一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的制作方法

本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。

背景技术：

高密度脂蛋白胆固醇（hdl-cholesterol；hdl-ch）是指高密度脂蛋白分子所携的胆固醇，是逆向转运的内源性胆固醇酯，将其运入肝脏，再清除出血液。高密度脂蛋白含有人胆固醇总量的20%～30%。高密度脂蛋白胆固醇可通俗地理解为“好”胆固醇，抗动脉粥样硬化的胆固醇，因为hdl-c可减少患冠状动脉心脏病的危险。

高密度脂蛋白胆固醇是由载脂蛋白、磷脂、胆固醇和少量脂肪酸组成。

人血清或血浆中高密度脂蛋白胆固醇参考范围为0.77～2.25mmol/l。增高：最主要的临床价值是能够将动脉粥样硬化斑块的泡沫细胞转移至肝脏排出体外。接受雌激素、胰岛素或某些药物（如烟酸、维生素e、肝素等）治疗者，亦可增高，虾青素可显著提升人类高密度脂蛋白胆固醇。降低：常见于脑血管病、冠心病、高甘油三酯血症、肝功能损害如急慢性肝炎、肝硬化、肝癌、糖尿病、吸烟、缺少运动等其降低可作为冠心病的危险指标。经常吃素易引发高浓度脂蛋白胆固醇降低，进而引发中风等。

高密度脂蛋白胆固醇偏高的原因有：1、原发性高密度脂蛋白血症，会出现高密度脂蛋白胆固醇偏高，此种情况需要及时治疗原发病。

2、高密度脂蛋白胆固醇偏高的原因还可能是体力劳动透支，注射雌激素、胰岛素，服用避孕药、烟酸、胰岛素、肝素、维生素ｅ等药物，这种情况下只需要适当休息，停止服用或是减量服用药物即可恢复正常。

3、胆汁淤积性肝硬化、慢性肝炎、肝硬化、酒精中毒性肝损伤、脂肪肝等疾病也可导致高密度脂蛋白胆固醇偏高。

胆固醇酯酶(cher)和胆固醇氧化酶(chod)经化学修饰后，与葡萄糖硫酸钠、硫化环状糊精复合物并用，使对ldl、vldl、乳糜微粒的酶反应性降低，只选择性与hdl-胆固醇发生作用。基于此原理，在第一步反应中使ldl、vldl、乳糜微粒与葡萄糖硫酸钠、硫化环状糊精复合物结合，在第二步反应中利用化学修饰的cher、chod，无须分离其他脂蛋白直接测定hdl-胆固醇。该方法是一种无需预处理样本、技术和设备要求不高、而精密度和特异性更高的分析方法。由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂中由于存在酶，会使该试剂的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成准确度差及浪费的不良后果。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒。该试剂盒与常规的试剂盒相比，稳定性好，准确度高，线性范围好，分析灵敏度高，有利于试剂在临床上的推广应用。

本发明是通过以下措施实现的：

一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，其特征在于，它包含试剂r1、试剂r2和校准品，其中试剂r1组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

4-氨基安替比林500μmol/l

tritonx-1000.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）间甲苯胺1mmol/l

葡萄糖硫酸钠0.5g/l

硫化环状糊精0.1g/l

试剂r2组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

胆固醇氧化酶500u/l

胆固醇酯酶800u/l

过氧化物酶30ku/l

4-甲酰苯基硼酸0.01%（w/v）

葡甘露聚糖0.5-1mg/ml

nacl5mmol/l

丙二醇20mg/ml

曲拉通1001%（v/v）

bsa0.1-1g/l。

所述试剂r1和试剂r2在使用时的体积比为r1：r2=3：1。

本发明的试剂盒在具有双试剂功能的自动生化分析仪上进行，其具体使用方法为：加入生理盐水、样本或校准品3μl，之后再加入r1试剂225μl预孵育5min后在546nm波长下读取吸光度a1，之后再加入75μl的试剂r2反应5min后，在546nm波长下读取吸光度a2，并计算δa。

本发明所使用的校准品为英国朗道公司生产的复合校准品。

本发明的有益效果：

本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，通过在试剂r2中加入了由4-甲酰苯基硼酸（4-fpba）、葡甘露聚糖、nacl、丙二醇、曲拉通100、bsa组成的复合稳定剂，各组分协同作用使试剂稳定性能优异，解决了酶长期保存不稳定这一难题，在试验中它能增加酶的稳定时间，而不会影响酶的活性，从而有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度和分析灵敏度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。

附图说明

图1实施例2准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图2实施例3准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图3实施例4准确度验证实验检测结果与对照组检测结果相关性；

图4实施例1-4试剂线性相关验证实验检测结果；

图5实施例1-4试剂稳定性验证实验检测结果。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步详细说明。

实施例1

市场上获得认可的一种准确度优异的高密度脂蛋白胆固醇试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

4-氨基安替比林500μmol/l

tritonx-1000.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）间甲苯胺1mmol/l

葡萄糖硫酸钠0.5g/l

硫化环状糊精0.1g/l

试剂r2组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

胆固醇氧化酶500u/l

胆固醇酯酶800u/l

过氧化物酶30ku/l。

本实施例描述的试剂盒，在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的东芝120自动分析仪，操作如下：

加入生理盐水、样本或校准品3μl，之后再加入r1试剂225μl预孵育5min后在546nm波长下读取吸光度a1，之后再加入75μl的试剂r2反应5min后，在546nm波长下读取吸光度a2，并计算δa。

本实施例所使用的校准品为英国朗道公司生产的复合校准品。

实施例2

一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

4-氨基安替比林500μmol/l

tritonx-1000.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）间甲苯胺1mmol/l

葡萄糖硫酸钠0.5g/l

硫化环状糊精0.1g/l

试剂r2组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

胆固醇氧化酶500u/l

胆固醇酯酶800u/l

过氧化物酶30ku/l

4-fpba0.01%（w/v）

葡甘露聚糖0.5mg/ml

nacl5mmol/l

丙二醇20mg/ml

曲拉通1001%（v/v）

bsa0.1g/l。

具体测定方法同实施例1。

实施例3

一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

4-氨基安替比林500μmol/l

tritonx-1000.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）间甲苯胺1mmol/l

葡萄糖硫酸钠0.5g/l

硫化环状糊精0.1g/l

试剂r2组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

胆固醇氧化酶500u/l

胆固醇酯酶800u/l

过氧化物酶30ku/l

4-fpba0.01%（w/v）

葡甘露聚糖0.8mg/ml

nacl5mmol/l

丙二醇20mg/ml

曲拉通1001%（v/v）

bsa0.5g/l。

具体测定方法同实施例1。

实施例4

一种高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，它包括试剂r1、试剂r2、校准品。

其中试剂r1组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

4-氨基安替比林500μmol/l

tritonx-1000.5%（v/v）

叠氮化钠0.5%（w/v）

n-乙基-n-（2-羟基-3-磺丙基）间甲苯胺1mmol/l

葡萄糖硫酸钠0.5g/l

硫化环状糊精0.1g/l

试剂r2组成为：

tris缓冲液(ph=7.0)100mmol/l

胆固醇氧化酶500u/l

胆固醇酯酶800u/l

过氧化物酶30ku/l

4-fpba0.01%（w/v）

葡甘露聚糖1mg/ml

nacl5mmol/l

丙二醇20mg/ml

曲拉通1001%（v/v）

bsa1g/l。

具体测定方法同实施例1。

对上述实施例1-4中制得的试剂盒分析性能进行实验验证。

准确度验证实验：

将实施例2、3、4的试剂盒作为实验组，实施例1试剂盒作为对照组进行对比实验，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。

通过图1-图3的检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与对照检测试剂盒的检测结果线性相关系数r分别为0.9965、0.9969、0.9970，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与市场上获得认可的具有优异准确度的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒有高度一致性，证明本发明试剂盒添加的其他各种成分对其准确性不会造成影响，试剂盒依然保持较好的准确度。

线性相关性验证实验：

取3mmol/l的高密度脂蛋白胆固醇高值样本，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为3mmol/l、2.4mmol/l、1.8mmol/l、1.2mmol/l、0.6mmol/l、0mmol/l浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如图4所示。

上述检测结果显示，实施例1-4检测结果相关性均大于0.990，但实施例2、3、4的检测结果大于0.999，与实施例1相比具有更好的线性相关性，这说明本发明试剂具有更好的线性相关性。

稳定性验证实验：

在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。检测数据如图5。

实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中通过加入复合稳定剂能够有效的提高高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒的稳定性。

综合以上分析，本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒，在试剂r2中通过加入复合稳定剂能够有效的提高试剂盒的稳定性，线性范围较好，试剂的准确度也较好。因此，本发明提供的高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。