本发明涉及检测技术领域，尤其涉及一种超高效液相色谱串联质谱法同时测定罂粟壳生物碱和工业染料的方法。
背景技术：
小吃类食品是一类具有显著地方特色的食品的总称，不仅仅是作为早点、夜宵，也可以是正餐或者宴席间的点缀，是相当一部分人生活中不可或缺的美食之一；而火锅则一直风靡全国，广受大众的喜爱。正由于此，部分食品加工者罔顾国家法律、法规和人民身体健康，恣意添加罂粟壳和工业染料以使食品“更好看、更好吃”，从而吸引回头客，增加销量，谋取私利，也使得火锅底料和小吃类食品成为这两类违法添加的重灾区。
罂粟壳含有吗啡、可待因、那可丁、罂粟碱等30多种生物碱，人们一次食用添加了罂粟壳的食品，就会在体内检出吗啡等毒物，造成征兵等体检过不了关，长期食用将对神经系统、消化系统造成损害，并出现内分泌失调等症状，甚至上瘾。工业染料包括苏丹红、玫瑰红b(罗丹明b)、酸性橙ⅱ等，主要用在毛皮、锦纶、纸张等工业用品的染色上，大都具有致癌或致畸性。所以，我国于2009年发布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》，明令禁止罂粟壳和苏丹红、王金黄(主要成分为碱性橙ⅱ)、玫瑰红b(即罗丹明b)、碱性嫩黄、酸性橙ⅱ、碱性黄等工业染料应用于食品加工，其中罂粟壳标注了可能添加的主要食品品种有火锅底料及小吃类，苏丹红等工业染料可能添加的主要食品品种有含辣椒类的食品、腐皮、调味品、腌卤肉制品等。
为防止及有效监控罂粟壳生物碱和工业染料在食品中的违法添加，必需建立快速准确的同时检测罂粟壳生物碱和工业染料的方法,以保障食品安全及消费者健康。罂粟壳生物碱的检测主要有薄层色谱法、示波极谱法、免疫层析法、液相色谱法、气相色谱法、液相色谱质谱联用法；食品中工业染料的检测方法主要有液相色谱法、气相色谱-质谱法、液相色谱-串联质谱法。我国针对食品中罂粟壳生物碱和工业染料分别颁布了相关的检测标准，但这些标准不够系统，特别是工业染料的检测多为单一品种，且有一些方法步骤较为复杂，缺乏同时检测食品中罂粟壳生物碱和工业染料的方法
本发明人考虑，采用乙腈溶液提取目标物，超高效液相色谱串联质谱仪检测，建立了同时测定小吃类食品及火锅底料中5种罂粟壳生物碱和6种工业染料的方法。
技术实现要素：
本发明解决的技术问题在于提供一种超高效液相色谱串联质谱法同时测定小吃类食品及火锅底料中5种罂粟壳生物碱和6种工业染料的方法，该方法准确、灵敏、快速。
有鉴于此，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱法同时测定食品中5种罂粟壳生物碱和6种工业染料的方法，包括以下步骤：步骤a)将试样置于离心管中，加入水和乙腈混匀，然后加入无水醋酸钠，立即摇匀，再涡旋震荡1-3min，以10000r/min离心3-8min，温度为3-5℃,取上清液过无水硫酸镁，滤液于35-45℃下旋转蒸发浓缩至干，加入1-3ml乙腈与0.1％甲酸水的混合溶液溶解残渣，溶液全部转移到离心管中，以4000r/min离心1-3min，过0.22μm滤膜，所述乙腈与甲酸水的体积比为95:5；步骤b)利用超高效液相色谱串联质谱法对步骤a处理后的试样进行分析，同时检测试样中的罂粟壳生物碱和工业染料的种类和含量。
作为优选方案，所述5种罂粟壳生物碱为罂粟碱、吗啡、可待因、那可丁、蒂巴因。
作为优选方案，所述6种工业染料为苏丹红ⅳ、罗丹明-b、酸性橙ⅱ、碱性橙ⅱ、碱性黄1，碱性嫩黄o。
作为优选方案，步骤a中，水和乙腈的体积比为1：5。
作为优选方案，步骤a中，所述试样、无水醋酸钠和无水硫酸镁的质量比为2:1.5:6。
作为优选方案，标准溶液按照如下方法制备：分别称取适量标准物质，用乙腈或乙腈水溶解并用乙腈定容，配制成100mg/l的单标储备液，再将其配制成10mg/l的混合标准溶液，使用前逐级稀释。
作为优选方案，步骤b中，液相色谱条件为：色谱柱：sb-c18rrhd1.8μm，2.1mm×50mm；柱温：35℃；进样量：2μl；流动相：a为甲醇，b为0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：0-4min，5％a，流速0.2ml/min；4.5-7min，60％-95％a，流速0.3ml/min-0.4ml/min；7.1-11min，95％a，流速0.5ml/min；11.5-15min，5％a，流速0.2ml/min。
作为优选方案，步骤b中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源，酸性橙ⅱ采用负离子模式，其余均采用正离子模式，正负离子同时采集；离子源温度550℃，气帘气35psi，雾化气55psi，加热辅助气55psi，碰撞气：medium，离子源喷雾电压5500v(-4500v)；扫描方式：多反应监测。
作为优选方案，步骤b中，5种罂粟壳生物碱和6种工业染料质谱参数如表1所示：
表15种罂粟壳生物碱和6种工业染料质谱参数
作为优选方案，5种罂粟壳生物碱和6种工业染料在2.5～100μg/l的浓度范围内，具有良好的线性关系。
本发明利用超高效液相色谱串联质谱法(uplc-ms/ms)同时测定小吃类食品及火锅底料中5种罂粟壳生物碱和6种工业染料。样品采用乙腈溶液提取，乙腈层经无水硫酸镁脱水后旋转蒸发浓缩至干，用乙腈、甲酸水溶解残渣，样液过膜，利用超高效液相色谱串联质谱法检测，外标法定量。5种罂粟壳生物碱和6种工业染料在2.5～100μg/l的浓度范围内，具有良好的线性关系(相关系数均大于0.9980)，在3个添加水平下样品的平均回收率为72.2％～108％，相对标准偏差2.5～9.6％，方法检出限罂粟碱、那可丁、蒂巴因、玫瑰红b、酸性橙ⅱ、碱性嫩黄o、碱性黄1为1.0μg/kg，吗啡、可待因、碱性橙ⅱ、苏丹红ⅳ为2.5μg/kg。实际样品检测中，检出酸性橙ⅱ阳性样品3个，含量为0.0159～74.2mg/kg。该方法准确、灵敏、快速，是同时检测小吃类食品和火锅底料中罂粟壳生物碱和工业染料的有效方法。。
附图说明
图1为空白火锅底料中添加10μg/kg的吗啡的多反应监测色谱图；
图2为空白火锅底料中添加10μg/kg的可待因的多反应监测色谱图；
图3为空白火锅底料中添加10μg/kg的蒂巴因的多反应监测色谱图；
图4为空白火锅底料中添加10μg/kg的罂粟碱的多反应监测色谱图；
图5为空白火锅底料中添加10μg/kg的酸性橙ⅱ的多反应监测色谱图；
图6为空白火锅底料中添加10μg/kg的那可丁的多反应监测色谱图；
图7为空白火锅底料中添加10μg/kg的碱性嫩黄o的多反应监测色谱图；
图8为空白火锅底料中添加10μg/kg的碱性黄1的多反应监测色谱图；
图9为空白火锅底料中添加10μg/kg的碱性橙ⅱ的多反应监测色谱图；
图10为空白火锅底料中添加10μg/kg的罗丹明-b的多反应监测色谱图；
图11为空白火锅底料中添加10μg/kg的苏丹红ⅳ的多反应监测色谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明实施例公开了一种超高效液相色谱串联质谱法同时测定食品中5种罂粟壳生物碱和6种工业染料的方法，包括以下步骤：步骤a)将试样置于离心管中，加入水和乙腈混匀，然后加入无水醋酸钠，立即摇匀，再涡旋震荡1-3min，以10000r/min离心3-8min，温度为3-5℃，取上清液过无水硫酸镁，滤液于35-45℃下旋转蒸发浓缩至干，加入1-3ml乙腈与0.1％甲酸水的混合溶液溶解残渣，溶液全部转移到离心管中，以4000r/min离心1-3min，过0.22μm滤膜，所述乙腈与甲酸水的体积比为95:5；步骤b)利用超高效液相色谱串联质谱法对步骤a处理后的试样进行分析，同时检测试样中的罂粟壳生物碱和工业染料的种类和含量。
作为优选方案，所述5种罂粟壳生物碱为罂粟碱、吗啡、可待因、那可丁、蒂巴因；所述6种工业染料为苏丹红ⅳ、罗丹明-b、酸性橙ⅱ、碱性橙ⅱ、碱性黄1，碱性嫩黄o。
作为优选方案，步骤a中，水和乙腈的体积比为1：5，所述试样、无水醋酸钠和无水硫酸镁的质量比为2:1.5:6。
作为优选方案，标准溶液按照如下方法制备：分别称取适量标准物质，用乙腈或乙腈水溶解并用乙腈定容，配制成100mg/l的单标储备液，再将其配制成10mg/l的混合标准溶液，使用前逐级稀释。
作为优选方案，步骤b中，液相色谱条件为：色谱柱：sb-c18rrhd1.8μm，2.1mm×50mm；柱温：35℃；进样量：2μl；流动相：a为甲醇，b为0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：0-4min，5％a，流速0.2ml/min；4.5-7min，60％-95％a，流速0.3ml/min-0.4ml/min；7.1-11min，95％a，流速0.5ml/min；11.5-15min，5％a，流速0.2ml/min。
步骤b中，质谱条件为：离子源：电喷雾离子源，酸性橙ⅱ采用负离子模式，其余均采用正离子模式，正负离子同时采集；离子源温度550℃，气帘气35psi，雾化气55psi，加热辅助气55psi，碰撞气：medium，离子源喷雾电压5500v(-4500v)；扫描方式：多反应监测。
5种罂粟壳生物碱和6种工业染料在2.5～100μg/l的浓度范围内，具有良好的线性关系。
从以上方案可以看出,本发明采用乙腈溶液提取目标物，超高效液相色谱串联质谱仪测定，前处理不需采用spe小柱净化，简捷快速，且灵敏度高、准确度和精密度好，是同时检测小吃类食品和火锅底料中的罂粟壳生物碱和工业染料的有效方法。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
本发明实施例采用的原料均为市购。
实施例
1.1仪器与试剂
超高效液相色谱串联质谱仪(aglient1290–absciexqtrap5500，absciex公司)；高速冷冻离心机(sigma3-18ks,sigma公司)；涡旋震荡仪(ms3b,ika公司)；旋转蒸发仪(dpe-2120,eyela公司)。
罂粟碱、吗啡、可待因、那可丁、蒂巴因、苏丹红ⅳ、罗丹明-b、酸性橙ⅱ、碱性橙ⅱ、碱性黄1(纯度均>95％，dr.e公司)，碱性嫩黄o(纯度为81.0％，achemtek公司)。
甲醇、乙腈、甲酸(色谱纯，cnwtechnologiesgmbh)，乙腈(分析纯，西陇科学公司)，无水乙酸钠(分析纯，国药集团),无水硫酸镁(分析纯，cnwtechnologiesgmbh)，水为超纯水。
1.2实验方法
1.2.1标准溶液配制
分别称取适量标准物质，用乙腈或乙腈水(1：1)溶解并用乙腈定容(苏丹红ⅳ用丙酮溶解，用乙腈定容)，配制成100mg/l的单标储备液，再将其配制成10mg/l的混合标准溶液，使用前逐级稀释。
1.2.2样品制备
取有代表性样品200g，粉碎均匀，装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。
1.2.3前处理
称取均匀试样2.00g置于50ml离心管中，加入3ml水、15ml乙腈混匀，加入1.5g无水醋酸钠，立即摇匀，再涡旋震荡2min，以10000r/min离心5min，温度为3-5℃，取上清液过6g无水硫酸镁，滤液于40℃下旋转蒸发浓缩至干，加入2.0ml乙腈+0.1％甲酸水(95:5,v:v)溶解残渣，溶液全部转移到10ml离心管中，以4000r/min离心2min，过0.22μm滤膜，待测定。
1.2.4液相色谱串联质谱条件
(1)液相色谱条件
色谱柱：sb-c18rrhd1.8μm，2.1mm×50mm(agilent公司)；柱温：35℃；进样量：2μl。流动相：a为甲醇，b为0.1％甲酸水，梯度洗脱程序：0-4min，5％a，流速0.2ml/min；4.5-7min，60％-95％a，流速0.3ml/min-0.4ml/min；7.1-11min，95％a，流速0.5ml/min；11.5-15min，5％a，流速0.2ml/min。
(2)质谱条件
离子源：电喷雾离子源(esi)，酸性橙ⅱ采用负离子模式，其余均采用正离子模式，正负离子同时采集；离子源温度550℃，气帘气35psi，雾化气55psi，加热辅助气55psi，碰撞气：medium，离子源喷雾电压5500(-4500)v；扫描方式：多反应监测(mrm)，具体质谱参数见表1。
表15种罂粟壳生物碱和6种工业染料质谱参数
*定量离子(quantitativeion)
结果与分析
2.1色谱柱及流动相优化
试验了c8,c18,hillic等不同类型的色谱柱，相同流动相条件下，hillic柱的峰形整体较差，碱性橙ⅱ、碱性黄1、苏丹红ⅳ严重拖尾；而c8柱上碱性黄1、苏丹红ⅳ的峰形对称性不好，信噪比比c18柱的要低1/2以上；c18柱中以sb-c18rrhd1.8μm2.1mm×50mm为最佳，对除吗啡外的所有目标物保留均较好，分离效果也较好，灵敏度最高，各标准物质的多反应监测(mrm)色谱图见图1-图11，保留时间见表3。流动相考察了甲醇：0.1％甲酸水、和乙腈：20mmol/l乙酸铵(ph4.5)[7]，发现两种条件下峰形及分离效果相差无几，但前者的灵敏度更高，故选择甲醇：0.1％甲酸水作为流动相。由于苏丹红ⅳ在c18柱上有较强的保留，为让它更快洗脱下来，在其他化合物流出后流速增加到0.5ml/min并保持4min；在洗脱苏丹红ⅳ时间段，比较了100％甲醇和甲醇：0.1％甲酸水(95：5，v:v)两种方式，发现后者的灵敏度高出将近1倍，故在苏丹红ⅳ出峰时间内保留这样的比例。
2.2前处理条件优化
2.2.1提取试剂选择
如果选择水性含量高的提取剂如1％三氯乙酸(或0.1mol/l盐酸)：乙腈(8：2，v:v)，需采用正己烷脱脂，而经试验采用正己烷脱脂会使苏丹红ⅳ损失80％以上，因为苏丹红ⅳ更易溶于正己烷中；而选择乙腈含量高的溶液(乙腈占80％以上)，则基本解决了油脂的困扰问题，经离心后乙腈层与油层分离彻底，提取效果也较好。
2.2.2溶解残渣溶液选择
采用了乙腈、甲醇分别与水(或0.1％甲酸水)不同比例的搭配作为溶解残渣的溶液，结果以乙腈+0.1％甲酸水(95:5,v:v)的效果最佳。
2.2.3净化条件选择
首先考虑了quechers中采用的c18、psa，试验发现c18、psa能吸附杂质，但也吸附罂粟壳生物碱和色素，特别是对色素的吸附比较明显，用酸性橙ⅱ阳性样品作比较，在同样试验条件下，在最后的样液中采用150mgc18、60mgpsa进行净化和不净化各做三个样品的试验，结果是净化组的峰面积平均比没有净化的降低了20％以上，显然采用c18、psa作为净化会降低回收率。
再者，采用pcx、mcx、hlb等spe小柱进行净化试验，但也都没有取得理想的效果。pcx小柱对大部分色素有较好的保留，5ml5％氨水甲醇洗脱后，再用3ml丙酮与二氯甲烷(1:1)洗脱，仍能洗下相当比例的罂粟碱、那可丁、蒂巴因、苏丹红ⅳ、罗丹明b、碱性橙ⅱ、碱性黄1，但碱性嫩黄o却一直没能洗脱下来，其回收率几乎为0；采用hlb小柱，罗丹明b、碱性橙ⅱ的回收率不足30％；采用mcx小柱是酸性橙ⅱ难以保留，回收率不足25％，而苏丹红ⅳ、罗丹明b与小柱结合太紧难以洗脱。
综上，以上净化步骤不适用本试验方法。
2.2.4基质效应考察
分别用空白样品的样液和流动相作为稀释液，配制相同浓度的标准工作曲线进行测定，考察了同浓度不同基体的化合物的离子响应值，分析样液的基质效应，采用的公式为：me＝b/a，其中a和b分别表示目标物在流动相和空白基质溶液中的峰面积，若me＜1，说明基质会抑制目标物的响应；me＞1，则说明基质对目标物的响应有增强作用；me＝1表示不存在基质效应[16]，但一般认为me值在0.85-1.15是不存在基质效应。测得的5种罂粟壳生物碱和6种工业染料在不同基体中的基质效应见表2，由于吗啡出峰较早，基质抑制较为明显，但总体来说，基质效应并不特别严重，通过用空白基质配制标准工作曲线，保持标液和样液具有相同的离子化条件，可基本消除基质效应，不影响分析结果的准确性、稳定性。说明本试验方法虽没有采取进一步净化的步骤，也是可行的。
表2不同浓度的5种罂粟壳生物碱和6种工业染料在不同空白样品基质中的基质效应
2.3方法的线性范围及检出限
2.3.1标准工作曲线及相关系数
混合火锅底料、火锅食品、糖醋荔枝肉、炝肉等4种不同的空白样品提取液作为标准物质的稀释溶液，配制出系列质量浓度为1.0，2.5，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0μg/l基质标准工作溶液，按试验方法测定，绘制标准曲线。线性回归方程和相关系数见表3。
2.3.2检出限
在空白样品中添加标准物质进行测定，选取信噪比为3的添加量作为为检出限，方法检出限罂粟碱、那可丁、蒂巴因、罗丹明b、酸性橙ⅱ、碱性嫩黄o、碱性黄1为1.0μg/kg，吗啡、可待因、碱性橙ⅱ、苏丹红ⅳ为2.5μg/kg。
2.4回收率和精密度实验
在空白的火锅底料、火锅食品、糖醋荔枝肉、炝肉等样品中，分别添加3个不同浓度水平的混合标准溶液，每个添加水平重复测定6次，以基质标准工作曲线定量，计算平均回收率及精密度。测得平均回收率为72.2％～108％，相对标准偏差为2.5～9.6％，具体结果见表4。
表3线性范围、线性回归方程、相关系数和检出限
表4不同样品中添加回收率实验(n＝6)
2.5实际样品测定
采用以上试验方法，检测了30份采购自莆田市区的具有当地特色的炝肉、荔枝肉(糖醋、干炸)、炝粉、扁肉、糕点、蜜饯及火锅底料、火锅食品等样品，共检出酸性橙ⅱ阳性样品3个，含量为0.0159～74.2mg/kg。
本发明采用乙腈溶液提取目标物，超高效液相色谱串联质谱仪测定，前处理不需采用spe小柱净化，简捷快速，且灵敏度高、准确度和精密度好，其中罂粟壳生物碱检出限优于db31/2010-2012《火锅食品中罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因的测定液相色谱串联质谱法》中的检出限(其罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因的检出限分别是8μg/kg、40μg/kg、8μg/kg、40μg/kg、8μg/kg)，碱性橙ⅱ、碱性嫩黄o的检出限也优于dbs22/006-2012《食品中酸性橙、碱性橙ⅱ和碱性嫩黄o的测定液相色谱串联质谱法》(其碱性橙ⅱ和碱性嫩黄o检出限均为5.0μg/kg)，是同时检测小吃类食品和火锅底料中的罂粟壳生物碱和工业染料的有效方法。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。