)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0152] 11)每孔加入200yL的TMB显色液，37°C显色10分钟。显色结束,每孔加入50yL 的硫酸终止液（2M)，在酶标仪上（Bio-Synergy HI)测定450nm的光吸收值。
[0153] 由附图8结果显示，使用了 ENC的抗p24抗体检测相对使用传统酶标抗体的检测 灵敏度提高了 1，〇〇〇倍以上。
[0154] 下面结合附图9对基于ENC的cTnl标准品和临床样品的检测5做进一步阐述。
[0155] 1)将cTnl抗体捕获抗体（购自Hytest，产品编号19C7)用包被缓冲液（碳酸盐 缓冲液）稀释为5 μ g/mL，以100 μ L/孔加入到96微孔板中（购自Corning)，4°C过夜。
[0156] 2)甩去包被液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0157] 3)每孔加入320 μ L的5%的脱脂牛奶（PBS溶解），于恒温混匀仪上37°C封阻2 小时。
[0158] 4)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0159] 5)将cTnl标准品（购自Hytest，产品编号8RTI7)梯度稀释于无 cTnl血清（购 自Hytest，产品编号8TFS)，样品浓度为1 μ g/mL到lpg/ml，于恒温混匀仪上37°C反应2小 时。
[0160] 6)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0161] 7)每孔加入IOOyL的1:1000稀释的生物素化cTnl抗体识别抗体（抗体购自 Hytets，产品编号16A11，生物素化试剂盒购自Dojindo)，于恒温混匀仪上37°C反应1小时。
[0162] 8)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0163] 9)每孔加入100 μ L预先制备的ENC (组装比例1 :20~23. 5)，于恒温混匀仪上 37°C反应1小时。
[0164] 10)甩去反应液，用PBST (320 μ L/孔）洗3次，每次在恒温混匀仪上振荡2分钟。
[0165] 11)每孔加入200 μ L的TMB显色液（购自Sigma)，37°C显色lOmin。显色结束，每 孔加入50 μ L的硫酸终止液（2M)，在酶标仪上（Bio-Synergy Hl)测定450nm的光吸收值。
[0166] 由附图9结果显示基于ENC的cTnl检测灵敏度相对传统方法提高了 10, 000倍以 上。
[0167] 下面结合附图10对cTnl的实际样品检测做进一步阐述。
[0168] 为了测试基于ENC的方法在实际样品中的可靠性，将ENC用于发生AMI病人 的血清检测cTnl。首先通过对40份健康人血清的检测，确定ENC方法检测的截断值 (cut-offvalue)。然后将基于ENC的免疫分析方法（检测结果参见附图10-a)用于17份 病人血清和17份健康人血清混合样品的测试，检测方法同上述夹心ELISA的方法步骤，作 为对照，传统的ELISA方法（检测结果参见附图10-b)同时进行。由附图10结果表明基于 ENC的方法检出了所有病人血清，而传统方法则有四份未检出，有两份难以判断。这说明基 于ENC的免疫分析方法是可以适用于临床样品的，且相对于传统方法具备更高的检测灵敏 度和准确性。
[0169] 本领域技术人员知晓，本发明具体实施例中免疫反应中所使用的参数例如清洗 液、时间、温度、试剂使用量、浓度并不用于限制本发明的保护范围，其可以依据试验需求进 行合理选择。本领域技术人员知晓，本发明具体实施例中ENC组装比例的数值可以依据具 体试验的需求作微调，并不局限于实施例中所列举的具体数值。
[0170] 本领域技术人员知晓，本发明中酶纳米复合物可以应用于以治疗为目的或非治疗 为目的检测中。
【主权项】
1. 一种酶纳米复合物，其特征在于：包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物 素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自 组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述 M彡12,且M为整数。
2. 如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述纳米颗粒为蛋白纳米颗粒。
3. 如权利要求2所述的复合物，其特征在于：所述蛋白纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，其 中每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。
4. 如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述复合物为单体，所述单体表面修饰有 24个酶分子。
5. 如权利要求3所述的复合物，其特征在于：所述复合物为多聚体，所述多聚体为二聚 体至十聚体。
6. 如权利要求1所述的复合物，其特征在于：所述酶为辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶 或碱性磷酸酶。
7. 如权利要求1-6任一项所述的复合物，其特征在于：所述每个纳米颗粒通过遗传修 饰表面均匀连接M个生物素包括： 通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N末端融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因， 将所述融合蛋白基因克隆入表达载体； 将生物素蛋白连接酶克隆入共表达载体中； 将所述表达载体、共表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表 白蛋白和生物素； 经破碎、纯化后制得生物素化的纳米颗粒。
8. 如权利要求7所述的复合物，其特征在于：通过分子克隆在所述纳米颗粒亚基的N 末端融合连接多肽之后再融合生物素接受多肽得到融合蛋白基因。
9. 如权利要求7所述的复合物，其特征在于：所述表达载体和所述共表达载体为质粒 载体，所述表达宿主选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕 赤酵母或哺乳动物细胞。
10. 如权利要求9所述的复合物，其特征在于：所述表达载体为pET-28、pET-32、pET-15 或pET-11，所述共表达载体为p⑶FDuel-1，所述表达宿主为大肠杆菌。
11. 如权利要求7所述的复合物，其特征在于：所述克隆通过链式酶聚合反应完成。
12. -种如权利要求1-11任一项所述复合物的可控自组装方法，其特征在于：通过遗 传修饰制备生物素化的纳米颗粒，将所述生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其 中，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米 颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M > 12,且M为整数；通过调整所述生物 素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶的比例得到酶纳米复合物。
13. 如权利要求要求12所述的方法，其特征在于：所述纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒，每 个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素，生物素化的铁蛋白纳米颗粒 与亲和素修饰的酶按物质的量比为1 :20~30。
14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于：所述生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和 素修饰的酶按物质的量比为1 :20~23. 5。
15. -种用于免疫分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如权利要求1-11任一 项所述的酶纳米复合物。
16. -种用于免疫分析的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括生物素化的纳米颗粒 以及亲和素修饰的酶，所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳 米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M > 12,且M为整数。
17. -种如权利要求1-11任一项所述的酶纳米复合物在免疫分析中的应用。
【专利摘要】本发明提供一种酶纳米复合物，包括位于核心层的纳米颗粒，位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶；其中所述纳米颗粒为由M个相同或同源的亚基通过自组装形成的球形纳米颗粒，每个纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接M个生物素，所述M≥12，且M为整数。此外，本发明还提供一种酶纳米复合物可控自组装方法，通过本发明方法制备得到的酶纳米复合物酶分子数量可控、均一，且通过调整组装比例，可以得到具有不同酶分子数量的酶纳米复合物；进一步的，本发明中酶-铁蛋白纳米复合物可用于免疫分析，信号稳定、重现性好、操作方便且灵敏度高。
【IPC分类】C12N15-63, C12N15-62, G01N33-543
【公开号】CN104655833
【申请号】CN201510097440
【发明人】门冬, 张治平, 张先恩, 张婷婷, 侯利伟
【申请人】中国科学院武汉病毒研究所
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月5日