于I :M时，复合物形成多聚体，当比例小于等于I :M时，复合物为 单体。
[0069] 本领域技术人员知晓，在实际使用中，由于试剂浓度测量的准确性以及其它客观 条件（如系统误差、分子的具体差异等）的限制，生物素化的纳米颗粒与亲和素修饰的酶之 间的比例可以根据实际需求进行微调，并不局限于上述实施例中具体数值。
[0070] 本发明实施例中酶纳米复合物（简称ENC)中所含有的酶分子数量可通过以下公 式进行简略计算：
[0071] X = nXM-i Xn/2
[0072] 其中，X代表ENC中酶分子的数量，M代表纳米颗粒的亚基数目，η代表ENC中所整 合的生物素化的蛋白纳米颗粒（简称NP)的数量，i代表每个NP与相邻颗粒共享的亲和素 修饰的酶分子的数量。
[0073] 在一个具体的实施方式中，纳米颗粒可为蛋白纳米颗粒或病毒纳米颗粒，在本发 明一个具体实施例中，以包含24个相同或同源的铁蛋白纳米颗粒为例进行阐述。
[0074] 当纳米颗粒为铁蛋白纳米颗粒时，酶纳米复合物记为酶-铁蛋白纳米复合物，其 包括位于核心层的铁蛋白纳米颗粒、位于中间层的生物素及位于外层的亲和素修饰的酶； 其中，每个铁蛋白纳米颗粒通过遗传修饰表面均匀连接24个生物素。
[0075] 酶-铁蛋白纳米复合物的制备方法为：通过遗传修饰制备生物素化的铁蛋白纳米 颗粒，将生物素化的铁蛋白纳米颗粒与亲和素修饰的酶混合，其中，所述生物素化的铁蛋白 纳米颗粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为1 :20~30。
[0076] 在本发明实施例中，首先制备出一个表面均匀修饰生物素（Biotin)的纳米颗粒， 然后加入亲和素修饰的酶分子，亲和素修饰的酶分子与生物素化纳米颗粒结合形成酶-纳 米颗粒复合物。如何均匀的在纳米颗粒表面修饰生物素以及控制酶与纳米颗粒之间的比例 是制备尺寸可控、均匀的酶纳米复合物的关键。
[0077] 本发明一个具体实施例中，利用铁蛋白能够自组装成尺寸可控的纳米颗粒，并基 于遗传修饰的方法，在铁蛋白的24条亚基上修饰生物素，使每个铁蛋白颗粒表面均匀连接 24个生物素，得到均匀修饰生物素的纳米颗粒。本领域技术人员知晓，纳米颗粒不限于铁蛋 白纳米颗粒，其它与铁蛋白类似的能够进行遗传修饰和可控自组装的球形蛋白纳米或病毒 纳米颗粒也可适用于本发明酶-纳米可控自组装方法。
[0078] 本发明经过大量的研究发现，当亲和素修饰酶分子的数量多于生物素时，就会形 成酶分子包裹的纳米颗粒；当亲和素修饰的酶分子的数量少于生物素数量时，纳米颗粒间 会共用亲和素，从而发生纳米颗粒间的聚集，继而形成更大尺寸的ENC，控制两者间的比例 可以得到可控大小的ENC，进而得到具备不同酶分子的复合物。当生物素化的铁蛋白纳米颗 粒与亲和素修饰的酶按物质的量比为I :20~30,能够得到均一、稳定的单体ENC和多聚体 ENC。
[0079] 实施例2
[0080] 下面结合附图1-5对本发明生物素化铁蛋白纳米颗粒的制备作进一步阐述。
[0081] 1、生物素化铁蛋白的基因克隆：如附图1所示，通过分子克隆在重组人重链铁蛋 白（由中科院武汉病毒所分子识别与纳米生物传感学科组保藏，其核苷酸序列和蛋白序列 参见序列表 SEQ ID No. 1 和 SEQ IDNo. 2) (recombinant human heavy-chain ferritin, 简称rHF)的N末端融合生物素接受多肽（biotin accepted peptide,简称BAP,其核苷 酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4)及柔性连接多肽（Linker p印tide，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ IDNo. 5和SEQ ID No. 6)形成融合蛋白 BAP-Linker-rHF (简称BAP-rHF，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8)。该融合蛋白中，BAP标签可以在大肠杆菌生物素蛋白连接酶（Biotin-protein ligase(EC 6. 3. 4. 15)，BirA，其核苷酸序列和蛋白序列参见序列表SEQ ID No. 9和SEQ ID No. 10)的作用下被生物素化；Linker peptide的作用是保持BAP标签远离铁蛋白纳米颗粒 的表面，减少可能存在的空间位阻的影响；rHF的作用是通过自身的自组装形成纳米颗粒 将生物素化的BAP标签集成在其表面，最终得到的生物素化纳米颗粒表面均匀分布24个生 物素分子。
[0082] 2、生物素化铁蛋白的表达、纯化：融合蛋白的基因被克隆入表达载体pET-28 (购 自Merck公司）中，得到pET28-BAP-rHF。同时克隆生物素蛋白连接酶BirA到共表达载体 pCDFDuet-Ι (购自Merck公司）中，得到pCDFDuet-BirA。将两个载体共转化入表达宿主 大肠杆菌表达菌株BL21 (由中科院武汉病毒研究所分子识别与纳米生物传感学科组保藏） 中，采用卡那霉素、链霉素双抗平板挑取阳性克隆，并培养过夜。然后二次活化至对数生长 期（0D值在0.4-0. 5之间），加入终浓度为ImM的IPTG诱导表达蛋白，同时加入生物素（工 作终浓度50 μ M)，培养过夜。5000 X g离心8分钟收集菌体，弃上清，使用组织缓冲液（30mM Tris，150mM NaCl)重悬菌体。超声破碎菌体后再次10000 Xg离心30分钟，去除细胞碎片。 取上清60°C恒温热处理40分钟，1000 OXg离心30分钟，去除沉淀的杂蛋白。取上清进行 鹿糖密度梯度离心（38, OOOrpm离心4小时）和/或凝胶排阻层析（Sephrose 6B，GE)分离 并收集自生物素化铁蛋白纳米颗粒。
[0083] 本领域技术人员知晓，本发明上述【具体实施方式】中蛋白的表达与纯化中具体参数 (例如浓度、时间、温度等）数值并不用于限制本发明，本领域技术人员可以依据实际需求 作调整。
[0084] 对收集到的铁蛋白纳米颗粒，采用电子显微镜进行表征，由本发明附图2表征图 可知，采用本发明方法制备出的生物素化纳米粒子粒径均匀，发现有大量的笼形结构颗粒。 通过测量600个颗粒，统计所得到的颗粒直径为13. 65±0· 65nm，Bar = 100nm。
[0085] 对收集到的铁蛋白纳米颗粒，进行动态光散射表征其尺寸，参见附图3,显示其具 有良好的单分散性，其水和半径为15. 6nm。
[0086] 采用western blot测定生物素化纳米颗粒与辣根过氧化物酶标记的链酶亲和素 (SA-HRP)的结合能力，从而验证纳米颗粒生物素化，结果如附图4所示，ΒΑΡ-rHF所在的条 带有明显的显色，其他条带则无明显显色，表明ΒΑΡ-rHF被生物素化。
[0087] 采用质谱测定生物素化纳米颗粒的生物素化效率，结果如附图5所示，根据其分 子量分析，自生物素化铁蛋白亚基的分子量为23932. 0与理论预测值23935. 51基本一致， 表明每个铁蛋白亚基都被修饰且仅被一个生物素分子修饰。
[0088] 在一个具体的实施方式中，克隆通过链式酶聚合反应（PCR)完成的。将BirA克 隆入p⑶FDuet-I具体包括：获取BirA基因的核苷酸序列，设计引物，在上、下游引物中分 别加入限制性内切酶NcoI和Sail的酶切位点，通过PCR扩增BirA基因；将PCR产物BirA 和表达载体pCDFDuel-Ι进行双酶切反应，收集酶切产物；将收集到的酶切产物BirA和 pCDFDuel-Ι载体按物质的量比以6 :1进行连接反应，得到BirA-pCDFDuel-1。
[0089] 在一个具体的实施方式中，表达载体可为质粒载体，包括但不限于pET-28、 pET-32、pET-15或pET-11质粒载体等；表达宿主还可为枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状 杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞等能够进行蛋白表达的宿主。
[0090] 实施例3
[0091] 下面结合附图6-7对本发明酶-铁蛋白纳米复合物的可控制备作进一步阐述。
[0092] 酶-铁蛋白纳米复合物（以下简称ENC)的制备原理：铁蛋白会组装成24个亚基 组成的纳米颗粒，通过在其N端融合BAP标签，可以形成表面均匀分布24个BAP标签的纳 米颗粒。在生物素蛋白连接酶BirA的作用下，BAP会被生物素化，这样每个融合BAP-rHF会 被且仅被一个生物素修饰，最终得到的融合蛋白BAP-rHF纳米颗粒表面会均匀修饰24个生 物素分子。
[0093] 将BAP-rHF纳米颗粒与亲和素修饰的酶（本发明实施例中亲和素具体为链酶亲和 素，酶为辣根过氧化物酶，记为SA-HRP)混合，通过生物素与亲和素的结合，SA-HRP可以结 合在BAP-rHF纳米颗粒的表面。
[0094] 如