质的氢原子活化并通过污泥的电子传递体系(electrontransportsystem,ets)传递给特定的受氢体,由此通过脱氢酶活性便可间接指示活性污泥的生物活性。用于检测污泥ets活性的氧化还原染料是氯化三苯基四氮唑(2,3,5～triphenyltetrazoliumchloride,ttc),它常作为一种人工电子受体,在微生物电子传递体系的作用下接受电子而被还原,并发生明显的颜色变化,无色ttc受氢后变为红色的三苯甲基(tf)。tf的生成量直接反映了ets的活性。通过监测硝化过程中ttc-ets活性变化,及时有效地反映硝化反应进程。因此,通过ttc-ets活性分析,能够间接衡量酚类化合物对硝化细菌的抑制作用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种酚类化合物对硝化细菌电子传递体系影响的检测方法。通过测定加入酚类化合物后富集了硝化细菌污泥ttc～ets的活性反映酚类化合物对污泥电子传递体系的抑制作用，通过计算酚类化合物对污泥的半数效应浓度，更加科学地分析其抑制效应。
本发明的技术方案为：一种酚类化合物对硝化细菌电子传递体系(ets)影响的检测方法，具体步骤如下：
(1)在sbr装置中进行硝化细菌的富集培养，培养期间控制反应器内的温度在(28.0±0.5)℃，溶解氧质量浓度4～5mg/l，ph在7.5-8.5，培养20～30天后硝化细菌达到微生物总量的95％以上，污泥浓度控制在2500～3000mg/l；然后静置浓缩；
(2)取适量富集培养硝化细菌的污泥于锥形瓶中，向其投加不同质量的酚类化合物，控制酚类化合物质量浓度为0～100mg/l，根据不同酚类化合物设定不同的浓度梯度；
(3)取洁净的培养皿烘干至恒重，记录质量w1；从锥形瓶取适量v0污泥于培养皿再烘干至恒重，记录质量w2，计算每毫升污泥干重为a(mg/ml)
(4)再重新从各锥形瓶中取等体积污泥v1ml于10ml离心管中，向离心管中加入tris-hcl缓冲液、亚硫酸钠溶液和ttc溶液；
(5)将制备完成的样品放在(37±1)℃的恒温水浴振荡器中，避光暗处振荡培养25min～35min；
(6)当达到培养时间时，向离心管中加入甲醛溶液终止反应，然后将样品放入离心机离心；
(7)离心后，用滴管吸尽上清液；
(8)向各离心管中加入无水乙醇做萃取剂，混合振荡均匀，在(37±1)℃下恒温水浴振荡器中充分萃取；
(9)待充分萃取后，用0.45μm滤膜过滤样品，使用紫外可见光分光光度计在485nm波长下测定滤液的吸光度(d485)；
(10)取ttc的还原产物tf溶于无水乙醇中，设定0～20ug/ml的系列标准溶液，使用紫外—可见光分光光度计波长在485nm处测量tf系列标准溶液吸光度，将tf质量浓度(ug/ml)和吸光度(d485)进行线性回归分析，得到tf标准曲线及其斜率k；
(11)酚类化合物不同浓度下，硝化细菌电子传递体系活性的计算公式如下：
式中，etst：污泥电子传递体系活性,μg/(mg·h)；v：萃取剂体积，ml；d485：485nm波长下滤液的吸光度；k：tf溶液标准曲线斜率；a·v1：总污泥干重，mg；t：培养时间，h；
(12)根据系列etst值用logistic方程(2式)拟合计算苯二酚类的半数效应浓度(ec50)来定量表征其对硝化污泥的毒性，实验数据用origin软件进行处理。
etst：污泥电子传递体系活性,μg/(mg·h)；a：常数，其含义为未加有毒物质时的空白对照组的tf的值，实验所得；x：苯二酚的质量浓度，mg/l；x0：ec50值,mg/l；b：经验系数，为常数，方程拟合所得。
本发明利用常规的sbr装置采用人工模拟废水对硝化细菌进行富集培养，富集培养基为：nh4hn03、nap04、nahc03，微量元素nacl、mgs04·7h20、cacl2、kcl.该装置包括气体流量计、微孔曝气器、电动搅拌器、溶解氧测量器、温度控制器、时间控制器、进出水口和排泥口。
优选步骤(1)静置浓缩为控制污泥浓度为5000～6000mg/l。
优选步骤(4)污泥体积v1为离心管体积的0.3～0.6倍；加入tris-hcl缓冲液调节样品的ph在7.5～8.0；加入亚硫酸钠溶液溶液体积为v1的0.125～0.2倍；加入ttc溶液体积为v1的0.25～0.3倍；其中亚硫酸钠溶液的质量浓度为0.36％，ttc溶液的质量浓度为0.4％。
优选步骤(6)中所述的离心转速为3500～4500r/min；离心的时间为3～6min；所述的甲醛溶液的质量浓度为37％。
优选步骤(8)中恒温振荡萃取时间为50min～75min
优选酚类化合物以对苯二酚、邻苯二酚或间苯二酚等苯二酚为基准。
有益效果：
1、利用sbr装置进行硝化细菌的富集培养，在培养3-4周以后可使硝化细菌达到微生物总量的95％；
2、此方法可以确定酚类化合物对硝化细菌的半数效应浓度，为废水处理工艺提供合理的依据；
具体实施方式
实施例1：
培养期间控制sbr反应器内的温度在27.5℃，溶解氧质量浓度4mg/l，ph在7.5，培养20天后从反应器中取出适量污泥，测量污泥浓度为2515mg/l，硝化细菌达到微生物总量的95％以上，静置30min后倾去部分上清液，使混合液体积缩小1倍。取6个250ml锥形瓶，将浓缩后的污泥搅拌均匀，加入到各锥形瓶中。称取6份不同质量的对苯二酚加入不同锥形瓶中并留有空白对照，取20ml污泥于培养皿中烘干至横重，计算每毫升污泥干重为5.03mg/ml。将锥形瓶放入恒温水浴振荡器中，在36℃下恒温振荡使污泥与对苯二酚充分混合。从锥形瓶中各取4ml污泥于10ml离心管中，加入1mltris～hcl缓冲液，调节ph值为7.5，0.5ml0.36％亚硫酸钠溶液，避光条件下加入1ml0.4％ttc溶液，迅速将离心管放入恒温水浴振荡器中在36℃下振荡35min。当达到培养时间时，向离心管中加入1ml37％的甲醛溶液终止反应，然后将样品放入离心机中以3500r/min的转速离心6min。待离心结束后用滴管吸尽上清液。向各离心管中加入7ml无水乙醇，摇匀后放入恒温水浴振荡器中36℃下恒温振荡75min，待充分萃取后取出使用紫外可见光分光光度计在485nm波长下测定吸光度(d485)，计算ttc-ets值并用logistic方程拟合抑制剂浓度与对应吸光度，得出ec50(半数效应浓度)
表1不同对苯二酚浓度下ttc-ets值
实施例2：
培养期间控制sbr反应器内的温度在28.0℃，溶解氧质量浓度4.5mg/l，ph在8，培养25天后从反应器中取出适量污泥，测量污泥浓度为2650mg/l，硝化细菌达到微生物总量的95％以上，静置30min后倾去部分上清液，使混合液体积缩小1倍。取6个250ml锥形瓶，将浓缩后的污泥搅拌均匀，加入到各锥形瓶中。称取6份不同质量的对苯二酚加入不同锥形瓶中并留有空白对照，取10ml污泥于培养皿中烘干至横重，计算每毫升污泥干重为5.3mg/ml。将锥形瓶放入恒温水浴振荡器中，在37℃下恒温振荡使污泥与对苯二酚充分混合。从锥形瓶中各取5ml污泥于10ml离心管中，加入1.2mltris～hcl缓冲液，调节ph值为8，0.8ml0.36％亚硫酸钠溶液，避光条件下加入1.2ml0.4％ttc溶液，迅速将离心管放入恒温水浴振荡器中在37℃下振荡30min。当达到培养时间时，向离心管中加入1ml37％的甲醛溶液终止反应，然后将样品放入离心机中以4000r/min的转速离心5min。待离心结束后用滴管吸尽上清液。向各离心管中加入6.5ml无水乙醇，摇匀后放入恒温水浴振荡器中37℃下恒温振荡60min，待充分萃取后取出使用紫外可见光分光光度计在485nm波长下测定吸光度(d485)，计算ttc-ets值并用logistic方程拟合抑制剂浓度与对应吸光度，得出ec50(半数效应浓度)
表2不同对邻二酚浓度下ttc-ets值
实施例3：
培养期间控制sbr反应器内的温度在28.5℃，溶解氧质量浓度5mg/l，ph在8.5，培养30天后从反应器中取出适量污泥，测量污泥浓度为2885mg/l，硝化细菌达到微生物总量的95％以上，静置30min后倾去部分上清液，使混合液体积缩小1倍。取6个250ml锥形瓶，将浓缩后的污泥搅拌均匀，加入到各锥形瓶中。称取6份不同质量的对苯二酚加入不同锥形瓶中并留有空白对照，取15ml污泥于培养皿中烘干至横重，计算每毫升污泥干重为5.7mg/ml。将锥形瓶放入恒温水浴振荡器中，在38℃下恒温振荡使污泥与对苯二酚充分混合。从锥形瓶中各取6ml污泥于10ml离心管中，加入1.3mltris～hcl缓冲液，调节ph值为8，1.2ml0.36％亚硫酸钠溶液，避光条件下加入1.4ml0.4％ttc溶液，迅速将离心管放入恒温水浴振荡器中在38℃下振荡25min。当达到培养时间时，向离心管中加入1ml37％的甲醛溶液终止反应，然后将样品放入离心机中以4500r/min的转速离心4min。待离心结束后用滴管吸尽上清液。向各离心管中加入6ml无水乙醇，摇匀后放入恒温水浴振荡器中38℃下恒温振荡50min，待充分萃取后取出使用紫外可见光分光光度计在485nm波长下测定吸光度(d485)，计算ttc-ets值并用logistic方程拟合抑制剂浓度与对应吸光度，得出ec50(半数效应浓度)。
表3不同间苯二酚浓度下ttc-ets值