每个纳米颗粒通过遗传 修饰表面均匀连接M个生物素，所述M > 12,且M为整数；通过调整所述生物素化的纳米颗 粒与亲和素修饰的酶的比例得到酶纳米复合物。
[0031] 优选的，当生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比大于I :M时，复 合物形成多聚体，当比例小于等于I :M时，复合物为单体。
[0032] 优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表 面均匀连接24个生物素，生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为 1 :20 ~30。
[0033] 优选的，所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1 : 20~23. 5。得到的酶-铁蛋白纳米复合物为多聚体，且通过调整两者之间的比例，酶-铁 蛋白纳米复合物尺寸可控、均匀，能够负载更多的酶分子，进一步提高检测灵敏度。更为优 选的，所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1 :20或1 :22或 I ：23. 5〇
[0034] 优选的，所述每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素包括：
[0035] 通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide, BAP)得到融合蛋白基因，将所述融合蛋白基因克隆入表达载体；
[0036] 将生物素蛋白连接酶（Biotin-protein ligase, BirA)克隆入共表达载体中； [0037] 将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱 导表白蛋白和生物素；
[0038] 经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
[0039] 优选的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，铁蛋白包括24个相同或同源的 亚基；更为优选的，铁蛋白为重组人重链铁蛋白（recombinant human heavy-chain ferritin, rHF)〇
[0040] 优选的，通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合连接多肽之后再融合生 物素接受多肽得到融合蛋白基因。减少可能存在的位阻的影响，保持生物素接受多肽远离 纳米颗粒的表面。
[0041] 优选的，所述表达载体和所述共表达载体为质粒载体，所述表达宿主选自大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。更为优 选的，所述表达载体为ρΕΤ-28、ρΕΤ-32、ρΕΤ-15或ρΕΤ-11，所述共表达载体为pCDFDuel-1， 所述表达宿主为大肠杆菌。
[0042] 优选的，所述克隆通过链式酶聚合反应（PCR)完成。
[0043] 优选的，将生物素蛋白连接酶（BirA)克隆入共表达载体中具体包括：获取BirA基 因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分别加入限制性内切酶NcoI和Sail的酶切 位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA和表达载体p⑶FDuel-I进行双酶切反应， 收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和p⑶FDuel-I载体按物质的量比以6 :1进行连 接反应，得到 BirA-pCDFDuel-1。
[0044] 优选的，将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后 加入诱导表白蛋白和生物素具体包括：将表达载体和共表达载体加入含有表达宿主和抗生 素的培养基中培养过夜，直至活化至对数生长期，加入IPTG诱导表白蛋白和生物素过夜， 进行培养和表达。
[0045] 优选的，经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒具体包括：收集表达后的产物进 行超声破粹，收集上清液，水浴反应后离心，收集上清液利用蔗糖密度梯度离心或凝胶排阻 层析收集纳米颗粒。
[0046] 优选的，所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶或碱性磷酸酶。
[0047] 进一步的，本发明还提供一种用于免疫分析的试剂盒，所述试剂盒包括生物素化 的纳米颗粒以及亲和素修饰的酶，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形 成的球形纳米颗粒,每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M > 12,且 M为整数。在使用时，将生物素化的蛋白纳米颗粒和亲和素修饰的酶按一定的比例进行混 合，即可制得不同尺寸的ENC。试剂盒中也可包括预制好的ENC试剂，在免疫反应中无需混 合直接使用即可。优选的，所述酶可为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶。优选 的，所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24 个生物素。
[0048] 此外，本发明还提供一种酶纳米复合物在免疫分析中的应用。
[0049] 本发明有益效果：
[0050] 1、灵敏度高。酶纳米复合物（enzyme nan〇-composite，ENC)通过可控自组装整合 了大量的酶分子，相较于传统的酶联免疫法，其检测灵敏度提高了 1000~10000倍。
[0051] 2、可控性好。通过本发明制备方法制得的ENC在不同比例下具有不同的聚集状 态，所含有的酶分子数量在一定范围内稳定，从而使批次间的稳定性提高，批次内的可定量 性好。
[0052] 3、方法简单、成本低。基于ENC的高灵敏ELISA是在现有的商业化试剂中添加一 种试剂即可达到，可自己添加，也可制备出预制试剂，灵活方便。相比化学发光和电化学检 测，不需要专用的仪器设备和人员培训，并达到化学发光和电化学放光方法的灵敏度。
【附图说明】
[0053] 图1生物素化铁蛋白纳米颗粒制备的示意图。
[0054] 图2生物素化纳米颗粒的电子显微镜表征。
[0055] 图3生物素化纳米颗粒的动态光散射表征尺寸。
[0056] 图4western blot测定生物素化纳米颗粒与SA-HRP的结合能力。
[0057] 图5生物素化纳米颗粒的生物素化效率。
[0058] 图6ENC的可控制备。a、在SA-HRP饱和与过饱和的情况下ENC形成含有一个 BAP-rHF纳米颗粒的单体；b、二聚体的形成；c、BAP-rHF纳米颗粒需要与相邻颗粒共享两个 SA-HRP时，所形成的三聚体、四聚体；d、基于ENC的超灵敏ELISA示意图。
[0059] 图7不同组装比例的ENC的电子显微镜表征。
[0060] 图8间接ELISA检测抗HIV p24抗体的血清模拟样品。
[0061] 图9夹心ELISA检测cTnl模拟样品。
[0062] 图10基于ENC的cTnl实际样品检测（a)与使用传统ELISA方法的比较（b)。左 边为17个确认发生AMI的病人样品，右边为健康人样品检测结果。
【具体实施方式】
[0063] 本发明【具体实施方式】、实施例中"遗传修饰"指的是通过分子生物学技术对生物 体的基因组进行遗传修饰，所得到的基因组成和性状改变。"铁蛋白纳米"为由24个相同 或同源的亚基构成的具有空腔结构的球形蛋白纳米颗粒。此外，小铁蛋白为由12个相同 或同源的亚基构成的具有空腔结构的球形蛋白纳米颗粒。"亲和素"包括但不限于亲和素 (Avidin)、链酶亲和素 （Streptomyces avidin)。"生物素接受多肤"（biotin accepted p印tide，BAP)为能够与铁蛋白N端融合且能够连接生物素的多肽。"生物素蛋白连接 酶"(Biotin-protein ligase, BirA)是指能够活化生物素并将生物素连接到生物素受体蛋 白上的酶。
[0064] 本发明【具体实施方式】、实施例中缩写ENC可代表酶纳米复合物、酶-铁蛋白纳米复 合物、SA-HRP和BAP-rHF结合产物，具体所代表的含义依据上下文理解。
[0065] 本发明【具体实施方式】、实施例中缩写BAP-rHF可代表修饰/未修饰生物素的 BAP-rHF、BAP-Linker-rHF，具体所代表的含义依据上下文理解。
[0066] 实施例1
[0067] 一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外 层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球 形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M > 12,且M为整 数。
[0068] 酶纳米复合物通过可控自组装制备，具体为通过遗传修饰制备生物素化的纳米颗 粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述纳米颗粒为由M个相同 或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接 M个生物素，所述M > 12,且M为整数；通过调整所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的 酶的比例得到酶纳米复合物。在一个具体的实施方式中，当生物素化的纳米颗粒与亲和素 修饰的酶按物质的量比大