5.5)中，在-0.2 ?1.2V的电位区间内循环伏安扫描30圈，扫描速度为50mV/s，所制备的聚合膜经化学修饰作用沉积固定于玻碳电极表面。由于金霉素(CTC)分子中含有酚羟基、烯醇基和二甲氨基。而选用邻氨基酚(OAP)作为功能单体，其结构中存在的羟基也可作为潜在的配位位点，不仅OAP的氨基与CTC的酚羟基、烯醇基可发生分子间氢键相互作用，而且OAP的羟基与CTC的二甲氨基之间亦可发生作用，因此OAP与CTC之间有较多的结合位点，使得所制备的分子印迹聚合物对金霉素具有极高的选择性和结合能力。而随着扫描圈数的增加，电极表面逐渐覆盖一层致密的非导电聚合膜，阻止了 OAP的进一步氧化，使得伏安电流响应受到抑制，由此便制得非导电性的印迹膜电极(CTC-MIP-0AP/GCE)。
[0029](3)模板分子的洗脱:采用上述步骤⑵制备的CTC-MIP-0AP/GCE，将其置入体积比为1: 4的甲醇/硫酸溶液中洗脱24h后，可得到具有能够与金霉素相匹配的识别位点的印迹膜电极(MIP-P0AP/GCE)，即金霉素分子印迹敏感膜传感器。目前，金霉素分子印迹敏感膜传感器的研究尚未报道，本发明是首次采用以OAP为功能单体，CTC为模板分子，利用电聚合方式构建了一种可间接地通过电化学技术来测定金霉素的分子印迹敏感膜传感器。
[0030]2、电化学响应及标准曲线绘制
[0031]本发明中采用差分脉冲伏安法来表征印迹膜电极(MIP-P0AP/GCE)在5mM铁氰化钾溶液中的特性。通过印迹膜电极吸附金霉素前后铁氰化钾差分脉冲峰电流的变化(A I)，计算出差分脉冲峰电流减少量与盐酸金霉素溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线，进而可间接测得盐酸金霉素的含量。
[0032]检测结果如下:
[0033]1、分子印迹电聚合
[0034]图1-1为模版分子CTC的存在下玻碳电极上OAP电聚合过程中的CV曲线。由CV曲线可见，OAP的电化学聚合是一个不可逆的过程。从扫描的第二圈开始，电流便出现明显的骤降，并随着CV扫描圈数的增多，电流缓慢下降至背景值，这表明了电极表面上逐渐覆盖并形成了致密的非导电聚合膜，阻止了 OAP的进一步氧化，使得伏安电流响应受到抑制。而图1-2为不加入CTC的OAP电聚合的CV曲线，与图1-1相比并无显著差异，这表明CTC的存在不干扰OAP的电聚合，CTC结构也没有发生改变。
[0035]2、分子印迹效应
[0036]采用CV及DPV法来表征裸电极(GCE)、印迹膜电极(MIP-P0AP/GCE)、经洗脱再吸附CTC的印迹膜电极(CTCad-MIP-POAP/GCE)及非印迹膜电极(P0AP/GCE)在含5mMK3[Fe (CN)6]的10mM KCl PBS (pH 6.4)中的特性。由DPV法表征的曲线(图2-1)可知，a有较高的还原峰电流出现，说明探针离子Fe (CN)6 3在GCE表面发生了电化学反应，从而产生了电流。而d相较于极a，几乎没有还原峰出现，这是由于覆盖于电极上的不含CTC的POAP/GCE电极是非导电的，阻碍了 Fe(CN)6 3的扩散传递。b相对于d而言，还原峰值有了明显的大幅度提高，这是由于CTC-MIP-POAP/GCE膜经洗脱后所留有的印迹孔穴为[Fe(CN)6] 3提供了传质通道且发生了电化学反应。而c相较于b则出现峰值的下降，这则说明0.2 μΜ的CTC经印迹膜所留有的孔穴，被吸附至MIP-P0AP/GCE电极上，一部分印迹孔穴被吸附上的CTC所阻塞，使得[Fe(CN)6] 3传质通道减少。CV法与DPV法的表征结果相符合。
[0037]3、电聚合扫描圈数的优化
[0038]电聚合CV扫描的次数能够控制聚合膜的厚度。本实验采用分别聚合了 20、25、30及35圈数制得的MIP-P0AP/GCE膜电极在含5mM K3 [Fe (CN)6]和10mM KCl的PBS中进行DPV电化学响应的测定。通过比较不同聚合圈数制备的聚合膜电极在洗脱前后的DPV还原峰值差，从图3可得知，聚合圈数为30圈时，膜电极的电活性最佳。聚合圈数较少时会形成薄膜，不利于CTC的附着，进而印迹孔穴的形成也随之减少。而聚合圈数较高时，膜太厚，传感器的活化响应需较长的时间，对Fe(CN)6 3接近印迹孔穴的过程产生了一定的阻碍，同样使得电极响应值偏低且当聚合次数过高时，会有模板分子洗脱不掉的现象产生。
[0039]4、吸附时间对印迹膜检测金霉素的影响
[0040]响应时间是表征传感器性能的一个重要参数，将MIP-P0AP/GCE膜电极浸入一定浓度金霉素溶液中进行静置吸附，每隔2min取出，并用二次蒸馏水淋洗干净，在含5mMK3[Fe (CN)6]的10mM KCl PBS中用DPV法检测。结果表明，随着吸附时间的增加，印迹位点逐渐被金霉素分子所占据，峰电流逐渐下降，当吸附时间超过20min后，峰电流基本达到平衡。因此选择20min为最佳吸附时间。
[0041]5、印迹膜的选择性
[0042]选择四环素、土霉素、氯霉素及青霉素作为干扰物并采用DPV法来验证留有印迹孔穴的MIP-P0AP/GCE膜电极对CTC的选择性。分别测定了修饰膜印迹电极对含5、7.5、10、15,20,40和80 μΜ的盐酸金霉素及干扰物溶液的响应，并计算出相对峰电流变化率(Ai/i。)，其中，Ai为MIP-P0AP/GCE膜电极对各种物质响应前后的峰电流差值，i。为印迹膜经洗脱后的峰电流值。图4中，氯霉素和青霉素对盐酸金霉素几乎无干扰，土霉素和四环素产生了极微弱的电流响应。以上结果说明氯霉素及青霉素与CTC的结构差别较大，电化学响应信号变化极其微弱，而土霉素和四环素与CTC的结构相似，这使得有少量土霉素及四环素能够被吸附到印迹分子修饰电极的孔穴上，从而引起微弱的电化学响应，但对CTC并没有形成显著干扰，这说明印迹膜修饰电极与模板分子之间的作用不单是由与其互补的官能团所决定，立体结构互补所形成的印迹孔穴也产生了较大的影响。
[0043]6、印迹膜电极的电化学响应及标准曲线
[0044]应用DPV法，使该传感器对一定浓度金霉素吸附后在含5mM K3 [Fe (CN) 6]的10mMKClPBS(pH = 6.4，V= 1mL)中进行DPV测定。将MIP-P0AP/GCE膜电极在背景溶液中所测得的峰电流与吸附不同浓度CTC的CTCad-MIP-POAP/GCE膜电极所测得的峰电流值进行做差(Al)，并通过ΔΙ与CTC浓度的关系作图，从而得到关于CTC浓度的标准曲线(图5-2)。
[0045]7、印迹膜电极的重现性与稳定性
[0046]使用过的电极在洗脱溶液中超声清洗5min，并用二次蒸馏水淋洗后即可使电极基本能恢复到响应前的状态。因此使用同一支印迹膜电极对0.2 μΜ CTC平行测定5次，RSD为1.9%，显现出较好的重现性。将此印迹膜电极储存于4°C冰箱中，二周后在同等环境下对0.2μΜ CTC的响应值降至90.3%。经四周后，响应值降至82.7%。具有较佳的长期稳定性。
【主权项】
1.一种OAP-MIP多结合位点亲和膜金霉素传感器及其制备方法，其特征在于，它由玻碳电极及其表面固定着的对金霉素有特异性结合功能的分子印迹膜组成。2.权利要求1所述传感器，其特征在于，其表面的特异性亲和膜有OAP的氨基与CTC的酚羟基、烯醇基发生的分子间氢键作用，也有OAP的羟基与CTC的二甲氨基之间的作用，在电化学条件下OAP与CTC之间形成较多的结合位点，使得所制备的分子印迹聚合物对金霉素具有极高的选择性和结合能力。3.0AP-MIP多结合位点亲和膜电极的制备方法 将0.1g OAP溶于0.1M高氯酸中，并加入0.4M氢氧化钠将pH值调节为弱酸性(pH.5.5)，定容至250mL浓度为3.67mM，从中移取9mL已配好3.67mM OAP的NaClO4溶液，再向其中加入ImL ImM的金霉素(CTC)混合溶解。因聚合反应初期，氧气进攻自由基阳离子，则需通队除02约15min，将处理好的三电极系统浸入含3.67mM 0ΑΡ,0.1mM CTC与0.1M NaClO4溶液(pH 5.5)中，在-0.2?1.2V的电位区间内循环伏安扫描30圈，扫描速度为50mV/s，所制备的聚合膜经化学修饰作用沉积固定于玻碳电极表面。随着扫描圈数的增加，电极表面逐渐覆盖一层致密的非导电聚合膜，阻止了 OAP的进一步氧化，使得伏安电流响应受到抑制，由此便制得非导电性的印迹膜电极(CTC-MIP-0AP/GCE)。
【专利摘要】本发明涉及一种金霉素(CTC)分子印迹(MIP)亲和膜传感器及其制备方法。该特异性亲和膜的形成基于电聚合方法，是以CTC为模板分子、邻氨基酚(OAP)为功能单体运用电化学方法在玻碳电极表面行成分子印迹聚合膜。由于CTC中含有酚羟基、烯醇基和二甲氨基，而OAP结构中存在的羟基也可作为潜在的配位位点，不仅OAP的氨基与CTC的酚羟基、烯醇基可发生分子间氢键相互作用，而且OAP的羟基与CTC的二甲氨基之间亦可发生作用，因此OAP与CTC之间有较多的结合位点，使得所制备的分子印迹聚合物对金霉素具有极高的选择性和结合能力。该传感器可用于现场快速检测，不需要标本前处理，并且成本低，操作简单，灵敏度高。其检测线性范围可达到20-610nM，灵敏度为15nM。
【IPC分类】G01N27/48, G01N27/30
【公开号】CN105092671
【申请号】CN201410759072
【发明人】张娟琨, 高杨, 王伟, 刘英姿, 陶强
【申请人】天津科技大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2014年12月12日