一种基于dna-金纳米粒子构建网状结构修饰电极的方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及基于DNA-金纳米粒子构建网状结构 修饰电极的方法及其应用，可以实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测。
【背景技术】
[0002] 近年来，诸多研究表明DNA甲基化在基因表达调控、发育调节、基因组印迹等方面 发挥重要作用，与某些肿瘤和遗传病的发生密切相关。随着胚胎学和肿瘤学基础研究的迅 速发展，DNA甲基化作为基因表遗传学的重要机制之一，受到越来越多的关注。
[0003] 对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，大致可以分为两类：一类是从DNA甲基 转移酶的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究；后者又分为总体DNA甲基化水 平和特异基因序列DNA甲基化水平的检测。
[0004] 已有研究表明，胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键，其 与印迹的清除和重建、x染色体的失活、种系分化等等都有密切关系。而肿瘤的发生可能与 抑癌基因启动子CpG岛发生甲基化，进而导致抑癌基因关闭有关。
[0005] 因此，有关DNA甲基化的研究已成为当前胚胎发育学和肿瘤发生学的研究热点， 能够实现对DNA甲基转移酶活性的灵敏检测是首先应该解决的问题。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修 饰电极的方法，使用柠檬酸钠还原法合成了金纳米粒子（AuNPs)，利用DNA序列之间碱基 的互补配对作用，构建了一个网状结构的DNA-金纳米，通过二硫苏糖醇连接电极和网状结 构，利用亚甲基蓝可以插入双链DNA作为点信号分子进行检测，制备出DNA-金纳米粒子构 建网状结构修饰电极。
[0007] 本发明还提供了一种基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修饰电极的应用，实现 了对DNA转甲基酶的灵敏性、特异性、稳定性的检测。
[0008] 本发明提供的一种基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修饰电极的方法，包括以 下步骤：
[0009] (1)、将2. 50D的DNAS1、DNAS2序列分别溶解在缓冲溶液中，得到DNAS1缓冲溶 液和DNAS2缓冲溶液；
[0010] (2)、将DNAS1缓冲溶液和DNAS2缓冲溶液分别加入到金纳米粒子溶液中，培养， 分别制备成DNAS1-金纳米粒子溶液和DNAS2-金纳米粒子溶液；
[0011] (3)、将步骤⑵得到的DNAS1-金纳米粒子溶液和DNAS2-金纳米粒子溶液混合， 杂交，得到DNA-金纳米粒子网状结构的溶液；
[0012] (4)、将抛光处理后的金电极浸入含有二硫苏糖醇的Tris-HCl缓冲溶液中，取出， 清洗，得到修饰了二硫苏糖醇的金电极；
[0013](5)、将步骤（4)得到的修饰了二硫苏糖醇的金电极浸入DNA-金纳米粒子网状结 构的溶液，培养，得到基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修饰电极。
[0014] 具体的，步骤（1)为将购买的分别为2. 50D的DNAS1、DNAS2序列分别溶解在 Tris-HCl缓冲溶液中分别得到浓度为100yM的DNAS1缓冲溶液和浓度为100yMDNAS2 缓冲溶液，在4°C下保存备用；
[0015]进一步的，步骤（1)中DNAS1 :SH-GTCTGATCCCTGTGTA，DNA S2:SH-CAGACTAGGGACACCA；
[0016] 进一步的，步骤（1)中缓冲溶液Tris-HCl的pH为7. 4,浓度为0? 1M。
[0017] 具体的，步骤（2)为：将 15yL100yMDNAS1 缓冲溶液和 15yL100yMDNAS2 缓冲溶液分别加入到500yL金纳米粒子溶液中，培养，分别制备成DNAS1-金纳米粒子溶 液和DNAS2-金纳米粒子溶液；
[0018] 进一步的，步骤（2)中，所述培养，具体是：在20~50°C下培养10h。
[0019] 步骤（2)中金纳米粒子的制备：利用柠檬酸钠还原法，先合成出尺寸均匀的 AuNPs，此纳米颗粒具有很好的生物兼容性，能结合多条设计好的探针，因此将制备的纳米 颗粒应用于生物传感器的检测具有很好的放大作用。
[0020] 步骤⑵中金纳米粒子的制备的方法具体为：100mL的圆底烧瓶中加入50mL的超 纯水，加入0. 5mL，1 %氯金酸水溶液到圆底烧瓶中，使得溶液中氯金酸的浓度降到0. 01 % (w/v)，将此溶液在油浴中加热恒温于92±4°C。在磁子的剧烈搅拌下，迅速加入一定量的事 先配制好的柠檬酸三钠溶液（1%)，继续搅拌。最后溶液变成澄清的橙红色溶液，就制得了 16nm左右的金纳米溶液。
[0021] 进一步的，步骤（3)中所述杂交具体是：在37°C下杂交2h。
[0022] 进一步的，步骤（3)中，DNAS1-金纳米粒子溶液和DNAS2-金纳米粒子溶液混合 的体积比为1 :1。
[0023] 进一步的，步骤（4)中，抛光处理后的金电极浸入含有二硫苏糖醇的缓冲溶液中 12h后取出，用Tris-HCl缓冲溶液清洗；二硫苏糖醇在Tris-HCl缓冲溶液中的浓度为2mM。
[0024] 进一步的，步骤（4)中，所述抛光处理后的金电极是指：金电极先依次用0.3和 0. 5mm的铝粉进行抛光处理，再依次放入体积比HN03:H20 = 1:1溶液、乙醇溶液、超纯水中， 进行超声波清洗，超声清洗的时间分别为3~5min。
[0025] 进一步的，步骤（5)中所述培养，具体是：在20~50°C下培养10h。
[0026] 本发明提供的一种基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修饰电极的应用，对DNA转 甲基酶的检测的应用。
[0027] -种基于DNA-金纳米粒子构建网状结构修饰电极的应用方法为：
[0028] a、将修饰电极浸入含有DamMTase(甲基转移酶）和S-腺苷基甲硫氨酸的 Tris-HCl缓冲溶液中37°C培养0. 5-3h，得到甲基化的DNA-金纳米网状结构的电极；
[0029] b、将甲基化的DNA-金纳米网状结构的电极浸入到含有Mbo的Tris-HCl缓冲溶液 中；
[0030] c、将步骤b处理后的电极浸入到含有亚甲蓝的Tris-HCl缓冲溶液中，进行差示脉 冲伏安法检测。
[0031] 进一步的，步骤a中，Tri s-HCl缓冲溶液含有Dam Mtase的浓度分别为0， 0? 05, 0? 75, 2. 5, 5, 10, 20, 30, 40U/mL，s-腺苷基甲硫氨酸的浓度均为 32mM。
[0032] 进一步的，步骤b具体为：将甲基化的DNA-金纳米网状结构浸入到含有40U/mL的 Mbo的Tris-HCl缓冲溶液中，37°C浸入2h。
[0033] 进一步的，步骤c具体为：电极浸入到10mL含有20yM亚甲蓝的Tris-HCl缓冲溶 液中，在37°C培养15min，进行差示脉冲伏安法检测。
[0034] 本实验中所用缓冲溶液的pH为5-9,最优的pH为7. 4。
[0035] 由于亚甲蓝分子可以吸附到双链DNA中，所以在构建好的修饰电极浸入10mL含有 20iiM亚甲蓝的Tris-HCl缓冲溶液中，亚甲蓝作为信号分子，用差示伏安脉冲法进行检测。 亚甲基蓝的信号强度与双链DNA量相关，也就与DNA甲基转移酶的浓度有关。随着DNA甲 基转移酶浓度的增加，差示伏安脉冲法的峰强度即亚甲基蓝的信号强度会随之增加，因此， 此修饰电极可对不同浓度DNA甲基转移酶进行定量检测。
[0036] 本生物传感器的制备方法，使用金纳米粒子合成简单，耗能低，成本低，生物相容 性好，将DNA，金纳米粒子进行偶联，进而利用DNA碱基互补配对原则构建成一个DNA-金纳 米粒子网状结构，因此插入更多的具有电化学活性的亚甲基蓝信号分子，从而使得电化学 检测信号得到放大。利用亚甲基蓝产生的差示脉冲伏安法强度信号，构建与DNA转甲基酶 浓度的线性关系，实现对DNA甲基化行为的检测。因此对DNA转甲基酶的检测具有灵敏度 高、检测限低、选择性好、稳定性好的特点。
【附图说明】
[0037] 图1为基于DNA-金纳米粒子网状结构放大作用检测DNA甲基转移酶活性的修饰 电极的制备不意图；
[0038] 图2A为金纳米粒子的扫描电子显微镜表征图；
[0039] 图2B为DNA-金纳米粒子网状结构的扫描电子显微镜表征图；
[0040] 图2C为紫外可见吸收光谱图；
[0041] a为金纳米粒子的紫外可见吸收光谱图；
[0042] b为DNA-金纳米粒子网状结构的紫外可见吸收光谱图；
[0043] 图3A为修饰电极各步骤的循环伏安图；
[0044] a为裸金电极；<