葡萄酒中吡唑类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质谱检测方法
【技术领域】
[oocn] 本发明属于食品检测领域，涉及固相萃取-气相色谱-串联质谱法（GC-MS/M巧，具 体是指一种葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5种化哇 类杀菌剂的检测方法。
【背景技术】
[0002] 葡萄酒生产主要原料的葡萄在田间管理过程中，为防止病虫害发生，通常会喷施 一定量的农药，有些农药在葡萄酒生产发酵过程中不易去除分解，会不同程度地残留在葡 萄酒中，给饮用者健康带来潜在的危害。
[0003] 杀菌剂是用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类低毒农药，主要指杀 真菌剂。目前，化哇类化合物因其具有高效、低毒W及化哇环上取代基可多方位变换等优 势，已成为新型杀菌剂开发的热点之一。该些杀菌剂具有特殊的作用方式，并有多种生物活 性。例如，哇菌胺醋（Pyraclostrobin)为甲氧基丙帰酸醋类线粒体电子传递抑制剂，显示 了对许多植物真菌广泛的抑制作用。而巧化菌胺（化rametpyr)，属于玻巧酸脱氨酶抑制剂 (SDHI)，可W抑制真菌呼吸的复合II玻巧酸脱氨酶。近些年来，多种化哇类杀菌剂被越来 越广泛地应用于农业生产中的植物病害控制，如谷物，蔬菜和水果等。
[0004] 因此，食品产品中出现杀菌剂残留物并不意外。该些化哇类杀菌剂虽然对环境相 对友好，但若在农产品中使用不当，会造成其在食品中的高残留问题，威胁人体健康。因此， 建立准确、可靠地测定葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等 5种化哇类杀菌剂的含量非常重要。
[0005] 分析方法可分为定性分析、定量分析和定性定量分析技术。定量分析一般采用色 谱技术和色谱质谱联用技术，色谱技术有气相色谱和气相色谱等方法，色谱质谱联用技术 有气相色谱-质谱联用和气相色谱-质谱联用等方法；定性定量分析则要兼具两种技术为 一体，检测结果要同时提供目标物的结构信息和数量信息，根据欧盟委员会非强制执行法 案2002/657/EC的规定，对禁用药物进行确证检测的方法必须能提供结构方面的信息，且 要达到该法案规定的4个确证点。
[0006] 目前，由于国内外无相关标准或文献可循，因此，有必要对葡萄酒尤其是葡萄酒中 的戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5种化哇类杀菌剂的检测方 法进行研究，从而对葡萄酒中化哇类杀菌剂进行监测，同时为国内葡萄酒企业出口到欧盟 等地区时，能出具符合欧盟委员会非强制执行法案2002/657/EC的规定的检测数据。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种葡萄酒中化哇类杀菌剂的固相萃取-气相色谱-串联质 谱检测方法，该方法结合固相萃取-气相色谱-串联质谱法，能够对葡萄酒中戊苯化菌胺、 氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺等5种化哇类杀菌剂同时进行测定，该方法具 有准确、快速、灵敏度高的优点，为葡萄酒的快速检测提供了可靠的分析方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明的技术方案是包括W下步骤： (一)待测样品的制备：称取4. 7-5. 3g葡萄酒样品，葡萄酒中加入超纯水，混匀后得到待 检液； 仁）待测样品的净化：将固定相萃取柱进行预处理，将步骤(一）制备的待检液上萃取 柱，经水和甲醇/水溶液淋洗除去杂质，再用洗脱溶剂洗脱固定相萃取柱上的戊苯化菌胺、 氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺得到洗脱液，将洗脱液浓缩富集后，用甲醇溶剂 稀释并经0. 22 y m微孔滤膜过滤后得到待测样品溶液； (H)待测样品的检测：配制戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺溶 液阶梯浓度的混合标准工作溶液（1.0，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 ng/mL)，将步骤 (二）中的待测样品溶液和混合标准工作溶液在气相色谱-串联质谱仪上分别进样，获得W 标准溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的浓度为横坐标，再W 混合标准工作溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的峰面积为 纵坐标的工作曲线，还有获得可W确定母离子的戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、口比 咪哇、巧化菌胺的一级质谱图，确定母离子后，采用子离子扫描获得二级质谱图，然后从二 级质谱图中选取定量离子和定性离子，然后用工作曲线对定量离子进行定量计算获得待测 样品溶液中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌胺的浓度。
[0009] 进一步设置是所述步骤(二)中的固定相萃取柱为Waters Oasis HLB S阳柱，并通 过甲醇、水对Waters Oasis HLB S阳柱进行活化处理。
[0010] 进一步设置是所述步骤(二）中的淋洗溶剂为水和体积比为2/3的甲醇水混合溶 液，洗脱溶剂为甲醇。
[0011] 进一步设置是所述的步骤(H)中气相色谱和串联质谱的参数条件如下： 色谱柱；SGE 公司 BPX35 ;30 mXO. 25 mmXO. 25 y m 流速；1. Oml/min高纯氮 仪器；Agilent 7890A-7000B 碰撞气；高纯氮；1. 5ml/min，巧灭流量；2. 25ml/min高纯氮 升温程序；50°C (Imin) -290°C (8min) 40°C /min 多模式进样口（匪I) ;5(TC (0. Imin) -300°C ;600°C /min 1分钟打开分流阀，流量60ml/min 离子化；El源。
[0012] 本发明的的原理和优点： 采用上述方案，首先，本发明通过加入超纯水对葡萄酒样品进行稀释， 其次，本发明还对由超纯水稀释得到的待检液进行净化处理，该净化处理包括纯化和 富集的过程。第一步纯化：先将待检液通过固相萃取小柱，依次经过经水和甲醇/水溶液淋 洗、甲醇洗脱；第二步富集；将第一步中纯化的待检液氮气浓缩近干，然后加入甲醇溶液溶 解、经0. 22 y m微孔滤膜过滤，得到净化的待检液。该净化后的待检液则不会对检测仪器造 成污染。本发明中固相萃取的SPE柱为Waters Oasis HLB SPE柱，由于5种化哇类杀菌剂 和其他杂质的极性大小存在差异，在固相萃取柱上吸附产生保留差异，然后通过优选的淋 洗条件和洗脱条件，达到净化富集香料的目的。
[0013] 再次，本发明对于葡萄酒中戊苯化菌胺、氣哇菌醜胺、化哇蔡菌胺、化咪哇、巧化菌 胺等5种化哇类杀菌剂成分的定性定量检测分析是通过气相色谱-串联质谱仪（GC-MS/M巧 分析。先配置一组阶梯形的标准工作溶液，然后将标准工作液和待检液在气相色谱-串联 质谱仪上分别进样。待检液中出现的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致，允许偏差小于 ±2. 5 %，该色谱峰所对应的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的标准工作溶液的相对 丰度一致，而且相对丰度偏差不超过规定，则可确定该待检液中含有化哇类杀菌剂。
[0014] 下面结合说明书附图和【具体实施方式】对本发明做进一步介绍。
【附