±0.001 g/cm3)，并与分离液形成明显的界面。经800Xg离心20分钟后，小心吸取中间白色雾状的淋巴细胞层，RPM1-1640培养基洗涤两次，800g离心10分钟后，适量RPM1-1640培养基重悬，待后续试验使用。
[0019]外周血淋巴细胞P-gp基因表达:向提取所得的外周血淋巴细胞中加入ImLTrizol，用移液枪吹打至澄清且无细胞团块后，将其转移至无酶1.5mL EP管中，按照Takara总RNA提取试剂盒操作提取RNA，并进行RNA定量。按照RT-PCR试剂盒说明书，将 mRNA 逆转录为 cDNA。按照 Thermal Cycler DiceTM Real Time System (TakaRa Code:TP800)使用说明书要求进行PCR实验操作。定量PCR反应条件为:
[0020]Stagel:预变性:95°C，30sec
[0021]Stage2:PCR 反应:95°C，10 sec ；50°C,30 sec ；72°C,30sec ；40cycles
[0022]Stage3:融解曲线分析:95°C,15sec ;70°C，15sec.
[0023]小鼠mdrla及内参actin的基因序列如下:
[0024]Mouse-mdrla-F 5’ AGGGCATTTACTTCAAACTTGTC 3’，
[0025]Mouse-mdr I a_R 5’ CCTGTCTTGGTCATGTGGTC 3’，
[0026]Mouse-actin-F 5’ TCTGGCACCACACCTTCTA 3’，
[0027]Mouse-actin-R 5’ AGGCATACAGGGACAGCAC 3’。
[0028]外周血淋巴细胞P-gp功能考察:分别给予模型组/对照组提取所得外周血淋巴细胞5μΜ RH0123或10 μ g/ml CYSA，置37°C摇床中孵育2小时后，迅速吸出药物，用4°C空白Hank’ s溶液荡洗3次，加入ImL超纯水，置_80°C冰箱反复冻融三次破碎细胞。其中取0.1mL细胞悬液以考马斯亮蓝法定蛋白，其余细胞悬液置_20°C供测定用。
[0029]具体实例二 TNBS造模小鼠血浆中炎症因子(TNF-α，IL-β，IL-6，IL-17)及LPS水平显著升高
[0030]TNBS小鼠造模:如具体实例一所示
[0031]血浆炎症因子及LPS分泌水平检测:血浆中炎症因子的测定按照商业化ELISA试剂盒说明书进行(Excell，Shanghai，China)，血楽中LPS的测定按照商业化内毒素检测试剂盒说明书进行(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)。
[0032]具体实例三:炎症因子(TNF-α，IL-β，IL-6, IL-17)及LPS可诱导人源性巨噬细胞THP-1及人源性淋巴细胞CCRF-CEM外排转运体Ρ-gp基因表达升高
[0033]人源性巨噬细胞THP-1及人源性淋巴细胞CCRF-CEM接种于6孔板中，分别给予含不同浓度炎症因子及LPS的无血清RPM1-16402mL，37°C培养箱中孵育72小时后撤药，经40C Hank’ s洗涤3次后加入ImL Trizol试剂，吹打至澄清透明且无细胞团块后，进行逆转录及实时定量PCR实验，检测MDRl表达变化。具体操作方案见具体实例一。
[0034]人MDRl及内参ACTIN的基因序列如下:
[0035]Human-MDRl-F 5’ GCTGGGAAGATCGCTACTGA 3’，
[0036]Human-MDRl-R 5， GGTACCTGCAAACTCTGAGCA 3，，
[0037]Human-ACTIN-F 5， GCGTGACATTAAGGAGAAG 3'
[0038]Human-ACTIN-R 5， GAAGGAAGGCTGGAAGAG 3，。
[0039]具体实例四:IL_17可激活STAT3/Nf_ κ b途径，LPS,TNF- α可激活Ρ65磷酸化及核转位
[0040]人源性巨噬细胞THP-1培养于Τ-25型培养瓶中，给予50mg/ml TNF- α或2 μ g/mlLPSo分别于0，10，20，40，60，120min停止给药，PBS洗细胞一次后，1500rpm离心5min收集细胞。按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书(凯基生物，南京，中国)分别得到胞浆蛋白和核蛋白。Western Blot方法检测细胞核及胞浆p65及磷酸化P65表达水平。具体实验方案如下:
[0041]BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品按照体积比3: I加入4x上样缓冲液并煮沸1mino制备10%的SDS-PAGE，对样品进行电泳分离。电泳分离后，进行湿电转移，将蛋白转至PVDF膜。PVDF膜在含5%脱脂奶粉的TBST溶液中37°C封闭I小时候，4°C孵育一抗过夜，相应二抗37°C孵育I小时，ECL显影，B1-Rad凝胶成像仪成像。
[0042]人源性淋巴细胞CCRF-CEM培养于T-25型培养瓶中，给予50mg/ml TNF- α，或100mg/ml IL17，或 100mg/ml IL17 联用 10μΜ stat-3 磷酸化抑制剂 Stattic。分别于 0，20，40，60，120，480min停止给药，PBS洗细胞一次后，1500rpm离心5min收集细胞。按照核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒说明书分别得到胞浆蛋白和核蛋白。Western Blot方法检测细胞核和胞楽P65，stat3及磷酸化stat3表达水平。具体实验方案同上。
[0043]具体实例五:抑制单核细胞P-gp可逆转IBD天然耐药现象
[0044]为模拟IBD病人体内外周血淋巴细胞的生理状态，通过炎症因子刺激或转染使THP-1细胞或CCRF-CEM细胞高表达P-gp。人源性巨噬细胞THP-1给予2 μ g/ml LPS 24h后，单给P-gp特异性底物RH0123或联用P-gp特异性抑制剂LY335975，验证炎症刺激后，THP-1外排转运体表达升高，P-gp外排功能增强。人源性淋巴细胞CCRF-CEM通过转染形成P-gp稳定高表达的CCRF-CEM-MDR1细胞株。通过PCR实验、流式检测、RH0123摄取实验从基因、蛋白、功能三个方面确证CCRF-CEM-MDR1细胞株可模拟IBD病人外周血单核细胞。单独给予LPS诱导的THP-1和高转P-gp的CCRF-CEM-MDR1细胞株CYSA(10 μ g/ml)或同时联用P-gP特异性抑制剂LY3359752h后，LC-MS/MS测定细胞内环孢素CYSA的累积水平，具体操作见实例一。
【主权项】
1.TNBS造模IBD小鼠外周血淋巴细胞p-gp表达量升高，胞内药物浓度降低，存在天然耐药现象。
2.炎症因子(TNF-α，IL-β，IL_6，IL-17)及LPS 可通过 STAT3/Nf-κ b 途径，诱导外周血淋巴细胞外排转运体P-gp表达升高。
3.P-gp特异性抑制剂可逆转天然耐药现象。
4.外周血淋巴细胞P-gp表达量可作为IBD病人天然耐药的评估指标以及P-gp抑制剂在逆转天然耐药的应用。
【专利摘要】一种炎性肠病状态下药物敏感性的新检测指标及其在药物治疗方案设计中的应用。本发明涉及药物代谢动力学、药理学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，创新性地揭示了炎性肠病的天然耐药现象并阐明了相关机制。本发明公开了炎性肠病小鼠体内过度分泌的细胞因子TNF-a、IL17及LPS通过STAT3/Nf-κb途径，促进STAT3磷酸化，进而诱导P65磷酸化及核转位促进外周血单核细胞P-gp表达，降低胞内免疫抑制剂的药物浓度，抑制其治疗效果，从而造成天然耐药的产生，而给予P-gp特异性抑制剂可以逆转这一耐药现象。本发明提示外周血淋巴细胞P-gp表达量可作为IBD病人天然耐药的评估指标，且联用P-gp抑制剂可能可以逆转天然耐药造成的药效降低，为优化IBD治疗方案提供了新思路。
【IPC分类】A61P1-04, A61P1-00, A61K45-00, G01N33-68
【公开号】CN104535774
【申请号】CN201510027753
【发明人】王广基, 张经纬, 刘嘉莉, 周芳, 陈倩莹
【申请人】中国药科大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月16日